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專利名稱：磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測微量磺胺藥的器具，特別是涉及一種磺胺藥多殘留分析的金標層析檢測試紙盒。
二、技術背景磺胺藥是一類用于預防和治療細菌感染性疾病的化學藥物。具有抗菌譜廣、價廉、使用方便的特點，除廣泛用于獸醫(yī)臨床治療外，常常作為飼料添加劑在動物生產(chǎn)中應用，以便控制某些疾病。由于磺胺藥在動物生產(chǎn)中的不規(guī)范使用，使其在動物體內(nèi)殘留，并通過肉、蛋、奶等食物鏈進入人體，在人體內(nèi)蓄積，導致許多細菌產(chǎn)生抗藥性，造成過敏性反應，發(fā)生中毒，還可引起造血系統(tǒng)障礙、急性溶血性貧血、粒細胞缺乏癥、再生障礙性貧血等，有些還有致畸、致癌作用，嚴重危害人類的身體健康。
磺胺藥是近15～20年來在動物性食品中殘留超標現(xiàn)象非常嚴重的一類獸藥，因此，世界各國對磺胺藥的殘留極為關注，我國已把動物性食品中磺胺藥殘留列為重點監(jiān)控對象之一。
檢測磺胺藥殘留的方法很多，如微生物學法、薄層層析法、高效液相色譜法、氣相色譜法、氣-質(zhì)聯(lián)用分析法和毛細管電泳法等。但這些方法有的需要昂貴的儀器設備，需要熟練的專業(yè)人員操作，操作過程復雜，需要的時間較長，限制了其應用范圍，難以在生產(chǎn)實際中推廣應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研制出特異，敏感、快速、簡便的磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒。
本發(fā)明的技術方案是一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設有安裝試紙芯的固定槽，面板上設有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成。反應膜用印制有隱形檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標抗體的玻璃纖維棉，金標抗體為膠體金標記的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應膜上的檢測線為2～5條相應的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，反應膜上的對照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或為羊抗兔IgG、或為兔抗載體蛋白IgG抗體印制，對照線和檢測線平行排列組合為“|||”，或為“||||”，或為“|||||”，或為“||||||”。
所述的金標抗體和相應的結(jié)合抗原形成下述的任意2～5種組合，金標抗磺胺甲基嘧啶(SM1)抗體，檢測線為SM1-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺二甲基嘧啶(SM2)抗體，檢測線為SM2-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺對甲氧嘧啶(SMD)抗體，檢測線為SMD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺嘧啶(SD)抗體，檢測線為SD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺二甲氧嘧啶(SDM)抗體，檢測線為SDM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺間甲氧嘧啶(SMM)抗體，檢測線為SMM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺甲噁唑(SMZ)抗體，檢測線為SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺異噁唑(SIZ)抗體，檢測線為SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺甲氧吡嗪(SMP)抗體，檢測線為SMP-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺喹噁啉(SQ)抗體，檢測線為SQ-載體蛋白結(jié)合抗原。
一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設有安裝試紙芯的固定槽，面板上設有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成。反應膜用印制有隱形檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標物結(jié)合墊用吸附2～5種金標磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應膜檢測線為2～5條相應的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應膜上的對照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或為羊抗兔IgG、或為兔抗載體蛋白IgG抗體印制，對照線和檢測線平行排列組合為“|||”，或為“||||”，或為“|||||”，或為“||||||”。
