專利名稱：生物活性靶體及用于藥物篩選和蛋白質結構研究的方法
技術領域：
本發明涉及一種生物活性靶的制備方法，具體地涉及一種用多孔硅為基質的活性靶體的制備方法；本發明還涉及一種該生物活性靶用于藥物篩選的方法；本發明還涉及一種該生物活性靶用于蛋白質結構研究的方法。
本發明的另一目的在于提供一種該生物活性靶體用于藥物篩選的方法，該方法在低分子量(小于500Da)藥物的篩選中尤其存在優勢，同時，該方法與微技術結合，一次可以處理數十個樣品，并且每次的分析速度很快，可以實現高通量篩選。
本發明的又一目的在于提供一種該生物活性靶體用于以蛋白質結構研究的方法，該方法可以在活性靶體表面實現固定化酶酶解蛋白技術和分子量測定的一體化。
為實現上述目的，本發明提供的一種生物活性靶體的制備方法，主要包括如下步驟(1)用n型晶體硅制備多孔硅以鉑絲為陰極，硅片為陽極，電解液為40-49％氫氟酸和無水乙醇按3∶2(V/V)的混合溶液，進行光誘導，控制恒定電流90-95A，電解時間40-5-分鐘；(2)多孔硅的氧化和酸化將步驟(1)制備的多孔硅浸入10-30％的氧化性酸溶液中，如20％硝酸溶液，使其氧化1-3小時，再放入還原性酸溶液，如20％鹽酸溶液中反應4-6小時，溫度控制在110℃左右。然后用水洗至中性，真空存放備用；(3)多孔硅的胺丙基化將步驟(2)制備的多孔硅在氮氣保護下放入經過蒸餾、鈉絲干燥的甲苯中，加入三乙氧基胺丙基硅烷，反應10-16小時；(4)多孔硅表面鍵合蛋白質將步驟(3)制備的的多孔硅放入丙酮中，冰浴條件下加入三聚氯氰進行反應，并控制溫度低于5℃，反應時間約2小時，再放入pH＝6.5的牛血清白蛋白(BSA)磷酸緩沖液中室溫下反應1-3小時，硅片用pH＝6.7的甘氨酸乙酯溶液進行封尾，時間控制在2小時左右，溫度為30-40℃。
通過上述步驟制備得到的鍵合了牛血清白蛋白(BSA)的硅片存放于0.02％的疊氮鈉溶液中。胰蛋白酶的鍵合方法與牛血清白蛋白(BSA)的鍵合方法相同，因此對胰蛋白酶的鍵合方法不作描述。
本發明提供的上述生物活性靶體用于藥物篩選的方法，其主要依據和作法是由于許多藥物都與蛋白質有非共價相互作用，所以在多孔硅表面鍵合牛血清白蛋白，制備成活性靶體，用于發現何種物質有潛在成為藥物的可能性。將含有目標藥物分子的混合溶液點在鍵合了BSA的活性表面。1-5分鐘后，用乙醇、甲醇等溶劑的水溶液沖洗，目標藥物分子會在活性靶表面有保留。而其他的與BSA沒有相互作用的組分被沖走。將保留了目標藥物分子的活性靶送入質譜儀進行分析，即可以得到目標分子的分子量信息。
本發明提供的上述生物活性靶體用于蛋白質結構研究的方法，其主要是將蛋白質細胞色素C溶液點在鍵合有胰蛋白酶的多孔硅活性靶體表面，放置3-5小時后將該多孔硅活性靶體送入質譜分析，可以得到細胞色素C被胰蛋白酶酶切后的肽片段質譜圖。
由于該技術綜合了固定化酶技術，因此酶的穩定性增加，并可重復使用；肽譜中不出現水解酶的自水解峰。又由于采用了多孔硅質譜技術，具有不需要加入傳統的有機基體，無基體干擾峰出現的優點。
為了更好地理解本發明的實質，下面以實施例并結合附圖作具體說明。
該圖中a表示由新制備的多孔硅所得譜圖；該圖中b表示樣品經過與BSA親和靶相互作用，沖洗后所得譜圖；該圖中c為對照實驗；圖3為本發明鍵合有胰蛋白酶的多孔硅活性靶水解馬心細胞色素C所得到的肽譜圖，其中該圖中a表示不加入基體，直接進行質譜分析；該圖中b表示加入傳統基體后進行質譜分析。
2)將制備好多孔硅浸入5-10ml 20％的HNO3溶液中反應2小時使其氧化，然后將多孔硅放入20％100ml的HCl中活化5小時，反應溫度控制在110℃。將活化后的多孔硅用離子水沖洗至中性，110℃下保存于真空干燥器中備用。
3)取一定體積的甲苯于150ml三口燒瓶內，加入100ml新鮮的鈉絲及指示劑二苯甲酮，加熱至甲苯回流，保持溶液回流，直至溶液呈明顯深藍色。迅速取下冷凝管，換成蒸餾裝置，蒸出的甲苯立即使用，以避免空氣的氧化。在氮氣保護下，將多孔硅放入蒸餾處理的甲苯中，量取三乙氧基胺丙基硅烷8ml，在120℃下反應14小時。胺丙基化的硅片用甲苯沖洗三次后置于真空干燥器中干燥。
4)將胺丙基化的硅片放入80ml丙酮中，冰浴溫度控制在0℃，緩慢攪拌下，將3.7g三聚氯氰緩慢加入，并控制溫度不高于5℃，反應2小時后，硅片放入20mM牛血清白蛋白BSA磷酸緩沖液，該緩沖液pH＝6.5，溫度由水浴控制在35℃，反應2小時，硅片用1％W/W，pH＝6.7的甘氨酸乙酯溶液進行封尾，時間為2小時，溫度控制在35℃。
胰蛋白酶的鍵合方法與牛血清白蛋白BSA相同，只要將牛血清白蛋白BSA換成胰蛋白酶即可。
