專利名稱：核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測汞的方法
技術領域：
本發明涉及特殊化學分析技術，具體是核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜
檢測汞的方法。
背景技術：
汞是一種具有嚴重生理毒性的化學物質，由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使其成為目前全球最引人關注的環境污染物之一。可溶性汞離子(Hg2+)是最穩定的無機汞，對細胞具有腐蝕性和致癌性；汞離子在環境中通過微生物的作用轉化為甲基汞，可通過食物鏈富集在人體，可引起腦損傷或其他慢性疾病。因此建立一種高靈敏度、高選擇性檢測汞離子的方法在環境監控、食品安全及醫學方面具有十分重要的意義。常見的汞元素檢測方法主要是傳統的元素分析技術，包括原子吸收光譜、原子發射光譜、電感耦合等離子體質譜、原子熒光光譜，但這些分析手段在實際應用中需要昂貴的儀器，繁瑣。近年來，逐漸建立了汞離子的光學、分子探針和電化學等方法。核酸適配子(又稱適配體)是通過指數富集配體系統進化技術(SELEX)，從大容量的寡核苷酸庫中篩選出對靶分子結合具有高特異性和高結合性的核酸片段。它具有很高的親合力、高特異性、易標記等特點，已用于核酸、酶、金屬離子，以及病毒顆粒和細菌孢子等檢測。研究發現，Hg"可以穩定DNA序列中的T-T結構，形成穩定的T-Hg2+-T結合物，這一原理已用于汞離子分析，建立了靈敏度較高、選擇性好的目視比色、光度、熒光方法。 納米金具有小尺寸效應、量子效應和較好的生物相容性等特點，在納米生物分析領域得到廣泛的應用。納米金共振散射效應與免疫反應和酶催化反應等結合，發展了選擇性好和靈敏度較高的共振散射光譜分析新方法。納米金具有較強的催化活性，使其成為近期化學研究的一個熱點。基于納米金催化-金、銀、銅微粒增強技術，已有酶催化、免疫反應的光度法、電化學、表面等離子體共振、共振散射光譜分析方法報道。但未見核酸適配體修飾納米金催化菲林試劑-醛反應的氧化亞銅微粒增強共振散射光譜研究及其測定Hg"的報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測汞的方法。這種方法設備簡單，操作簡便，靈敏度高，特異性強，測定范圍寬。 本發明的原理是Hg2+適配體ssDNA序列含有多個T堿基，其與10nm的納米金結合時可形成DNA修飾的納米金AussDNA，當Hg2+與AussDNA共存時，通過T-T錯配，AussDNA與Hg2+反應生成穩定的Hg2+適配體-Hg2+復合物，與Hg2+反應的AussDNA釋放出納米金，在高濃度NaCl作用下納米金聚集，溶液顏色由紅變藍，所生成的納米金簇的粒徑較大，可經膜過濾除去。用濾液中過量的AussDNA作為納米催化晶種，催化Cu2+-糠醛的反應還原為Cu+，生成的Cu+與溶液中的Off生成CuOH，最終生成Cu20微粒，導致共振散射光強度增大，隨著Hg"濃度的增加，濾液中AussDNA微粒減少，增強作用減弱，共振散射強度降低。據此
3可建立一個適配體修飾納米金催化_氧化亞銅微粒共振散射光譜檢測Hg2+的方法。 應用核酸適配體修飾納米金檢測汞的共振散射光譜方法，包括以下步驟 (1)制備已知濃度的檢測體系在5支5mL刻度試管中，每管依次移取18 y L
0. 17iimol/L單鏈寡糖核苷酸(ssDNA、其序列為5，-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTTTGT TGTTT-3，)溶液，400 ii L pH 7. 0濃度為0. 02mol/L NaH2P04_Na2HP04緩沖溶液，375 ii L58ii g/mL納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1. 000X 10—2mol/L HgCl2標準溶液5 400 ii L，再加入22. 5 ii L 2. Omol/L的NaCl溶液，稀釋至1. 5mL，混勻，用孔徑為150nm濾膜過濾，將濾液稀釋IO倍后，留做以下測定用， 另于5支5mL的具塞刻度試管中，分別移取69iiL 0. 20mol/L CuS04溶液，75 y L