所述的金標磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原和相應的磺胺藥抗體為下述的任意2～5種組合，金標SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SM1抗體；金標SM2-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SM2抗體；金標SMD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMD抗體；金標SD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SD抗體；金標SDM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SDM抗體；金標SMM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMM抗體；金標SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMZ抗體；金標SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SIZ抗體；金標SMP-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMP抗體；金標SQ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SQ抗體。
所述的襯板用硬質(zhì)塑膠條，樣品墊為玻璃纖維棉；吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙。
所述的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA，或人血清白蛋白HSA，或血藍蛋白KLH。
所述的顯示窗旁邊分別印有字母T1、T2…Tn和C，T表示檢測線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對照線，在遠離加樣孔側(cè)，其中n為1、2、3、4、5。
本發(fā)明的積極有益效果本發(fā)明的磺胺藥多聯(lián)金標層析檢測試紙盒具有以下突出優(yōu)點，①試紙盒特異性強，敏感性高。最低檢出限可達到10ppb，低于我國目前限量標準。
②試紙盒實現(xiàn)了磺胺藥多殘留金標層析快速檢測，用同一試紙盒可一次加樣同時檢測多種磺胺藥物，克服以前的常規(guī)單項檢測試紙盒一次只能檢測一種藥物的不足；大大節(jié)省了檢測多種磺胺藥物的檢測時間，提高了工作效率。
③使用該試紙盒，無需其它試劑和儀器，可現(xiàn)場操作，在10分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果，簡便、快速、時效性強。
④使用該試紙盒以棕紅色線條“|”顯示數(shù)量或有無，作為檢測結(jié)果判定依據(jù)，形象、直觀，簡單明了，不易出現(xiàn)人為誤判。
⑤節(jié)省費用，適用范圍廣，便于推廣。使用該試紙盒，比用儀器分析和常規(guī)單項檢測試紙條費用大幅下降。同時，試紙盒適用范圍廣，可滿足不同層次人員需要，包括專業(yè)檢驗、海關檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測、加工企業(yè)和養(yǎng)殖場戶等，便于推廣應用。
四

圖1、試紙芯側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2、試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3、二項聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖4、試紙盒底座構(gòu)造示意圖。
圖5、三項聯(lián)檢試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6、三項聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖7、五項聯(lián)檢試紙芯俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
圖8、五項聯(lián)檢試紙盒面板構(gòu)造俯視圖。
圖中，1襯板；2樣品墊；3金標物結(jié)合墊；4反應膜；5吸水墊；6對照線；7檢測線；8加樣孔；9顯示窗；10面板；11底座；12固定槽。
五具體實施例方式要制成磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，首先需要制備某種磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，同時需要制備磺胺藥金標物，而且需要制備羊抗或兔抗小鼠IgG抗體或羊抗兔IgG抗體，或兔抗載體蛋白IgG抗體，進而制備試紙芯，并安裝在塑料殼底座的固定槽中，最后和面板嵌合在一起。
1、磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原制備采用重氮化法或戊二醛法可制備任何一種磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原。
采用的載體蛋白分別為牛血清白蛋白(BSA)，雞卵清白蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，血藍蛋白(KLH)。
