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一種汞離子檢測方法及檢測裝置制造方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種汞離子檢測方法及檢測裝置，屬于環(huán)境生物【技術領域】。汞離子檢測方法包括以下步驟：在結合有merR1-GFP融合蛋白的Pmerr1-Omerr1-biotin雙鏈DNA體系中加入含汞離子溶液，靜置后取出溶液進行熒光強度測量，利用標準曲線計算溶液中汞離子含量。本發(fā)明的檢測方法具有以下優(yōu)點：（1）在取樣點即可進行樣品檢測，不需要將樣品長距離運輸至特定的檢測機構，不需要使用大型昂貴的儀器設備；檢測所需時間短，從開始取樣品到最后得到數(shù)據(jù)，30分鐘即可完成，尤其適用于大規(guī)模野外田間土壤樣品汞含量檢測，能夠大幅降低檢測所需的人力、物力；（2）該方法檢測的汞離子極限值為0.3μg/l，與冷原子光譜吸收分析法的極限值非常接近，準確度高。
【專利說明】一種汞離子檢測方法及檢測裝置

【技術領域】
[0001]本發(fā)明具體涉及一種汞離子檢測方法，以及實施該方法的檢測裝置，屬于環(huán)境生 物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 汞是一種毒性極強的重金屬，能夠引起人神經(jīng)中毒、視覺器官缺陷等，嚴重的能致 人死亡。進入人體的汞多通過食物渠道。食物中的汞主要來自供農(nóng)作物生長的土壤。國 內(nèi)多地土壤汞含量已經(jīng)達到警戒值。根據(jù)我國1的5年制定的土壤環(huán)境質(zhì)量標準(標準號： GB15618-1995)，1. Omg/kg是保障農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，維護人體健康的土壤限制值，l 5mg/kg是保障 農(nóng)林生產(chǎn)和植物正常生長的土壤臨界值。
[0003] 對土壤中的汞含量進行實時檢測對于保護人們身體健康、采取適當措施是非常重 要的。傳統(tǒng)的汞含量分析方法包括原子吸收光譜分析、原子熒光光譜分析、中子激活分析、 誘導稱合質(zhì)譜技術、高壓液相層析等。這些檢測方法費用高昂，設備體積龐大，對操作人員 技術要求高，樣品需要遠距離運送和前處理。而農(nóng)田野外檢測則需要攜帶方便、操作所需費 用低廉的檢測儀器。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種汞離子檢測方法。
[0005] 同時，本發(fā)明還提供一種專用于實施上述方法的檢測裝置。
[0006] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：
[0007] 一種汞離子檢測方法，包括以下步驟：在結合有merRl-GFP融合蛋白的 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA體系中加入含汞離子溶液，靜置后取出溶液進行熒光強度 測量，利用標準曲線計算溶液中汞離子含量。
[0008] 所述的merRl-GFP融合蛋白由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列編碼。
[0009] 所述merRl-GFP融合蛋白的制備包括以下步驟：
[0010] (1)以巨大芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用引物P1F、P1R擴增merRl基因，構建 質(zhì)粒P1 ;
[0011] (2)以質(zhì)粒P1為模板，利用引物P2F、P2R擴增兩端攜帶BamH I和EcoR I酶切位 點的merRl基因，構建質(zhì)粒P2 ;
[0012] (3)以質(zhì)粒pEGFP為模板，利用引物P3F、P3R擴增GFP基因，用EcoR I酶切GFP基 因和質(zhì)粒P2,連接后構建質(zhì)粒P3 ;
[0013] (4)以質(zhì)粒P3轉化大腸桿菌，取陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，IPTG誘導表達merRl-GFP 融合蛋白；
[0014] 引物P1F的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，引物HR的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，引物P2F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，引物P2R的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，引物P3F的核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示，引物P3R的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0015] 所述Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA中一個單鏈的3'端具有生物素突出端，該單 鏈的寡核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA能夠通過生物素 與鏈霉親和素結合。采用鏈霉親和素包被酶標板，再依次連入Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈 DNA和merRl-GFP融合蛋白，即可形成結合有merRl-GFP融合蛋白的Pmerrl-Omerrl-biotin 雙鏈DNA體系。
[0016] 所述Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA的制備方法包括以下步驟：將引物〇/ Pmerrl-F_biotin、0/Pmerrl-R-biotin分別溶于緩沖溶液中，等體積混合，在94°C變性2分 鐘，降至室溫得到Pmerrl-Omerrl雙鏈；引物O/Pmerrl-F-biotin的核苷酸序列如SEQ ID N0:ll所示，引物0/Pmerrl-R-biotin的核苷酸序列如SEQIDN0:12所不。
[0017] 若待檢測樣品為含汞土壤，需將土壤分散于水中，混勻后過濾，濾液即為含汞離子 溶液。
[0018] 所述的標準曲線為熒光強度-汞離子濃度曲線。
[0019] -種親離子檢測裝置，包括結合有merRl-GFP融合蛋白的Pmerrl-Omerrl-biotin 雙鏈DNA體系。
[0020] 具體的，體系中Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA通過生物素固定在鏈霉親 和素包被的酶標板上。（如鏈霉親和素包被的高親和力黑色酶標板，Thermo fisher scientific, Yokohama, Japan)上。在酶標板中加入含親尚子溶液靜置培育后，由 于汞離子能夠與merRl-GFP融合蛋白進行特異性結合，并將merRl-GFP融合蛋白從 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA上解離下來，且解離下來的merRl-GFP融合蛋白的量與 加入的汞離子的量呈正比，取培養(yǎng)后溶液進行熒光強度測量，利用熒光強度-汞離子濃度 標準曲線即可求得溶液中汞離子含量。檢測原理示意圖如圖2所示，圖2中I為向酶標 板中加入含萊離子溶液，II為萊離子與merRl-GFP融合蛋白結合，merRl-GFP融合蛋白從 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA上解離下來，III為將培養(yǎng)后溶液轉移出，檢測其突光強度。