1. 2311101/11(化(:411406，該1(^(:411406溶液含6. 25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制備的濾液各80 ii L，再加入900 ii L 23. 2mmol/L糠醛溶液，定容至3. OmL，混勻，7(TC下水浴反應6min，流水快速冷卻至室溫； (2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對照體系溶液； (3)分別取按步驟(1 2)制備的標準溶液及空白對照體系溶液適量，置于石英比色皿中，用熒光分光光度計在低靈敏度、狹縫3nm、激發波長等于發射波長的條件下同步掃描，獲得同步發射光譜記錄其共振散射光譜，測定605nm波長處的共振散射光強度I6。5nm，并
測定其空白值(IJb，計算A 丄605nm =(丄605nJ b—丄605nm f (4)以不同濃度Hg2+(。與對應的共振散射強度Ale。^作圖，繪制標準曲線；
(5)制備樣品檢測體系取一定體積樣品，必要時濾過，然后用硝酸-鹽酸(體積比1 : 3)微波消化10min，取消化后的樣品一定量替換Hg2+標準溶液，按步驟(1) (3)操作，求其AI#$ (6)根據樣品測得的八1#，查標準曲線，可以求得樣品的汞含量。 本發明的優點靈敏度高，特異性強，測定范圍寬，設備簡單，操作簡便，適合測定
含汞的各種試樣，為環境監測及食品、化妝品等提供可靠的分析數據。
圖1為本發明實施例測定汞的共振散射光譜圖。 圖中a. 4. 6mmol/L CuS04+3. 08 X 10—2mol/L KNaC4H406+6. 96mmol/L糠醛+38. 57ng/mLAussDNA(以Au濃度計)+O.Onmol/L Hg2+;b. a+0. 133nmol/L Hg2+;c.a+667畫l/L Hg2+;d. a+1000翻l/L Hg2+;e. a+1333翻l/L Hg2+;f. 4. 6mmol/LCuS04+3. 08X 10—2mol/LKNaC4H406， +6. 96mmol/L糠醛
具體實施例方式
(1)制備已知濃度的測試體系準備5支5mL刻度試管，每管依次移取18iiL0. 17iimol/L單鏈寡糖核苷酸(ssDNA、其序列為5' -TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTTGTT TGTTGT TT-3')溶液，400 ii L pH 7. 0濃度為0. 02mol/L NaH2P04-Na2HP04緩沖溶液，375 iiL 58iig/mL納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1. 000X 10—2mol/LHgCl2標準溶液50、100、200、300、400ii L，再加入22. 5 ii L 2. Omol/L的NaCl溶液，稀釋至1. 5mL，混勻，用孔徑為150nm濾膜過濾，將濾液稀釋10倍后，留做以下測定用，
另于五支5mL的具塞刻度試管中，分別移取69iiL 0. 20mol/L CuS04溶液，75 y L 1.23mol/L 1(化(:411406，該1(化(:411406溶液含6. 25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制 備的濾液1 5各80 ii L，再加入900 ii L 23. 2mmol/L糠醛溶液，定容至3. OmL，混勻，70°C 下水浴反應6min，流水快速冷卻至室溫j (2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對照溶液體系-, (3)分別取按步驟(1 2)制備的標準溶液及空白對照體系溶液適量，置于石英比 色皿中，用熒光分光光度計在低靈敏度、狹縫3nm、激發波長等于發射波長的條件下同步掃 描，獲得同步發射光譜記錄其共振散射光譜，測定605nm波長處的共振散射光強度I6。8nm，并 測定其空白值(IJb，計算A (4)以不同濃度Hg"C助)與對應的共振散射強度厶16。5 作圖，繪制標準曲線，其 回歸方程為A I6。5nm = 0. 097CHg+8. 12 J (5)制備樣品的測試體系取一定體積廢水過濾，然后用硝酸-鹽酸(體積比 1 : 3)微波消化lOmin，取消化后的廢水樣lmL替換Hg2+標準溶液，按步驟(1) (3)操 作，制備樣品測試體系，并求得其AI#; (6)根據樣品測得的八1#，查標準曲線，可以求得樣品的汞含量。 驗證用本發明方法測定廢水樣品2份，用上述(1) (6)的步驟進行檢測，檢測