重氮化法以SMM為例，在冰浴條件下進行，稱取SMM40mg溶于5ml0.1mol/L稀鹽酸中，攪拌下滴加0.3～0.5ml10％的NaNO2，反應4～6h；稱取BSA20mg溶于3ml PBS液，并在攪拌下緩慢加入上液中，用1mol/L的NaOH調(diào)pH≈8.5，反應過夜。收集反應液裝入透析袋，在4℃下用0.1mol/L(pH7.4)的PBS透析3～5天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的人工結(jié)合抗原SMM-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA或KLH替代BSA制得人工結(jié)合抗原SMM-OVA或SMM-HSA或SMM-KLH。
戊二醛法以SMM為例，將10mg BSA溶于2ml pH＝9.6的0.05mol/L碳酸緩沖液中，再緩緩滴加25％戊二醛溶液0.2mL，攪拌反應4～6h；稱取SMM20mg溶于2ml 0.1mol/L的NaOH溶液，并在攪拌下緩慢加入上液中，室溫反應過夜。收集反應液裝入透析袋，在4℃下用0.1mol/L(pH7.4)的PBS透析3～5天，每天更換透析液2～3次。最后收集透析好的人工結(jié)合抗原SMM-BSA，保存于-20℃冰箱備用。
同法，用OVA或HSA或KLH替代BSA制得人工結(jié)合抗原SMM-OVA或SMM-HSA或SMM-KLH。
采用上述兩種方法可制備的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原分別為SM1-BSA、SM2-BSA、SMD-BSA、SD-BSA、SDM-BSA、SMM-BSA、SMZ-BSA、SIZ-BSA、SMP-BSA、SQ-BSA；SM1-OVA、SM2-OVA、SMD-OVA、SD-OVA、SDM-OVA、SMM-OVA、SMZ-OVA、SIZ-OVA、SMP-OVA、SQ-OVA；SM1-HSA、SM2-HSA、SMD-HSA、SD-HSA、SDM-HSA、SMM-HSA、SMZ-HSA、SIZ-HSA、SMP-HSA、SQ-HSA；SM1-KLH、SM2-KLH、SMD-KLH、SD-KLH、SDM-KLH、SMM-KLH、SMZ-KLH、SIZ-KLH、SMP-KLH、SQ-KLH。
2、抗某種磺胺藥單克隆抗體或多克隆抗體的制備單抗制備以SM1為例，用SM1-載體蛋白結(jié)合抗原按50～100μg/只的劑量免疫8周齡BALB/c小鼠3～4次，每次免疫間隔時間3～5周，最后一次超強免疫后3～4天，無菌取其脾細胞并與NS0骨髓瘤細胞雜交融合，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10～14天，用間接ELISA方法選擇強陽性、抑制率高、細胞生長旺盛的孔進行3次有限稀釋克隆化，而后擴大培養(yǎng)，建立雜交瘤細胞株，其分泌的單克隆抗體可特異地與SM1反應。以體內(nèi)誘生法進行單抗制備，以辛酸-硫酸銨法提純單抗，置-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 多抗制備以SM1為例，用SM1-載體蛋白結(jié)合抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200～500μg/次，背部皮下分4～6點注射。首免，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)溶解SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，與等量弗氏完全佐劑(FCA)混合，充分乳化；加強免疫，用無菌PBS溶解SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，與等量弗氏不完全佐劑(FIA)混合，充分乳化，首免后2～3周進行，連續(xù)免疫4～5次，每次間隔2～3周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法測定其效價達到105以上時，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 上述方法可用于任何一種磺胺藥單克隆抗體或多克隆抗體的制備。
3、金標物結(jié)合墊的制備①金標抗體結(jié)合墊的制備采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液，即在沸騰的200ml 0.01～0.02％氯金酸溶液中加入新鮮配制的1％檸檬酸鈉8ml，獲得直徑約15nm的膠體金溶液，用0.1mol/L K2CO3調(diào)pH值至8.5～9.5，置2～8℃保存?zhèn)溆谩Ｒ?∶2000的標記比將待標記的單克隆抗體或多克隆抗體加入pH8.5～9.5的金溶膠中，標記10min后，加入20％的PEG10000至終濃度為0.05％，4℃、1500～2000rpm離心20min，除去未結(jié)合的膠體金顆粒，4℃、15000rpm離心1h，棄上清，獲初步純化的金標抗體蛋白，再用丙烯葡聚糖S一400柱層析進行分離純化，獲得膠體金標記抗體。將1∶100～500稀釋的膠體金標記抗體(單克隆抗體或多克隆抗體)吸附于精制玻璃纖維棉中，4℃低溫真空干燥，制備金標抗體結(jié)合墊。
上述方法可用于任何一種磺胺藥金標抗體結(jié)合墊的制備。
②金標抗原結(jié)合墊的制備參照金標抗體結(jié)合墊的制備方法進行，以磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗磺胺藥抗體，將膠體金pH值調(diào)為6.0～7.0即可。