[0021] 汞離子檢測裝置的制備方法包括以下步驟：將Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA置 于鏈霉親和素包被的酶標板小室內(nèi)，室溫下震蕩培養(yǎng)；再將merRl-GFP融合蛋白置于小室 內(nèi)，室溫下震蕩培養(yǎng)，即得。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] MerR是細菌中廣泛存在的一類金屬調(diào)控蛋白。對merR與DNA結合/解離的研究 絕大多數(shù)都是在革蘭氏陰性菌中進行的。在革蘭氏陰性細菌中，當merR與mer操縱子的啟 動子區(qū)域結合時，RNA聚合酶活性受到抑制，mer基因的轉錄停止。當Hg(II)與merR-Pmer 復合體中的merR結合時，merR-Pmer構象向下卷曲30度，merR-Pmer雙價核心發(fā)生扭曲變 形，RNA聚合酶與DNA結合，重新啟動轉錄。然而在體外，當merR與DNA結合后，向merR-DNA 復合體溶液中添加Hg(II)不能使merR從DNA上解離下來。革蘭氏陽性菌巨大芽孢桿菌細 胞內(nèi)有三個汞操縱子/啟動子區(qū)域，它們分別是〇/Pmerb3、Ο/Pmerrl和0/Pmerr2,這三個 區(qū)域受兩個merR蛋白質(zhì)調(diào)控，這兩個merR蛋白分別為merRl和merR2。研究發(fā)現(xiàn)，merRl 能夠與〇/Pmerrl結合，在對merR-DNA復合體溶液中添加不同濃度的Hg(II)后，蛋白質(zhì)條 帶向下移動，且向下移動的蛋白質(zhì)條帶的數(shù)量與在0/Pmeirl中添加汞離子的量呈正比。實 驗結果說明親離子能夠?qū)erRl從Pmerrl-Omerrl (Ο/Pmerrl)上解離下來，而且解離下來 的merRl的量與添加的Hg(II)的量呈正比。
[0024] 綠色熒光蛋白是一類功能極強的報告分子，能夠?qū)虮磉_、蛋白質(zhì)定位和蛋白 質(zhì)互作進行檢測。細菌轉錄調(diào)控中的反式因子和順式元素能夠在體外發(fā)生互作。將GFP連 接在反式因子的C末端構建融合基因，將這個過程與巨大芽孢桿菌merRl和Pmerr 1-Omerr 1 (0/Pmeirl)的結合/解離過程結合在一起，能夠開發(fā)出一種對汞離子進行原位檢測的裝 置。
[0025] 本發(fā)明中汞離子檢測方法具有以下優(yōu)點：
[0026] (1)在取樣點即可進行樣品檢測，不需要將樣品長距離運輸至特定的檢測機構，不 需要使用大型昂貴的儀器設備；檢測所需時間短，從開始取樣品到最后得到數(shù)據(jù)，30分鐘 即可完成，尤其適用于大規(guī)模野外田間土壤樣品汞含量檢測；對操作人員的專業(yè)技能幾乎 沒有要求，所用化學試劑均為普通常規(guī)化學試劑，該檢測方法能夠大幅降低檢測所需的人 力、物力；
[0027] (2)該方法檢測的汞離子極限值為0. 3 μ g/Ι，與冷原子光譜吸收分析法的極限值 非常接近，準確度高。
[0028] 本發(fā)明中汞離子檢測裝置使用后可以進行冷凍干燥，冷凍干燥后的檢測裝置保存 在4?條件下，下次使用時直接加入待測樣品即可，一次制備能夠多次反復使用，大大降低 了制備檢測裝置所需的費用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為本發(fā)明中汞離子檢測裝置的結構示意圖；
[0030] 圖2為本發(fā)明中汞離子檢測原理示意圖；
[0031] 圖3為實施例1中質(zhì)粒用BamH I和Xho I雙酶切后的電泳結果；
[0032] 圖4為實施例3中Pmerrl-Omerrl基因片段溶液中添加 meRl-GFP融合蛋白溶液 后的電泳結果；
[0033] 圖5為實施例3中向merRl-GFP/Pmerrl-〇merrl結合體系中添加不同濃度汞離子 的電泳結果；
[0034] 圖6為實施例3中融合蛋白與Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA反應不同時間的 熒光強度；
[0035] 圖7為實施例3中在汞離子檢測裝置中添加 HgCl2溶液后轉移溶液的熒光強度；
[0036] 圖8為實施例4中向merR卜GFP/Pmerr卜Omerrl結合體系中添加其他重金屬離子 的電泳結果；
[0037] 圖9為實施例4中在汞離子檢測裝置中添加不同重金屬離子溶液的熒光強度；
[0038] 圖10為實施例5中merRl-GFP粗蛋白與Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA反應不 同時間的熒光強度；
[0039] 圖11為實施例5中在粗蛋白制備的汞離子檢測裝置中添加 HgCl2溶液的熒光強 度；
[0040] 圖12為實施例5中在粗蛋白制備的汞離子檢測裝置中添加不同重金屬離子的熒 光強度；
[0041] 圖13為實施例6中汞離子檢測裝置經(jīng)冷凍干燥處理后對汞離子檢測的敏感性試 驗結果；
[0042] 圖14為實施例8中熒光強度-汞離子濃度標準曲線。

【具體實施方式】
[0043] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。
[0044] 實施例1
[0045] 本實施例中merRl-GFP融合基因的構建方法如下：
[0046] ( 1)構建質(zhì)粒p 1
[0047] 配制LB液體培養(yǎng)基，37°C條件下過夜培養(yǎng)巨大芽孢桿菌（Bacillus megate;rium) (購自上海北諾生物科技有限公司）。提取巨大芽孢桿菌基因組DNA，具體參照天根細菌基因 組DNA提取試劑盒說明書(貨號：DP302-02)。設計引物擴增merRl基因，引物序列如下：
[0048] P1F :5, -ATGAAATTTCGTATCGGAGAACTGGCTGAC-3'（如 SEQ ID N0:3 所示），
[0049] P1R :5, -TTATTTCTTCATCAGTGTTTCAATAATGGG-3，（如 SEQ ID N0:4 所示）；
[0050] PCR反應體系：2XPfu MasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司，貨號： CW0686A)25y 1，引物PlFlpmol，引物 PlRlpmol，H2022 y l，DNAly 1 ;
[0051] PCR反應程序：94°C，5min，（94t： 30s,55°C 30s，72°C lmin)40 個循環(huán)，72? lOmin。
[0052] 將擴增片段進行純化回收，用T4DNA連接酶將純化后的擴增片段連接到克隆載體 PMD19-T上，連接條件為4°C，24小時。用連接產(chǎn)物對感受態(tài)大腸桿菌DH10B進行轉化(具體 操作方法見《分子克隆實驗指南第三版上冊》91頁和92頁)，轉化后在含有?〇〇 μ g/mi氨芐 青霉素的LB平板上進行培養(yǎng)，挑取4個陽性克隆進行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoRV進行酶切， 酶切產(chǎn)物在〇· 8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，對酶切產(chǎn)物中含有一"t''約400bp片段的質(zhì)粒進 行測序，如果序列與已經(jīng)發(fā)表的序列（GenBank :ΑΒ〇66362· 1)完全一致，則把該質(zhì)粒命名為 pl〇
[0053] (2)構建質(zhì)粒p2
