專利名稱：反相氨基酸專用色譜柱及其紫外吸收定量測定法的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種液相色譜柱及利用該柱建立的分析測定方法，具體地說是提供一種氨基酸專用分析柱和相應的分析方法。
氨基酸傳統分析方法大多采用離子交換柱分離，然后用茚三酮顯色劑進行衍生化后再測定，設備復雜、價格昂貴，分析時間長。近十年來國外已采用鄰苯二甲醛、膽酰氯、熒光胺等進行衍生化，用反相柱進行分離，用熒光法測定，但從未報導過色譜柱的制備方法，并用尚需購買價格昂貴的熒光檢測器才能測定，且只能測定初級氨基酸，所生成衍生物一般只能保持一天到數天，穩定性較差。
本發明的目的是提供一種反相氨基酸專用色譜柱及色譜柱的制備方法，同時本發明又提供了一種利用這種專用分析柱對氨基酸進行分離和測定的方法。
本發明的反相氨基酸專用色譜柱，可選用普通液相色譜儀通用型柱子的結構，采用通常的填裝方法，裝入高鍵合量烷基鍵合柱而制成，其特征在于鍵合相可用下式表示
其中≡Sl-O-為硅膠;X為短鏈硅烷基，
，R為-CH3或-C2H5。Y為長鏈烷基-CnH2n+1，其中n為16～20。
本發明的反相氨基酸專用色譜柱的制備方法，其特征在于按下述步驟進行(1)長鏈烷基硅烷的合成利用長鏈烯烴與三氯氫硅進行合成反應生成長鏈烷基硅烷，反應可用下式表示
式中n＝16～20，上述合成反應可在高壓釜中進行，反應溫度控制在100-180℃。
(2)硅膠的前處理選用孔徑為6-10nm的硅膠，使用前用鹽酸進行酸洗處理，通常是在油浴中用稀鹽酸回流處理1-4小時，然后經干燥得處理后硅膠。
(3)鍵合相的制備將(1)制得的烷基硅烷與一定量硅膠反應，使硅膠與烷基硅烷進行鍵合，制得鍵合相，其鍵合反應為
(4)將上述鍵合硅膠進行水解，再用硅烷基鈍化，即可制得本發明作為色譜柱填料的性能穩定的鍵合相，其反應式如下
式中-R為短鏈烷基，如-CH3，-C2H5，反應產物分別用氯仿、丙硐、甲醇抽提、洗滌，再經干燥即得到分析柱填料。
(5)氨基酸分析柱的裝填選用普通液相色譜儀能用型柱子，將上述步驟制備的填料，按普通的色譜柱裝填方法即可制備本發明的氨基酸分析柱，填裝壓力以40～80MPa為最好。
具體地說本發明的制備方法，其特征在于鍵合反應在下述條件下進行反應在甲醇溶劑中進行，可加入吡啶作催化劑，反應物料比硅膠∶烷基硅烷＝100∶40～80(重量比)催化劑加入量為硅膠量的1～3%(重量)，反應在溶劑沸點進行回流2小時以上。
在鈍化反應時氯硅烷的用量應過量，一般采用硅膠∶氯硅烷＝100∶50～90(重量比)本發明的氨基酸的紫外吸收定量測試方法，在普通高效液相色譜儀上安裝上述專用色譜柱，對氨基酸進行分離和測定，其特征在于采用1-氟2，4-二硝基苯試劑，反應溫度50-80℃下將氨基酸樣品衍生化，再采用低濃度醋酸鈉水溶液及乙腈/水為流動相，并在壓力范圍為8.0～12.0MPa，流量0.5～2ml/mln，采用紫外檢測器，波長在360～365nm下進行操作，醋酸鈉濃度為30～90mmnl/L，對氨基酸進行分離和測定。