4、羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體的制備以飽和硫酸銨鹽析法提取磺胺藥陰性小鼠血清IgG(或陰性兔血清IgG)，用小鼠血清(或兔血清)IgG以50～100μg/kg體重的劑量經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3～4次，末次注射10天后，測定其血清瓊擴效價達到1∶40以上時，心臟或動脈采血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨鹽析法提取羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，置于-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 5、兔抗載體蛋白IgG抗體的制備用載體蛋白BSA免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200～500μg/次，背部皮下分4～6點注射。首免，用無菌PBS溶解BSA，與等量FCA混合，充分乳化；加強免疫，用無菌PBS溶解BSA，與等量FIA混合，充分乳化，首免后2～3周進行，連續(xù)免疫3～4次，每次間隔2～3周，末次免疫后10～15天，測定其血清瓊擴效價達到105以上時，采血并分離收集高免血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取抗BSA抗體，置一20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 同法制備抗OVA抗體、抗HSA抗體、抗KLH抗體。
6、試紙盒檢測反應原理由于膠體金標記對象不同，其檢測反應原理稍有差異。
當膠體金標記物是抗體時，加入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測物及金標物結(jié)合墊中的金標抗體一起向反應膜擴散，在擴散過程中，待測藥物可與金標抗體相結(jié)合，從而封閉了金標抗體上的結(jié)合位點，阻止金標抗體被反應膜上的結(jié)合抗原檢測線攔截，檢測線不顯示，而羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體則可攔截金標抗體，顯示一條棕紅色對照線“|”，為陽性表示；否則，樣品溶液中無待測藥物時，不能阻止金標抗體被反應膜上的結(jié)合抗原檢測線攔截，顯示棕紅色檢測線“|”，但羊抗或兔抗小鼠IgG(或羊抗兔IgG)抗體也攔截金標抗體，顯示棕紅色對照線“|”，為陰性表示；如果反應膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
當膠體金標記物是結(jié)合抗原時，加入待測樣品溶液后，樣品溶液通過虹吸作用帶動待測藥物及金標物結(jié)合墊中的金標結(jié)合抗原一起向反應膜擴散，樣品中的游離待測藥物分子量小移動速度快，先到達反應膜檢測線，先與檢測線上的抗體相結(jié)合，封閉了檢測線上抗體的結(jié)合位點，阻止金標結(jié)合抗原與反應膜上的抗體檢測線結(jié)合，檢測線不顯示，而抗載體蛋白抗體則可攔截金標結(jié)合抗原，顯示一條棕紅色對照線“|”，為陽性表示；否則，樣品溶液中無待測藥物時，金標結(jié)合抗原到達反應膜上的檢測線時即被相應的檢測線抗體攔截，顯示棕紅色檢測線“|”，同時抗載體蛋白抗體也可攔截金標結(jié)合抗原，顯示棕紅色對照線“|”，為陰性表示；如果反應膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙條已失效。
實施例一磺胺藥二項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座(11)和面板(10)，底座設有安裝試紙芯的固定槽(12)，面板設有加樣孔(8)和顯示窗(9)，顯示窗旁邊設有T1、T2和C標示。試紙芯的構(gòu)造是襯板(1)用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊(2)用玻璃纖維棉制成；金標物結(jié)合墊(3)，根據(jù)上述具體實施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標記的抗SDM和抗SM2單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應膜(4)用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2相對應，用羊抗小鼠IgG抗體制備隱形對照線“|”，3條線平行排列組合成“|||”；吸水墊(5)用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM和SM2聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座(11)上的固定槽(12)內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對應，反應膜上的2條檢測線和1條對照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2和C相對應，嵌合面板后制成試紙盒。
檢測樣品檢測樣品可為組織樣、血樣、奶樣、蛋樣、尿樣和蜂蜜樣品。
檢測樣品制備①組織樣和蛋樣將樣品勻漿后，取樣與乙腈水溶液按1∶3的比例混合，3000rpm離心10min，取上清液分別按1∶0.5～1和1∶1～2的比例加入水和乙酸乙酯混合，3000rpm離心5min，取上層液用氮氣吹干，用PBS溶解干燥物，1∶1加入異辛烷混勻，3000rpm離心5min，棄上層液，取下層液作為待測樣品。
②血樣、奶樣和尿樣檢測血樣，提取血清并用生理鹽水將其稀釋制成1∶1～10待測樣品；檢測奶樣，直接用生理鹽水將奶樣稀釋制成1∶2～10待測樣品懸液；檢測尿樣，直接取尿液作為待測樣品。
③蜂蜜樣取蜂蜜加入1～2倍生理鹽水溶解稀釋后，再按1∶1～5的比例加入乙酸乙酯，震蕩10min，3000rpm離心10min，取上層液氮氣吹干，干燥物用生理鹽水復溶作為待測樣品。
操作方法檢測時，將試紙盒平放，從加樣孔滴加待測樣品液，5～10分鐘從顯示窗判定檢測結(jié)果。