[0054] 以質(zhì)粒pi為模板，設計引物擴增兩端攜帶BamH I和EcoR I酶切位點的merRl基 因，引物序列如下：
[0055] P2F : 5，-CGCGGATCCATGAAATTTCGTATCGGAGAACTGGCTGAC-3，（如 SEQ ID N0:5 所示， 下劃線為Bam HI酶切位點)，
[0056] P2R :5 ' -CCGGAATTCTTTCTTCATCAGTGTTTCAATAATGGGGCA-3 ' (如 SEQ ID Ν0:6 所示， 下劃線為EcoR I酶切位點）；
[0057] PCR反應體系：2XPfu MasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司，貨號： CW0686A) 25 μ 1，引物 P2Flpmol，引物 P2Rlpmol，Η2022 μ 1，DNA1 μ 1 ;
[0058] PCR反應程序：94?，5η?η，（94? 30s，55°C 30s，72O lmin)40個循環(huán)，72? l〇min。
[0059]將擴增出來的片段進行瓊脂糖凝膠純化回收，然后用BamH I和EcoR I進行雙酶 切，對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠純化回收。同時用BamH I和EcoR I對質(zhì)粒pET28a進行雙 酶切，對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠純化回收。用T4DNA連接酶對酶切后的merRl基因和酶 切后的pET28a在4?條件下進行24小時連接。用連接產(chǎn)物對大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞 進行轉化(具體操作方法見《分子克隆實驗指南第三版上冊》91頁和92頁)。轉化后在含有 50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上進行培養(yǎng)，挑取4個陽性克隆進行液體培養(yǎng)，用普通質(zhì)粒小 提試劑盒（中科瑞泰，Cat N〇:RTP2102)提取質(zhì)粒；用BamH I和EcoR I對質(zhì)粒進行雙酶切， 酶切條件為37°C，2小時；酶切產(chǎn)物在0· 8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，對酶切產(chǎn)物中含有二 個約400bp片段的質(zhì)粒進行測序，測序后序列與預測序列（見SEQ ID NO: 14)完全一致的質(zhì) 粒命名為p2。
[0060] (3)構建質(zhì)粒p3
[0061] 37°C條件下，過夜培養(yǎng)含有質(zhì)粒pEGFP的大腸桿菌(購自上海北諾生物科技有限 公司），提取質(zhì)粒，設計引物擴增GFP基因，引物序列如下：
[0062] P3F: 5 ' -CCGGAATTCATGTCTAAAGGTGAAGAATTATTCACTGGT-3，（如 SEQ ID N0:7 所示， 下劃線為EcoR I酶切位點)，
[0063] P3R: 5 ' -CCGGAATTCTTATTTGTACAATTCATCCATACCATGGGT-3，（如 SEQ ID N0:8 所示， 下劃線為EcoR I酶切位點）；
[0064] PCR反應體系：2XPfu MasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司，貨號： CW0686A)25y 1，引物P3Flpmol，引物 P3Rlpmol，H2022u Ι,?ΝΑΙμ 1 ;
[0065] PCR 反應程序：94?，5η?η，（94? 30s，55O 30s，72-C lmin)40 個循環(huán)，72°C 10min。
[0066] 對擴增出的700bp片段用快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京康為世紀，Cat N〇:CW2302)進行純化回收，然后用EcoR I進行酶切，酶切條件為37°C，2小時。對質(zhì)粒P2 用EcoR I進行酶切，對酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠回收。用小牛腸堿性磷酸酶（TAKARA)對回 收后的質(zhì)粒p2進行去磷酸化處理。將酶切后的GFP和磷酸化處理的p2用T4DNA連接酶進 行4°C 24小時連接。用連接產(chǎn)物對大腸桿菌DH10B感受態(tài)細胞進行轉化(具體操作方法見 《分子克隆實驗指南第三版上冊》91頁和92頁)，轉化后在含有50 μ g/inl卡那霉素的LB平 板上進行培養(yǎng)。挑取5個陽性克隆進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，12小時。用普通質(zhì)粒小 提試劑盒（中科瑞泰，Cat No:RTP2102)提取質(zhì)粒，用EcoR I進行酶切，酶切條件為37。〇，2 小時。酶切產(chǎn)物在〇· 8%瓊脂糖凝膠中進行電泳，對酶切產(chǎn)物中含有一個700bp片段的質(zhì)粒 進行測序，測序后GFP基因序列（具體序列見SEQ ID N0:15)與已經(jīng)發(fā)表的序列（GenBank : KF04〇393. 1)完全一致而且GFP序列轉錄方向與上游基因相同的質(zhì)粒命名為p3。
[0067] (4)構建含質(zhì)粒P3的大腸桿菌
[0068] 提取p3質(zhì)粒，對大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞進行轉化(具體操作方法見《分 子克隆實驗指南第三版上冊》91頁和92頁)。轉化后在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB平板 上進行培養(yǎng)。挑取5個陽性克隆進行液體培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37°C，120rpm，12小時。用普通 質(zhì)粒小提試劑盒（中科瑞泰，Cat N〇:RTP2102)提取質(zhì)粒，用BamH I和Xho I進行雙酶切， 酶切條件為37°C，2小時。酶切產(chǎn)物在〇. 8%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，對酶切產(chǎn)物中含有 一個1. lkb片段的質(zhì)粒(見圖3,圖中L為DNA Marker，S為酶切片段電泳條帶，5. 4kb大片 段顯示的是質(zhì)粒載體pET28a，1. lkb小片段顯示的是融合蛋白基因 merRl-GFP)進行測序， 測序結果與SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列完全一致的質(zhì)粒確定為p3,含有P3質(zhì)粒的大腸桿 菌 BL21 (DE3)命名為 BL21-E。
[0069] 實施例2
[0070] 本實施例中merRl-GFP融合蛋白的提取純化方法如下：