具體地說本發明的測試方法中，其氨基酸的衍生化反應的按下述方式完成配制100-500Pmnl氨基酸溶液，取1體積置于10體積棕色容量瓶中，加入1體積0.1～0.5mnl/L弱堿溶液，如碳酸氫鈉和1體積0.1～1%的1-氟-2，4-二硝基苯的乙腈溶液、混勻，在40～80℃水浴中避光反應40分鐘以上，冷卻后加入0.01～0.05mul/L磷酸二氫鉀溶液，定容至10體積，取1體積離心5～15分鐘即可取樣分析。
將上述步驟制得的反相氨基酸專用色譜柱安裝在高效液相色譜儀中，選用紫外吸收檢測器，在360～365nm進行測定，采用碳酸鈉及乙腈/水為流動相，在一般操作條件下，對近20種氨基酸的衍生物可獲得滿意的分離。
本發明的反相氨基酸專用色譜柱室溫對大多數氨基酸柱效達每米十萬理論塔板數，衍生化反應后的氨基酸衍生物非常穩定，在4℃下避光保存一個月內響應值變化小于5%，用紫外檢測器檢測，不僅能對初級氨基酸，而且可對次級氨基酸進行檢測，最小檢知量可達10fmol。
圖1，17種標準氨基酸在反相氨基酸專用色譜柱上的分離。
圖2，豬血蛋白中各氨基酸組成的分離結果。
圖3，靈芝中各種氨基酸在反相氨基酸專用色譜柱上的分離。
實施例1填料合成(1)在不銹鋼高壓釜內加入α-十八烯和三氯氫硅，加熱至120℃進行反應，取40g產物待用;
(2)選用孔徑為10nm硅膠在1.5mol/L的鹽酸中于油浴中回流4小時，在120℃下烘干8小時，冷至室溫。
(3)取(2)步驟硅膠100g，放入500ml三口瓶中，加入200ml甲苯，再加入(1)步產物40g，再加入5g吡啶，徐徐升溫至沸，回流6小時，再分別用氯仿、丙酮抽提，洗滌、干燥。
(4)將產物水解后，按100g加入80g三甲基氯硅烷的比例加入三甲基氯硅烷，再分別用氯仿、丙酮、甲醇抽提、洗滌、干燥，即得到色譜柱填料。
實施例2填料合成(1)α-十六烯和三氯氫硅在80℃下反應，取80g產物待用;
(2)取孔徑為6nm硅膠，在1.5mol/L鹽酸中回流1小時，在140℃下干燥10小時，冷至室溫;
(3)取(1)產物80g加入100g硅膠，放入500ml三口燒瓶中，加入200ml甲苯，1g吡啶，升溫至沸，回流2小時，洗滌、干燥;
(4)將產物水解后，按100g加入80g三己基氯硅烷的比例加入三己基氯硅烷，同實施例1的(4)步驟處理，即得到色譜柱填料。
實施例3填充色譜柱將5g如實施例1或2制得的填料加入12ml四氯化碳，6ml二氧六環和1ml正庚酸，超聲震蕩15分鐘，倒入勻漿缶中，以甲醇為沖洗劑在80MPa壓力下迅速將勻漿填入L250×I.D4.6mm的色譜柱中，在45MPa壓力下沖洗30mln、色譜柱即填充完畢。
實施例4氨基酸樣品的衍生化及測試配制400Pmol的標準氨基酸溶液，取1ml置于10ml棕色容量瓶中，分別加入1ml0.5mol/L的碳酸氫鈉溶液和1mL含1%1-氟-2，4-二硝基苯的光譜純乙腈溶液，在50℃水浴中避光反應60分鐘，冷卻后加入0.01mol/L磷酸二氫鉀溶液，定容至10ml，混勻，取1ml于離心過濾試管中，于4000轉/分下離心10分鐘，用取樣器取10μL，打入裝有反相氨基酸專用色譜柱的色譜儀中，譜圖見圖1。
其中1、天冬氨酸(ASP);2、谷氨酸(Glu);3、絲氨酸(Ser);4、副產物(DNP-OH);5、甘氨酸(Gly);6、蘇氨酸(Thr);7、脯氨酸(Pro);8、丙氨酸(Ala);9、精氨酸(Arg);10、纈氨酸(Val);11、蛋氨酸(Met);12、異亮氨酸(Ile);13、亮氨酸(Leu);14、色氨酸(Trp);15、苯丙氨酸(Phe);16、組氨酸(Hls);17、賴氨酸(Lys)。