結(jié)果判定如只有C位置顯示一條棕紅色線“|”時，表示SDM和SM2檢測結(jié)果均為陽性，說明在待測樣品中含這2種待測藥物；如在T1和C位置顯示2條棕紅色線“||”時，表示SM2檢測結(jié)果為陽性，SDM檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含SM2而不含SDM；如在T2和C位置顯示2條棕紅色線“||”時，表示SDM檢測結(jié)果為陽性，SM2檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含SDM而不含SM2；如在T1、T2和C位置顯示3條棕紅色線“|||”時，表示SDM和SM2檢測結(jié)果均為陰性；如在反應膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實施例二磺胺藥二項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例一基本相同，不同之處在于用抗SDM和抗SM2的多克隆抗體替代抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例一，不再重述。
實施例三磺胺藥二項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例一基本相同，不同之處在于用SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例一，不再重述。
實施例四磺胺藥三項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座和面板，底座設有安裝試紙芯的固定槽，面板設有加樣孔和顯示窗，顯示窗旁邊設有T1、T2、T3和C標示。試紙芯的構(gòu)造是襯板用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊用玻璃纖維棉制成；金標物結(jié)合墊，根據(jù)上述具體實施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標記的抗SDM、抗SM2和抗SD單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應膜用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白、SM2-載體蛋白和SD-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2、T3相對應，用兔抗小鼠IgG抗體制備隱形對照線“|”，4條線平行排列組合成“||||”；吸水墊用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM、SM2和SD聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座的固定槽內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對應，反應膜上的3條檢測線和1條對照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2、T3和C相對應，嵌合面板后制成試紙盒。
其它包括檢測樣品制備和操作方法均同實施例一，不再重述。
結(jié)果判定如只有C位置顯示1條棕紅色線“|”時，表示SDM、SM2和SD檢測結(jié)果均為陽性，說明在待測樣品中含這3種待測藥物；如顯示1條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||”時，表示2種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外1種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含2種藥物而不含另外1種藥物；如顯示2條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||”時，表示1種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外2種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含12種藥物而不含另外2種藥物；如顯示3條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||”時，表示3種藥物檢測結(jié)果均為陰性；如在反應膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實施例五磺胺藥三項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例四基本相同，不同之處在于用抗SD、抗SDM和抗SM2的多克隆抗體替代抗SD、抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例四，不再重述。
實施例六磺胺藥三項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例四基本相同，不同之處在于用SD-載體蛋白、SDM-載體蛋白和SM2-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SD、抗SDM和抗SM2的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例四，不再重述。