[0071] 從LB平板上挑取一個BL21-E的單克隆，在含有5〇μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液中 進行37°C過夜培養(yǎng)。然后以1: 1〇〇的比例在4個各盛放有1升LB培養(yǎng)液的三角瓶中進行擴 大培養(yǎng)。在培養(yǎng)液〇D6。。增長到0. 6時，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0. 4_〇1/1的IPTG，繼續(xù)培 養(yǎng)4小時。對培養(yǎng)液以6〇〇〇rpm，4°C條件離心10分鐘。棄去上清液，用緩沖液A對細胞沉 淀沖洗兩次。緩沖液 A 的配方為 5〇mm〇l/l Tris_HCl，pH7· 5, 2mmo/12-mercaptoethanol，5% (v/v) glyCerol，0· 2mol/l (NH4)2S04。用50毫升緩沖液A對細胞沉淀進行懸浮。將細胞懸 浮液注入M-110EH微射流均質(zhì)機（Microfluidics, Newton, MA, USA)，在llOOOpsi的條件下 對細菌細胞進行裂解處理。處理后的均質(zhì)液體在16000rpm，4°C條件下離心1小時，將上清 液轉移到另一個千凈的三角瓶中，用孔徑為0. 45微米的濾膜進行過濾。用緩沖液B對層析 柱 heparin-sepharose column (Hiprep，Amersham Biosciences，Buckinghamshire, UK)進 行平衡，然后將過濾液注入平衡過的層析柱heparin-sepharose column。緩沖液B的配方 為 50mmol/l Tris-HCl，pH7_5,2mmo/12-mercaptoethanol，5% (v/v)glycerol。用 60 毫升 的緩沖液B對層析柱進行洗滌。然后用140毫升緩沖液C對結合在層析柱中的融合蛋白進 行洗脫。緩沖液 C 的配方為 50mmol/l Tris-HCl，pH7. 5,2mmo/12-mercaptoethanol，5%(v/ v) glycerol，（NH4)2S04 濃度梯度為 0· 2mol/l 到 lmol/1。對洗脫液進行 Tricine-SDS-PAGE (I8%)電泳，檢測純化的質(zhì)量。融合蛋白最佳洗脫的（NH4)2S0 4濃度在0· 7mol/l到0. 9mol/ 1之間。最后向產(chǎn)生的蛋白質(zhì)純化液中添加終濃度為50%的甘油，混勻后儲存在-80°C冰箱 中備用。
[0072] 實施例3
[0073] merRl-GFP融合蛋白對Ο/Pmerry的結合特性，融合蛋白對汞離子的結合特性，汞 禹子對merRl-GFP/Pmerrl-〇merrl復合體的結合特性研究：
[0074] (1) merRl-GFP 融合蛋白與 Pmerrl-Omerrl 的結合試驗
[0075]以巨大芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，合成引物如下：
[0076] 0/Pmerrl-F :5, -AGGGTAAGTAAAATCTCATGAATGAAGTAA-3，（如 SEQ ID N0:9 所示），
[0077] 0/Pmerr卜R :5，-TTCATCGCGATCGACAACCCCTAGCAATTT-3，（如 SEQ ID 船：10所示）；
[0078] PCR反應體系：2XPfu MasterMix (北京康為世紀生物科技有限公司，貨號： CW0686A)25uU^0/Pmerrl-Flpm〇UK|j0/Pmerrl-Rlpmol，H2022 yl，DNAlpl;
[0079] PCR反應程序：941,51^11,(941: 30s，55O 30s，72O lmin)40 個循環(huán)，72°C 10min。
[0080] PCR擴增獲得一個316bp的片段，該片段為Pmerrl-Omerrl。將該片段從DNA瓊脂 糖凝膠上回收下來。測序后與SEQ ID N0:13所示核苷酸序列完全相同后再進行以下實驗。
[0081] 配制凝膠遷移緩沖液，配方為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 5,50mmol/l KC1， 5%glycerol,50 μ g/ml bovine serum albumin,lmmol/1 cysteine,0. 05%Nonidet P-40〇 在DNA溶液中分別加入終濃度為1μηιο1/1、5μηιο1/1、10μηιο1/1的merRl-GFP融合蛋白， 以1:1的比例將混合液溶解在凝膠遷移緩沖液中，取5微升混合液，在41：條件下培養(yǎng)60分 鐘。配制凝膠上樣緩沖液，配方為 ：0_〇5%bromophenol blue，5〇%glycerol。取5微升反應 混合液與1微升上樣緩沖液混合。進行6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：亞甲雙丙 烯酰胺=29:1)電泳，電泳緩沖液為Tris-acetate緩沖液(無 EDTA)，其配方為：〇. 〇25mol/l Tris，0_ 25mol/l Glycine，0. l%(w/v)SDS，pH8. 0。在 4°C，200V 的條件下電泳 90 分鐘。電泳 以后用EB(ethidium bromide)對凝膠進行染色。結果顯示，添加 merRl-GFP融合蛋白的DNA 樣品的DNA條帶在凝膠上均出現(xiàn)上移現(xiàn)象(見圖4,圖中0顯示的是在Pmerri-〇merrl基因 片段溶液中不添加任何蛋白質(zhì)，1、5、10分別顯示的是在Pmerrl-Omerrl基因片段溶液中添 加 Ιμπιο?/l merRl-GFP 融合蛋白、5μπιο1/1 merRl-GFP 融合蛋白和 10um〇l/l merRl-GFP 融合蛋白，4°C條件下共培養(yǎng)60分鐘后的電泳結果)，說明merRl-GFP與praerrl-Omerrl發(fā) 生了結合，與merRl-GFP結合后的Pmerrl-Omerrl分子量變大，遷移速度變慢，在凝膠上呈 現(xiàn)出上移現(xiàn)象。
[0082] (2)汞離子使融合蛋白質(zhì)從DNA上解離下來的可能性試驗
[0083] 以巨大芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，合成引物如下：
[0084] O/Pmerr 1 -F : 5，-AGGGTAAGTAAAATCTCATGAATGAAGTM-3，，
[0085] Ο/Pmerrl-R :5, -TTCATCGCGATCGACAACCCCTAGCAATTT-3,；
[0086] PCR反應體系和程序同上，擴增獲得一個316bp的片段，該片段為Pmerrl-Omerrl, 將該片段從DNA瓊脂糖凝膠上回收下來。
[0087]配制凝膠遷移緩沖液，配方為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 5,50mmol/l KC1， 5%glycerol，50yg/ml bovine serum albumin, lmmol/1 cysteine，0.05%Nonidet P-40。在 DNA溶液中添加終濃度為5 μ mol/1的merRl-GFP融合蛋白，以1:1的體積比將混合液溶解 在凝膠遷移緩沖液中。取5微升反應混合液在4°C條件下培養(yǎng)60分鐘。然后在反應液體 中分別加入終濃度為1μπι 〇1/1、5μπι〇1/1、10μπι〇1/1的HgCl2。配制凝膠上樣緩沖液，配方 為：0· 05%bromophenol blue，50%glycerol。取5微升反應混合液與1微升上樣緩沖液混合。 進行6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰胺=29:1)電泳，電泳緩沖液為 Tris-acetate緩沖液(無 EDTA)，其配方為：0.025mol/l Tris，0.25mol/1 Glycine，0. l%(w/ v)SDS，pH8. 0。在4°C，200V的條件下電泳90分鐘。電泳以后用EB (ethidium bromide) 對凝膠進行染色。結果顯示，添加 HgCl2后進行電泳的反應混合液，其DNA條帶位置與沒 有結合merRl-GFP的DNA條帶位置相同（圖5,圖中1顯示的是在反應混合液中不添加汞 離子，2?6依次顯示的是向反應混合液中添加終濃度為1 μ mol/1、5μ mol/1、10 μ mol/1、 20 μ mol/l、30 μ mol/1的HgC12)，說明添加 HgCl2后，萊離子能夠?qū)erRl-GFP融合蛋白 從Pmerrl-Omerrl上解離下來，merRl-GFP融合蛋白從Pmerrl-Omerrl上解離下來以后， Pmerrl-Omerrl的分子量恢復到了以前的正常狀態(tài)，其在凝膠上的遷移速度又恢復到了以 前的正常狀態(tài)，電泳后其位置又回到了正常位置。