結果是汞含量分別為334. 8nmol/L、94. 6nmol/L，證明了本方法的可靠性。本發明實施例測定汞的線性范圍為0. 133 1333nmol/L，檢出限為0. 07nmol/L。
權利要求
核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測汞的方法，其特征是檢測方法包括以下步驟(1)制備已知濃度的檢測體系在5支5mL刻度試管中，每管依次移取18μL單鏈寡糖核苷酸，序列為5’-TTT CTT CTT TCT TCC CCC CTT GTT TGT TGT TT-3’溶液，再加入NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液、納米金溶液，搖勻，靜置5min后；五支試管分別加入1.000×10-2mol/L HgCl2標準溶液，再加入NaCl溶液，稀釋至1.5mL，混勻，用濾膜過濾，將濾液稀釋10倍后，留做以下測定用；另于5支5mL的具塞刻度試管中，分別移取CuSO4溶液、KNaC4H4O6，該KNaC4H4O6溶液含6.25mol/L NaOH，各試管分別加入按步驟(1)制備的濾液各80μL，再加入糠醛溶液，定容至3.0mL，混勻，70℃下水浴反應6min，流水快速冷卻至室溫；(2)用步驟(1)方法不加Hg2+做空白對照體系溶液；(3)分別取按步驟(1、2)制備的標準溶液及空白對照體系溶液適量，置于石英比色皿中，用熒光分光光度計在低靈敏度、狹縫3nm、激發波長等于發射波長的條件下同步掃描，獲得同步發射光譜記錄其共振散射光譜，測定605nm波長處的共振散射光強度I605nm，并測定其空白值(I605nm)b，計算ΔI605nm＝(I605nm)b-I605nm；(4)以不同濃度Hg2+與對應的共振散射強度ΔI605nm作圖，繪制標準曲線；(5)制備樣品檢測體系取一定體積樣品，必要時濾過，然后用硝酸-鹽酸(體積比1∶3)微波消化10min，取消化后的樣品一定量替換Hg2+標準溶液，按步驟(1)～(3)操作，求其ΔI樣；(6)根據樣品測得的ΔI樣，查標準曲線，可以求得樣品的汞含量。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征是所述制備已知濃度的檢測體系，每管加入 的單鏈寡糖核苷酸為0. 17 ii mol/L的18 ii L， NaH2P04-Na2HP04緩沖溶液為pH 7. 0濃度為 0. 02mol/L的400 ii L，納米金溶液為375 ii L 58 ii g/mL， HgCl2標準溶液為5 400 ii L， NaCl 溶液為2. Omol/L的22. 5 y L，濾膜的孔徑為150nm，加入的CuS04溶液為69 y L 0. 20mol/L， KNaC4H406為75 ii LI. 23mol/L，糠醛溶液為900 ii L23. 2mmol/L。
全文摘要
本發明公開了一種核酸適配體修飾納米金催化共振散射光譜檢測汞的方法，它是利用Hg2+適配體ssDNA與納米金結合形成DNA修飾的納米金AussDNA，當Hg2+與AussDNA共存時，通過T-T錯配，生成穩定的Hg2+適配體-Hg2+復合物，在高濃度NaCl作用下納米金聚集，經膜過濾除后，用濾液中過量的AussDNA作為納米催化晶種，催化Cu2+-糠醛的反應還原為Cu+，Cu+與溶液中的OH-生成CuOH，最終生成Cu2O微粒。以此制備已知汞濃度的被測體系和試劑空白體系，測兩體系在605nm處的共振散射強度，繪制標準曲線，再制備樣品檢測體系，求其ΔI樣，對標準曲線求得樣品中汞含量。其優點在于靈敏度高，特異性強，測定范圍寬，設備簡單，操作簡便，適合測定含汞的各種試樣，為環境監測及食品、化妝品等提供可靠的分析數據。
文檔編號G01N1/28GK101726473SQ20091011450
公開日2010年6月9日 申請日期2009年10月29日 優先權日2009年10月29日
發明者劉慶業, 李紀順, 梁愛惠, 溫桂清, 蔣治良 申請人:廣西師范大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