實施例七磺胺藥五項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒塑料殼的構(gòu)造含底座和面板，底座設有安裝試紙芯的固定槽，面板設有加樣孔和顯示窗，顯示窗旁邊設有T1、T2、T3、T4、T5和C標示。試紙芯的構(gòu)造是襯板用硬質(zhì)塑膠條制成；樣品墊用玻璃纖維棉制成；金標物結(jié)合墊，根據(jù)上述具體實施方式
“3”所述的制備方法，制備吸附有膠體金標記的抗SDM、抗SM2、抗SD、抗SM1和抗SMD單克隆抗體的玻璃纖維棉；反應膜用硝酸纖維素膜，其上分別用偶聯(lián)SDM-載體蛋白、SM2-載體蛋白、SD-載體蛋白、SM1-載體蛋白和SMD-載體蛋白結(jié)合抗原制備隱形檢測線“|”，由樣品端依次排列并與面板上T1、T2、T3、T4、T5相對應，用羊抗兔IgG抗體制備隱形對照線“|”，6條線平行排列組合成“||||||”；吸水墊用吸水濾紙制成。將樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜、吸水墊依次相互搭接粘貼固定在襯板上，組裝成SDM、SM2、SD、SM1和SMD聯(lián)檢試紙芯。將試紙芯安裝在底座的固定槽內(nèi)，試紙芯的樣品墊和反應膜分別與面板上加樣孔和顯示窗相對應，反應膜上的5條檢測線和1條對照線分別與顯示窗旁邊的T1、T2、T3、T4、T5和C相對應，嵌合面板后制成試紙盒。
其它包括檢測樣品制備和操作方法均同實施例一，不再重述。
結(jié)果判定如只有C位置顯示1條棕紅色線“|”時，表示SDM、SM2、SD、SM1和SMD檢測結(jié)果均為陽性，說明在待測樣品中含這5種待測藥物；如顯示1條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||”時，表示4種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外1種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含4種藥物而不含另外1種藥物；如顯示2條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||”時，表示3種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外2種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含3種藥物而不含另外2種藥物；如顯示3條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||”時，表示2種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外3種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含2種藥物而不含另外3種藥物；如顯示4條棕紅色T線和1條棕紅色C線“|||||”時，表示1種藥物檢測結(jié)果為陽性，另外4種藥物檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中含1種藥物而不含另外4種藥物；如顯示5條棕紅色T線和1條棕紅色C線“||||||”時，表示5種藥物檢測結(jié)果均為陰性；如在反應膜上沒有棕紅色線顯示，則表明試紙盒已失效。
實施例八磺胺藥五項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例七基本相同，不同之處在于用抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的多克隆抗體替代抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用羊抗兔IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例七，不再重述。
實施例九磺胺藥五項聯(lián)檢金標層析試紙盒試紙盒構(gòu)造和實施例七基本相同，不同之處在于用SDM-載體蛋白、SM1-載體蛋白、SM2-載體蛋白、SD-載體蛋白和SMD-載體蛋白結(jié)合抗原替代抗SDM、抗SM1、抗SM2、抗SD和抗SMD的單克隆抗體，制備金標結(jié)合墊；用兔抗載體蛋白IgG抗體替代兔抗鼠IgG抗體在反應膜上制備隱形對照線“|”。
其它包括檢測樣品制備、操作方法和結(jié)果判定等均同實施例七，不再重述。
權利要求
1.一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設有安裝試紙芯的固定槽，面板上設有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成，反應膜用印制有隱形檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標抗體的玻璃纖維棉，金標抗體為膠體金標記的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應膜上的檢測線為2～5條相應的磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原，反應膜上的對照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或為羊抗兔IgG、或為兔抗載體蛋白IgG抗體印制，對照線和檢測線平行排列組合為“|||”，或為“||||”，或為“|||||”，或為“||||||”。