[0088] (3)融合蛋白與固定在固相表面DNA雙鏈的結合性試驗
[0089] 委托TAKARA公司，合成引物如下：
[0090] 0/Pmerrl-F-biotin:5,-TATATTTACCCTGTACTAAGGTACGTGGTTTATGCTGTAAGTG AGG-biotin-3'（其寡核苷酸序列如SEQ ID腸：11所不)，
[0091] O/Pmerr卜R_bi〇tin:5，-CCTCACTTACAGCATAAACCACGTACCTTAGTACAGGGTAA ATATA-3'（如 SEQ ID NO: 12 所示）；
[0092] 將寡核苷酸 0/Pmerrl-F-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris-HCl(pH7. 4)中，使其終 濃度為 100 l·1 mol/1，寡核苷酸 〇/Pmerrl-R-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris-HCl (pH7. 4) 中，使其終濃度為100 μ m〇l/l。兩者等體積混合，94?變性2分鐘，然后逐步降至室溫，形成 雙鏈Pmerrl-Omerrl-biotin,濃度為50 μ mol/1。這時形成的雙鏈DNA中一個單鏈的3'端 有一個生物素突出端，該生物素突出端用于下面的固定。
[0093] Pmerrl-Omerrl-biotin能夠通過生物素與鏈霉親和素之間的高親和力固定 在微孔板小室內(nèi)壁上。采用鏈霉親和素包被的高親和力黑色酶標板（Thermo fisher scientific, Yokohama, Japan)來固定寡核苷酸，用 25mmol/l 的 Tris-HCl (pH7. 4)沖洗酶 標板小室三次，將小室中的DNA全部洗掉除去。將Pmerrl-Omerrl-biotin溶解在25mmol/l 的 Tris-HCl (ρΗ7· 4)緩沖液中，Pmerrl-Omerrl-biotin 的終濃度為 〇· 25 μ mol/1。取 100 微升溶液放置在小室中。Pmerrl-Omerrl-biotin溶液在內(nèi)表面包被有鏈霉親和素的酶標板 小室中培養(yǎng)2小時，培養(yǎng)條件為26°C，120rpm搖晃。然后將小室內(nèi)的溶液除去，用200微升 25mmol/l的Tris-HCl (ρΗ7· 4)對小室沖洗三次，以除去小室中沒有固定的DNA，得到汞離 子檢測裝置，結構示意圖如圖1所示。
[0094] 取30微升merRl-GFP純化蛋白質(zhì)溶液（50umol/l)與20微升緩沖液混合在一 起。緩沖液配方為：50mmol/L磷酸鉀緩沖液，50ug/inl鮭魚精DNA。磷酸鉀緩沖液配方為 ： 10mmol/l磷酸鉀（pH6.0)，0.05%Tween20。在室溫條件下靜置15分鐘。取300微升混合液， 平均分放在3個小室中。室溫條件下，120rpm分別漩渦震蕩培養(yǎng)15分鐘、30分鐘、2小時。 將小室內(nèi)的溶液除去，用200微升磷酸鉀緩沖液(pH6. 0)清洗小室一次，以除去小室內(nèi)沒有 結合的蛋白質(zhì)。用手持綠色熒光蛋白檢測儀對小室內(nèi)的熒光強度進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng) 15分鐘小室內(nèi)表面產(chǎn)生的突光強度與培養(yǎng)0. 5小時和2小時小室內(nèi)表面產(chǎn)生的突光強度相 同(見圖6,圖中1?3依次顯示的是反應15分鐘、30分鐘、2小時后的熒光強度)。
[0095] (4)汞離子將固定在固相表面上的融合蛋白解離下來的可能性試驗
[0096] 配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 9，1.0mol/l NaCl，0· l%Tween20。在檢測緩沖液中加入終濃度為0. 5 μ g/1的HgCl2，取150微升放置在小 室中，培養(yǎng)5分鐘。將小室內(nèi)的液體轉移到另一個普通的微孔板小室中，用手持綠色熒光蛋 白檢測儀（GFP_pen，GFP100, Photon systems instruments, Brno, Czech Republic)對其熒 光強度進行檢測。結果顯示，酶標板小室中添加氯化汞的液體的熒光強度顯著高于未加氯 化汞的液體的熒光強度(見圖7，圖中1顯示的是溶液中不含有任何汞離子，2顯示的是含有 0. 5μ g/lHgCl2的溶液)。說明在酶標板小室內(nèi)，汞離子能夠?qū)⒐潭ㄔ诠滔啾砻娴膍erRl-GFP 融合蛋白從Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA上解離下來；通過對解離下來的merRl-GFP融 合蛋白的熒光強度進行檢測，能夠推斷出液體內(nèi)氯化汞的含量。
[0097] 實施例4
[0098] 其他重金屬離子對融合蛋白的結合特性：
[0099] (1)其他重金屬離子與融合蛋白在液相環(huán)境中的反應特點
[0100] 以巨大芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR擴增，合成引物如下：
[0101] Ο/Pmerrl-F :5' -AGGGTAAGTAAAATCTCATGAATGAAGTAA-3,，
[0102] Ο/Pmerrl-R :5, -TTCATCGCGATCGACAACCCCTAGCAATTT-3,；
[0103] PCR反應體系和程序同上，擴增獲得一個316bp的片段，該片段為pmerrl-〇merri， 將該片段從DNA瓊脂糖凝膠上回收下來。
[0104]配制凝膠遷移緩沖液，配方為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 5,50mmol/l KC1， 5%glycerol，50 μ g/ml bovine serum albumin, l_ol/l cysteine, 0_05%Nonidet P-40。在 DNA溶液中添加終濃度為10 μ mol/1的merRl-GFP融合蛋白，以1:1的體積比將混合液溶解 在凝膠遷移緩沖液中。分別取5份混合液，每份5微升，4?條件下培養(yǎng)60分鐘。然后在反 應液體中分別加入終濃度為 5 μ mol/1的〇3〇12、?13(：12、0(1(：12、八8(：1 3、]\^(：12。配制凝膠上樣緩 沖液，配方為：0. 05%bromophenol blue，50%glycerol。取5微升反應混合液與1微升上樣緩 沖液混合。進行6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺：甲叉=29:1)電泳，電泳緩沖液為： Tris-acetate緩沖液(無 EDTA)，配方為：0. 025mol/l Tris，0. 25mol/l Glycine，0_ l%(w/v) SDS，pH8. 0。在4O，200V的條件下電泳90分鐘。電泳以后用EB (ethidiumbromide)對 凝膠進行染色。結果顯示，反應混合液中添加這幾種重金屬離子后，DNA條帶在凝膠上的位 置并沒有發(fā)生變化(見圖8,圖中L為DNA Marker,CK顯示的是反應混合物中不添加任何重 金屬元素離子，1?5依次顯示的是向反應混合物中添加 CaCl2、PbCl2、CdCl2、AsCl3、MnCl 2)， 說明這幾種重金屬元素離子并不能夠與merRl-GFP結合；這幾種重金屬離子并不能夠使結 合在Pmerrl-Omerrl上的merRl-GFP從DNA上解離下來。