實施例2生物活性靶體用于藥物篩選該實施例為比較例(1)將酮基布洛芬和舒必利的混合溶液點在新制備的多孔硅表面，直接進行質譜分析，譜圖見
圖1(a)，質譜峰255、277和293分別對應MH、MNa和MK。
(2)將酮基布洛芬和舒必利的混合溶液點在鍵合了牛血清白蛋白的活性親和靶表面，約一分鐘后，用20μl 20％的乙醇沖洗，然后送入離子源，進行質譜分析，譜圖見圖1(b)，得到酮基布洛芬的譜峰，但舒必利的譜峰卻沒有出現。
(3)多孔硅經過與親和靶相同的反應步驟，但沒有鍵合BSA，經過與實施例2相同的處理后，進行質譜分析，譜圖見圖1(c)，從譜圖中可以看出無樣品峰出現。
通過上述3個例子可以出，酮基布洛芬與BSA有相互作用，并非多孔硅本身吸附等引起保留，而舒必利與牛血清白蛋白沒有相互作用。
實施例3生物活性靶體用于蛋白質結構研究依照實施例子所示方法制備鍵合胰蛋白酶的活性靶，然后將濃度為1μmol/l的細胞色素C點在該活性靶表面。在室溫下用該固定化酶水解蛋白質細胞色素C。約3小時后，將反應后的活性靶送入質譜儀進行分析。所得到的水解后肽譜圖見圖2所示。其中(a)圖加入了傳統基體，直接將水解產物進行質譜分析；(b)圖中加入0.5ul傳統基體HCCA后進行質譜分析。其中細胞色素C的水解肽片段峰均由◆標記出。利用所得肽譜數據，再結合互聯網上的蛋白質數據庫，即可驗證該蛋白的一級結構。
權利要求
1.一種生物活性靶體的制備方法，先用單晶硅制備多孔硅，然后將多孔硅進行氧化和酸化，再對多孔硅進行胺丙基化，其特征在于，將胺丙基化的多孔硅放入丙酮中，冰浴溫度下加入三聚氯氰進行反應1-3小時，再放入牛血清白蛋白或胰蛋白酶磷酸緩沖液中，水浴35℃反應1-3小時，硅片用甘氨酸乙酯溶液進行封尾，時間1.5-2.5小時，溫度為30-40℃。
2.如權利要求1所述的生物活性靶體的制備，其特征在于(1)單晶硅制備多孔硅以鉑絲為陰極，硅片為陽極，氫氟酸和乙醇的混合溶液為電解液，光誘導，控制恒定電流90-95A，電解時間40-50分鐘；(2)多孔硅的氧化和酸化將步驟(1)制備的多孔硅浸入氧化酸溶液中使其氧化1-3小時，再放入還原酸中90-120℃下活化4-6小時，水洗至中性，真空存放備用；(3)多孔硅的胺丙基化將步驟(2)制備的多孔硅放入甲苯中，加入三乙氧基胺丙基硅烷，100-130℃下反應10-16小時；
3.如權利要求2所述的生物活性靶體的制備方法，其特征在于，所述電解液為40-49％氫氟酸和無水乙醇按3∶2(V/V)的混合溶液。
4.如權利要求2所述的生物活性靶體的制備方法，其特征在于，所述光誘導可用碘鎢燈照射。
5.如權利要求2所述的生物活性靶體的制備方法，其特征在于，所述氧化酸為硝酸，其濃度為10-30％，還原酸為鹽酸，其濃度為15-25％。
6.如權利要求2所述的生物活性靶體的制備方法，其特征在于，所述甲苯經過蒸餾以及鈉絲干燥。
7.如權利要求1所述的生物活性靶體的制備方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白或胰蛋白酶磷酸緩沖液的pH＝6.5，甘氨酸乙酯溶液的pH＝6.7。
8.一種將權利要求1所述的生物活性靶用于藥物篩選的方法，其特征在于，將含有目標藥物分子的混合溶液點在鍵合了牛血清白蛋白的活性靶體表面，數分鐘后，用乙醇或甲醇沖洗，活性靶送入質譜儀進行分析。
9.一種將權利要求1所述的生物活性靶體用于蛋白質結構研究的方法，其特征在于，將蛋白質細胞色素C溶液點在鍵合有胰蛋白酶的多孔硅活性靶體表面，放置2-4小時后將該多孔硅活性靶體送入質譜分析。
全文摘要
一種生物活性靶體的制備方法，用單晶硅在光誘導下進行電解制備多孔硅；用氧化酸進行氧化并用還原酸進行活化；多孔硅放入甲苯中，加入三乙氧基胺丙基硅烷，加熱反應；鍵合蛋白質并用甘氨酸乙酯溶液進行封尾。一種生物活性靶用于藥物篩選的方法，將含有目標藥物分子的混合溶液點在鍵合了BSA的活性表面，數分鐘后，用合適的溶劑沖洗，活性靶送入質譜儀進行分析。一種生物活性靶體用于蛋白質結構研究的方法，將蛋白質細胞色素C溶液點在鍵合有胰蛋白酶的多孔硅活性靶體表面，放置一段時間后將該多孔硅活性靶體送入質譜分析。
文檔編號G01N33/53GK1414363SQ0113681
公開日2003年4月30日 申請日期2001年10月24日 優先權日2001年10月24日
發明者鄒漢法, 張清春, 郭忠, 郭寶川, 張強, 陳小明 申請人:中國科學院大連化學物理研究所
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