2.根據(jù)權利要求1所述的試紙盒，其特征是所述的金標抗體和相應的結(jié)合抗原形成下述的任意2～5種組合，金標抗磺胺甲基嘧啶SM1抗體，檢測線為SM1-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺二甲基嘧啶SM2抗體，檢測線為SM2-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺對甲氧嘧啶SMD抗體，檢測線為SMD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺嘧啶SD抗體，檢測線為SD-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺二甲氧嘧啶SDM抗體，檢測線為SDM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺間甲氧嘧啶SMM抗體，檢測線為SMM-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺甲噁唑SMZ抗體，檢測線為SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺異噁唑SIZ抗體，檢測線為SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺甲氧吡嗪SMP抗體，檢測線為SMP-載體蛋白結(jié)合抗原；金標抗磺胺喹噁啉SQ抗體，檢測線為SQ-載體蛋白結(jié)合抗原。
3.一種磺胺藥多殘留聯(lián)檢試紙盒，由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，塑料殼包含底座和面板，其中底座上設有安裝試紙芯的固定槽，面板上設有加樣孔和結(jié)果顯示窗，試紙芯由樣品墊、金標物結(jié)合墊、反應膜和吸水墊依次相互搭接粘貼在襯板上制成，反應膜用印制有隱形檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，其特征為金標物結(jié)合墊用吸附2～5種金標磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應膜檢測線為2～5條相應的抗某種磺胺藥的單克隆抗體或多克隆抗體，反應膜上的對照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或為羊抗兔IgG、或為兔抗載體蛋白IgG抗體印制，對照線和檢測線平行排列組合為“|||”，或為“||||”，或為“|||||”，或為“||||||”。
4.根據(jù)權利要求3所述的試紙盒，其特征是所述的金標磺胺藥-載體蛋白結(jié)合抗原和相應的磺胺藥抗體為下述的任意2～5種組合，金標SM1-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SM1抗體；金標SM2-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SM2抗體；金標SMD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMD抗體；金標SD-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SD抗體；金標SDM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SDM抗體；金標SMM-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMM抗體；金標SMZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMZ抗體；金標SIZ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SIZ抗體；金標SMP-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SMP抗體；金標SQ-載體蛋白結(jié)合抗原，檢測線為抗SQ抗體。
5.根據(jù)權利要求1或3所述的試紙盒，其特征為襯板用硬質(zhì)塑膠條，樣品墊為玻璃纖維棉；吸水墊為吸水能力較強的吸水濾紙。
6.根據(jù)權利要求1或3所述的試紙盒，其特征是所述的載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，或雞卵清白蛋白OVA，或人血清白蛋白HSA，或血藍蛋白KLH。
7.根據(jù)權利要求1或3所述的試紙盒，其特征是所述的顯示窗旁邊分別印有字母T1、T2…Tn和C，T表示檢測線，在靠近加樣孔側(cè)，C表示對照線，在遠離加樣孔側(cè)，其中n為1、2、3、4、5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種磺胺藥多殘留分析的金標層析檢測試紙盒。該試紙盒由塑料殼和試紙芯構(gòu)成，面板上設有加樣孔和結(jié)果顯示窗，反應膜用印制有隱形檢測線和對照線的硝酸纖維素膜，金標物結(jié)合墊用吸附2～5種混合金標抗體的玻璃纖維棉，反應膜上的檢測線為2～5條相應的磺胺藥－載體蛋白結(jié)合抗原，或者金標物結(jié)合墊用吸附2～5種金標磺胺藥－載體蛋白結(jié)合抗原的玻璃纖維棉，則反應膜檢測線為2～5條相應的抗某種磺胺藥的抗體，反應膜上的對照線為羊抗或兔抗小鼠IgG、或為羊抗兔IgG、或為兔抗載體蛋白IgG抗體印制。本發(fā)明的試紙盒一次加樣同時檢測多種磺胺藥物，大大節(jié)省檢測時間，具有特異性強，靈敏度高，簡便，直觀，準確，適用范圍廣，成本低，易于推廣應用。
文檔編號G01N33/52GK1888905SQ200610017998
公開日2007年1月3日 申請日期2006年6月23日 優(yōu)先權日2006年6月23日
發(fā)明者鄧瑞廣, 張改平, 李學伍, 肖治軍, 刑廣旭, 楊繼飛, 柴書軍, 李青梅, 盧曉翠 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所