[0105] (2)其他重金屬元素與固定在固相表面的融合蛋白的反應實驗
[0106] 委托TAKARA公司，合成引物如下：
[0107] Ο/Pmerr卜F-biotin: 5' -TATATTTACCCTGTACTMGGTACGTGGTTTATGCTGTMGTGAGG-b iotin-3,,
[0108] Ο/Pmerr卜R-biotin: 5' -CCTCACTTACAGCATAAACCACGTACCTTAGTACAGGGTAAATAT A-3,；
[0109] 將寡核苷酸 0/PmerRl-F-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris-HCl(pH7. 4)中，使其終 濃度為 100 μ mol/1。寡核苷酸 Ο/PmerRl-R-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris-HCl (pH7. 4) 中，使其終濃度為100 μ mol/ι。兩者等體積混合，94?變性2分鐘，逐步降至室溫，形成雙鏈 Pmerrl-Omerrl-biotin，濃度為50μιηο1/1。這時形成的雙鏈DNA中有一個單鏈的3 '端有 一個生物素突出端，該生物素突出端用于下面的固定。
[0110] Pmerrl-Omerrl-biotin能夠通過生物素與鏈霉親和素之間的高親和力固定 在微孔板小室內(nèi)壁上。米用鏈霉未和素包最的高親和力黑色酶標板（Thermo fisher scientific, Yokohama, Japan)來固定寡核苷酸。用 150 微升 25mmol/l 的 Tris-HCl(pH6. 0) 緩沖液對酶標板小室沖洗二次，以除去小室中的DNA。將Pmerrl-Omerrl-biotin溶解在 25mmol/l 的 Tris-HCl (pH7. 4)緩沖液中，Pmerrl-Omerrl-biotin 的終濃度為 0. 25 μ mol/ 1。取 100 微升 Pmerrl-Omerrl-biotin 溶液放置在酶標板小室中。Pmerrl-Omerrl-biotin 溶液在內(nèi)表面包裹有鏈霉親和素的小室中培養(yǎng)2小時，培養(yǎng)條件為25°C，120rpm搖晃。然 后將 Pmerrl-Omerrl-biotin 溶液除去，用 2〇0 微升 25腕〇1/1 的 Tris-HCl (pH6. 0)緩沖液 對小室沖洗三次，以除去小室中沒有結合的DNA。
[0111] 取30微升merRl-GFP純化蛋白質(zhì)溶液（50 μ mol/1)與20微升緩沖液混合在一 起。緩沖液配方為：5〇mm〇l/L磷酸鉀緩沖液，50 μ g/ml鮭魚精DNA。在25°C條件下靜置15 分鐘。取300微升混合液，平均分放在3個小室中。25°C條件下，120rpm漩渦震蕩培養(yǎng)15 分鐘。將混合物從酶標板小室中移除出去。用200微升磷酸鉀緩沖液（pH6.0)清洗小室一 次，以除去小室內(nèi)沒有結合的蛋白質(zhì)。
[0112] 配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mmol/l Tris-HC1，pH7. 9，1.0mol/l NaCl，0. l%Tween20。將檢測緩沖液平均分為5份，在反應液體中分別加入CaCl2、PbCl2、 CdCl2、AsC13、MnCl2，使其終濃度為10 μ g/1。取150微升檢測緩沖液放置在酶標板小室 中。25°C培養(yǎng)5分鐘，將酶標板小室內(nèi)的液體轉移到另一個普通微孔板小室中，用手持式 綠色熒光蛋白檢測儀對微孔板小室內(nèi)液體的熒光強度進行檢測。結果顯示，酶標板小室內(nèi) 添加這幾種重金屬兀素尚子的液體的災光強度與未加任何重金屬元素離子的溶液的熒光 強度相同(見圖9,圖中1為溶液中不添加任何重金屬元素離子，2?6依次為含有終濃度是 1〇μ g/Ι的CaCl2、PbCl2、CdCl2、AsCl3、MnCl 2的溶液）;說明這幾種重金屬元素離子并不能夠 與merRl-GFP結合；這幾種重金屬離子并不能夠使結合在Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA 上的merRl-GFP從DNA上解離下來，在利用檢測裝置對樣品中汞離子含量進行檢測時，這幾 種重金屬元素離子不會造成干擾。
[0113] 實施例5
[0114] 融合蛋白粗提物代替純化蛋白的可能性試驗：
[0115] (1)合成雙鏈DNA，固定在酶標板小室內(nèi)表面
[0116] 委托TAKARA公司，合成引物如下：
[0117] 0/Pmerr 1-F-biotin: 5' -TATATTTACCCTGTACTAAGGTACGTGGTTTATGCTGTAAGTGAGG-b iotin-3,,
[0118] Ο/Pmerr卜R-biotin:5, -CCTCACTTACAGCATAAACCACGTACCTTAGTACAGGGTAAATAT A-3,；
[0119] 將寡核苷酸 O/PmerRl-F-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris_HCl(pH7· 4)中，使其終 濃度為 100 μ mol/1。寡核苷酸 O/PmerRl-R-biotin 溶解在 25mmol/L 的 Tris-HC1 (pH7. 4) 中，使其終濃度為100 μ mol/1。兩者等體積混合，94°C變性2分鐘，逐步降至室溫，形成雙鏈 Pmerra-Omerrl-biotin，濃度為50μηιο1/1。這時形成的雙鏈DNA中有一個單鏈的3 '端有 一個生物素突出端，該生物素突出端用于下面的固定。
[0120] Pmerrl-Omerrl-biotin能夠通過生物素與鏈霉親和素之間的高親和力固定 在微孔板小室內(nèi)壁上。米用鏈霉親和素包被的高親和力黑色酶標板（Thermo fisher scientific, Yokohama, Japan)來固定寡核苷酸。用 150 微升 25mmol/l 的 Tris_HCl(pH6. 0) 緩沖液對酶標板小室沖洗三次，以除去小室中的DNA。將Pmerrl-Omerrl-biotin溶解在 25mmol/l 的 Tris-HCl (ρΗ7· 4)緩沖液中，Pmerrl-Omerrl-biotin 的終濃度為 0· 25 μ mol/ 1，取100微升放置在小室中。Pmerrl-Omerrl-biotin溶液在內(nèi)表面包裹有鏈霉親和素的 小室中培養(yǎng)2小時，培養(yǎng)條件為 25°C，l2〇rpm搖晃。然后將Pmerrl-Omerrl-biotin溶液除 去，用200微升25麵〇1/1的Tris-HCl (ρΗ6· 0)緩沖液對小室沖洗三次，以除去酶標板小室 內(nèi)沒有固定的DNA。
[0121] (2)蛋白粗提物與固定在小室內(nèi)表面的DNA雙鏈結合試驗
[0122] 從LB平板上挑取一個BLW-E的單克隆，在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)液 中37°C進行過夜培養(yǎng)。然后以1:100的比例在4個各盛放有1升LB培養(yǎng)液的三角瓶中進 行擴大培養(yǎng)。在〇D 6。。增長到〇· 6時，向培養(yǎng)液中加入終濃度為0. 4mmol/l的IPTG，繼續(xù)培 養(yǎng)4小時。細胞培養(yǎng)物以6〇OOrpm，4°C條件離心10分鐘。用緩沖液（50mmol/l Tris-HCl， ρΗ7· 5, 2mmo/12-mercaptoethanol，5%v/v glycerol，0· 2mol/l(NH4)2S04)對細胞沉淀沖洗 兩次。用 50 暈升緩沖液（5〇mmol/l Tris-HC1, pH7.5,2mmo/12-mercaptoethanol，5%v/v glycerol, 0· 2mol/l(NH4)2S04)對細胞沉淀進行懸浮。將細胞懸浮液注入M-110H1微射流 均質(zhì)機（11(^〇乜1^沿〇8，他被〇11，麻)，在1100(^31的條件下對細菌細胞進行裂解處理。處 理后的均質(zhì)液體在l 6〇〇〇rpm，4°C條件下離心1小時，將上清液轉移到另一個干凈的三角瓶 中，用孔徑為〇· 45微米的濾膜進行過濾。過濾液即為融合蛋白粗提物。
[0123] 取3〇微升merRl-GFP蛋白粗體物溶液與20微升緩沖液混合在一起。緩沖液配方 為：50mmol/L磷酸鉀緩沖液，50 μ g/ml鮭魚精DNA。在室溫條件下靜置15分鐘。取300微 升混合液，平均分放在3個小室中。室溫條件下，120rpm分別漩渦震蕩培養(yǎng)15分鐘、30分 鐘、2小時。將小室中的液體移除除去，用200微升磷酸鉀緩沖液（ PH6. 0)清洗小室一次，以 除去沒有結合的粗體物蛋白質(zhì)。用手持式綠色熒光蛋白檢測儀對酶標板小室內(nèi)表面的熒光 強度進行檢測。結果顯示，培養(yǎng)15分鐘酶標板小室內(nèi)表面產(chǎn)生的熒光強度與培養(yǎng)0. 5小時 或2小時酶標板內(nèi)表面產(chǎn)生的熒光強度相同(見圖10,圖中1?3依次顯示的是反應15分 鐘、30分鐘、2小時后的熒光強度)。
[0124] (3)汞離子將固定在DNA雙鏈上的融合蛋白解離下來
[0125] 配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 9，1.0mol/l NaCl，0. l%Tween20。在檢測緩沖液中加入終濃度為10μ g/1的HgCl2。取150微升檢測緩 沖液放置在小室中，培養(yǎng)5分鐘。將小室內(nèi)的液體轉移到另一個普通的微孔板小室中，用 手持綠色突光蛋白檢測儀（GFP-pen，GFP100, Photon systems instruments, Brno, Czech Republic)對其熒光強度進行檢測。結果顯示，酶標板小室中添加氯化汞的液體的熒光強度 顯著高于未加氯化汞的液體的熒光強度(見圖11，圖中1顯示的是溶液中不含有任何汞離 子,2顯示的是含有〇.5μ g/1 HgCl2的溶液)。說明在酶標板小室內(nèi)，汞離子能夠?qū)⒐潭ㄔ?固相表面的merRl-GFP融合蛋白從Pmerrl-Omerr Ι-biotin上解離下來；通過對解離下來的 merRl-GFP融合蛋白的熒光強度進行檢測，能夠推斷出液體內(nèi)氯化汞的含量；將merRl-GFP 融合蛋白粗體物放置在酶標板小室中以后，蛋白粗提物中的merRl-GFP融合蛋白能夠與固 定在酶標板小室內(nèi)表面上的寡核苷酸結合，這種結合方式和結合強度與純化的merRl-GFP 融合蛋白和酶標板小室內(nèi)表面上固定的寡核苷酸之間的結合方式和結合強度并沒有什么 不同。
[0126] (4)其他重金屬元素與融合蛋白粗體物-DNA復合體發(fā)生反應的可能性試驗
[0127] 配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mmol/l Tris-HCl，pH7.9，1.0mol/l NaCl，0. l%Tween20。將檢測緩沖液平均分為5份，在反應液體中分別加入CaCl2、PbCl2、 CdCl2、AsC13、MnCl2，使其終濃度為1〇μ g/1。取150微升檢測緩沖液放置在酶標板小室 中。25°C培養(yǎng)5分鐘，將酶標板小室內(nèi)的液體轉移到另一個普通微孔板小室中，用手持式 綠色熒光蛋白檢測儀對微孔板小室內(nèi)液體的熒光強度進行檢測。結果顯示，酶標板小室內(nèi) 添加這幾種重金屬元素離子的液體的熒光強度與未加任何重金屬元素離子的溶液的熒光 強度相同(見圖12,圖中1為溶液中不添加任何重金屬元素離子，2?6依次為含有終濃度 是10 μ g/Ι的CaCl2、PbCl2、CdCl2、AsC13、MnCl 2的溶液）；說明這幾種重金屬元素離子并不 能夠與merRl-GFP結合；這幾種重金屬離子并不能夠使結合Pmerrl-Omerrl-biotin上的 merRl-GFP從DNA上解離下來，在利用檢測裝置對樣品中汞離子含量進行檢測時，這幾種重 金屬元素離子不會造成干擾；無論所用原料是純化的merRl-GFP蛋白，還是工程菌蛋白粗 提物，在檢測樣品中汞離子時，這幾種重金屬元素離子都不會造成干擾。
[0128] 從上述實施例可以看出，用粗蛋白提取物代替純化的merRl-GFP融合蛋白，對酶 標板小室內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)結合、未離子與蛋白質(zhì)結合、未離子使融合蛋白從DNA上解離 下來等各項指標都沒有造成影響，因此可以采用蛋白粗提物代替純化的merRl-GFP融合蛋 白，從而節(jié)省制備檢測裝置所需要的人力和物力，大幅降低檢測成本。
[0129] 實施例6
[0130] 冷凍干燥對融合蛋白粗提物性質(zhì)的影響：
[0131]將實施例5中使用后的檢測裝置放置于-8(TC冷凍處理2小時，然后取出置于真 空冷凍干燥機（FreeZone4. 5, Labconco, USA)中進行冷凍干燥處理，再置于4-C冰箱，30天 后從4°C冰箱中取出，配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為： 20mm〇1/i Tris-HC1，pH7.9， 1.0mol/lNaCl，0_ l%Tween20。在檢測緩沖液中分別加入終濃度為〇. lug/io. 2μ g/丄、 0.3iig/l、0.4ng/l、0.5ug/l的汞離子。然后取150微升溶液分別放入檢測裝置酶標板 不同的小室內(nèi)，25度培養(yǎng)5分鐘，將酶標板小室內(nèi)的液體轉移到另一個普通微孔板小室中， 用手持式綠色熒光蛋白檢測儀對微孔板小室內(nèi)液體的熒光強度進行檢測。結果顯示，萊離 子含量為〇· 1 μ g/Ι和0· 2 μ g/Ι的樣品的熒光強度與不含汞離子的樣品的熒光強度沒有什 么區(qū)別，但是汞離子含量為0· 3 μ g/Ι或者濃度更高的樣品的熒光強度則顯著高于對照，經(jīng) 過冷凍干燥處理后的檢測裝置的汞離子檢出最低值為0. 3 μ g/Ι (見圖13,圖中1?6依次 為向檢測裝置內(nèi)添加終濃度為 0μ g/l、0. 1 μ g/l、〇. 2μ g/l、0. 3μ g/l、0. 4μ g/l、0. 5μ g/ 1 Hg(II)溶液的檢測結果)。而未經(jīng)過冷凍干燥處理的檢測裝置的汞離子檢出極限值也是 0. 3 μ g/Ι。這說明冷凍干燥并不會使檢測裝置對汞離子的檢出功能造成影響，檢測裝置在 低溫情況下能夠長期保存，其汞離子檢測功能能夠在低溫下長期得到保持，檢測裝置一經(jīng) 制成后，可以多次反復使用。
[0132] 實施例7
[0133] 土壤提取樣品的制備：
[0134]取50克干燥的土壤懸浮在500毫升超純水中，用玻璃棒將土壤搗碎，使其呈懸濁 液，靜置5分鐘，取上清液用粗濾紙進行過濾，再用孔徑為〇. 45微米的濾膜對過濾液進行二 次過濾，二次過濾所得到的液體即為土壤提取樣品。
[0135] 實施例8
[0136] 本實施例中汞離子檢測裝置包括結合有merRl-GFP融合蛋白的 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA體系，體系中Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈通過生物素固定 在鏈霉末和素包被的尚末和力黑色酶標板（Thermo fisher scientific, Yokohama, Japan) 上，merRl-GFP融合蛋白的制備方法同實施例l、2，Pmerrl-〇merrl_biotin雙鏈體系的制備 方法同實施例3中（3)。
[0137] 從4°C冰箱中取出檢測裝置，配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mm 〇l/l Tris-HCl，pH7.9，1.0mol/l NaCl，0. l%Tween20。在檢測緩沖液中分別加入一系列濃度 梯度的HgCl2。使汞離子的終濃度分別為〇μ g/l、10y g/l、20y g/l、30y g/l、4〇y g/1、 50 μ g/l、60 μ g/1、70 μ g/l、80 μ g/l、90 μ g/1、100 μ g/l、500 μ g/1、1000 μ g/1、2000 μ g/ 1、 3000 μ g/1。取150微升檢測緩沖液放置在檢測裝置小室中，培養(yǎng)5分鐘，將上清液轉移 至另外一個普通微孔板小室中。用手持式綠色熒光蛋白檢測儀（GFP-pen，GFP100, Photon systems instruments, Brno, Czech Republic)對其突光強度進行測量。對突光強度與 汞離子含量之間繪制標準曲線，結果如圖14所示，圖中0?15依次顯示的是含有0 μ g/ 1、10μ g/1、20 μ g/1、30 μ g/1、40 μ g/1、50 μ g/1、60 μ g/1、70 μ g/1、80 μ g/1、90 μ g/1、 100 μ g/1、500 μ g/1、1000 μ g/1、2000 μ g/1、3000 μ g/1 Hg(II)的溶液。由圖 14 可以看到， 汞離子含量與熒光強度之間呈現(xiàn)一 "S"型曲線，汞離子含量與熒光強度之間呈現(xiàn)一一對應 的關系，根據(jù)熒光強度值能夠計算出其對應的汞離子含量。
[0138]實驗土壤樣品采自某蔬菜種植園，該菜地由于進行污水灌溉而被汞污染。該地塊 土壤容重為2. 3X 103kg/m3,含水量為18%，pH值為7. 4。取50克地表土壤懸浮在500毫升 超純水中，用玻璃棒將土壤搗碎，使其呈懸濁液，靜置5分鐘，取上清液用粗濾紙進行過濾， 再用孔徑為0· 45微米的濾膜對過濾液進行二次過濾，二次過濾所得到的液體即為土壤提 取樣品。
[0139] 配制檢測緩沖液，檢測緩沖液成分為：20mmol/l Tris-HCl，pH7. 9,1. Omol/1 NaCl，0. l%Tween20。在檢測緩沖液中分別加入等體積檢測土壤樣品。取150微升含有檢 測樣品的緩沖液放置在小室中，培養(yǎng)5分鐘，將上清液轉移至另一個普通微孔板中。手 持式綠色熒光蛋白測量儀（GFP-pen, GFP100, Photon systems instruments, Brno, Czech Republic)對其熒光強度用熒光進行測量。將測量結果與標準曲線進行比對，計算出該地塊 土壤汞含量為2. lmg/kg。
[0140] 用200微升檢測緩沖液對檢測裝置沖洗3次，然后將裝置置于-80°C冷凍處理2 小時，取出后放于冷凍干燥機（FreeZone4. 5, Labconco, USA)中進行冷凍干燥，再取出置于 4Γ冰箱中進行保存，以備下次使用。
【權利要求】
1. 一種汞離子檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：在結合有rnerRl-GFP融合蛋白的 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA體系中加入含汞離子溶液，靜置后取出溶液進行熒光強度 測量，利用標準曲線計算溶液中汞離子含量。
2. 根據(jù)權利要求1所述的汞離子檢測方法，其特征在于：所述的merRl-GFP融合蛋白 由SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列編碼。
3. 根據(jù)權利要求2所述的汞離子檢測方法，其特征在于：所述merRl-GFP融合蛋白的 制備包括以下步驟： (1) 以巨大芽孢桿菌基因組DNA為模板，利用引物P1F、P1R擴增merRl基因，構建質(zhì)粒 P1 ; (2) 以質(zhì)粒P1為模板，利用引物P2F、P2R擴增兩端攜帶BamH I和EcoR I酶切位點的 merRl基因，構建質(zhì)粒P2 ; (3) 以質(zhì)粒pEGFP為模板，利用引物P3F、P3R擴增GFP基因，用EcoR I酶切GFP基因 和質(zhì)粒P2,連接后構建質(zhì)粒P3 ; (4) 以質(zhì)粒P3轉化大腸桿菌，取陽性克隆進行擴大培養(yǎng)，IPTG誘導表達merRl-GFP融 合蛋白； 引物P1F的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，引物P1R的核苷酸序列如SEQ ID N0:4 所示，引物P2F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示，引物P2R的核苷酸序列如SEQ ID NO: 6 所示，引物P3F的核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示，引物P3R的核苷酸序列如SEQ ID NO:8 所示。
4. 根據(jù)權利要求1所述的萊離子檢測方法，其特征在于：所述Pmerrl-Omerrl-biotin 雙鏈DNA中一個單鏈的3'端具有生物素突出端，該單鏈的寡核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所 /_J、1 ο
5. 根據(jù)權利要求4所述的萊離子檢測方法，其特征在于：所述Pmerrl-Omerrl-biotin 雙鏈DNA的制備方法包括以下步驟：將引物O/Pmerrl-F-biotin、O/Pmerrl-R-biotin分別 溶于緩沖溶液中，等體積混合，在94°C變性2分鐘，降至室溫得到Pmerrl-Omerrl-biotin雙 鏈；引物O/Pmerrl-F-biotin 的核苷酸序列如 SEQ ID NChllKTj^dWIJO/Pmerrl-R-biotin 的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示。
6. -種汞離子檢測裝置，其特征在于：包括結合有merRl-GFP融合蛋白的 Pmerrl-Omerrl-biotin 雙鏈 DNA 體系。
7. 根據(jù)權利要求6所述的汞離子檢測裝置，其特征在于：所述體系中 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA通過生物素固定在鏈霉親和素包被的酶標板上。
8. 根據(jù)權利要求7所述的汞離子檢測裝置，其特征在于：其制備方法包括以下步驟：將 Pmerrl-Omerrl-biotin雙鏈DNA置于鏈霉親和素包被的酶標板內(nèi)，室溫下震蕩培養(yǎng)；再將 merRl-GFP融合蛋白置于酶標板內(nèi)，室溫下震蕩培養(yǎng)，即得。
【文檔編號】G01N21/64GK104297220SQ201410157445
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年4月18日 優(yōu)先權日:2014年4月18日
【發(fā)明者】舒海燕, 常勝合 申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海口實驗站