實施例5豬血蛋白氨基酸組成分配取豬血蛋白配制成300Pmol溶液，同實施例4步驟衍生化，并取樣分析，即得到豬血蛋白中氨基酸的含量譜圖(見圖2)。
圖中編號同實施例4實施例6靈芝中氨基酸的測定將靈芝提取液配制成200Pmol溶液，同實施例4步驟衍生化后，取樣分析，即得到靈芝中氨基酸的含量譜圖。見圖3，圖中編號同實施例4。
實施例7將實施例4中經離心分離后的產物即氨基酸衍生物在4℃下避光保存，分別在第10天、20天、30天測定，氨基酸衍生物的響應因子其變異系數分別為1.82%、1.78%、2.13%，說明氨基酸衍生物很穩定，其變化在誤差范圍之內。
權利要求
1.一種反相氨基酸專用色譜柱，可選用普通液相色譜儀通用型柱子的結構，采用通常的填裝方法，裝入高鍵合量烷基鍵合相而制成，其特征在于鍵合相可用下式表示
其中≡Si-O-為硅膠；X為短鏈硅烷基；R為-CH3或-C2H5；Y為長鏈烷基-CnH2n+1，n為16～20。
2.一種按照權利要求1所述的反相氨基酸專用色譜柱的制備方法，其特征在于按下述步驟進行(1)長鏈烷基硅烷的合成利用長鏈烯烴與三氯氫硅進行合成反應生成長鏈烷基硅烷，反應溫度控制在100-180℃;(2)硅膠的前處理選用孔徑為6-10nm的硅膠，使用前用鹽酸進行酸洗處理，通常是在油浴中用鹽酸回流處理1-4小時，然后經干燥得處理后硅膠;(3)鍵合相的制備將(1)制得的烷基硅烷與一定量硅膠反應，使硅膠與烷基硅烷進行鍵合，制得鍵合相;(4)、將上述鍵合硅膠進行水解，再用硅烷基鈍化，即可得到本發明作業色譜柱填料的性能穩定的鍵合相，反應產物分別用氯仿、丙酮、甲醇抽提，洗滌，再經干燥得到分析柱填料;(5)氨基酸分析柱的裝填選用普通液相色譜儀通用型柱子，將上述步驟制備的填料，按普通的色譜柱裝填方法，即可制備本發明的氨基酸分析柱，填裝壓力以40-80MPa為最好。
3.一種如權利要求2所述制備方法，其特征在于鍵合反應在下述條件下進行反應在甲醇溶劑中進行，可加入吡啶作催化劑。反應物料重量比硅膠∶烷基硅烷＝100∶40～80，催化劑加入量為硅膠量的1～5%(重量)，反應在溶劑沸點進行，回流2小時以上。
4.一種如權利要求2所述制備方法，其特征在于鈍化反應時氯硅烷的用量應過量，一般采用重量比硅膠∶氯硅烷＝100∶50～90。
5.一種利用普通高效液相色譜儀采用按照權利要求1所述的專用色譜柱對氨基酸進行測定分離的紫外吸收定量測試方法，其特征在于采用1-氟-2，4-二硝基苯試劑，反應溫度50-80℃下將氨基酸樣品衍生化，再采用低濃度醋酸鈉水溶液及乙腈/水為流動相，并在壓力范圍為8.0～12.0MPa，流量0.5～2ml/mln，采用紫外檢測器，波長在360～365nm下進行操作，醋酸鈉濃度為30-90mmol/L，對氨基酸進行分離和測定。
6.一種如權利要求5所述測試方法，其特征在于氨基酸的衍生化反應按下述方式完成配制100-500Pmol氨基酸溶液，加入0.1-0.5mol/L，弱堿溶液如碳酸鈉和0.1-1%的1-氟-2，4-二硝基苯的乙腈溶液，混勻，在40-80℃水浴中避光反應40分鐘以上，冷卻后加入0.01-0.05mol/L磷酸二氫鉀溶液，離心5-15分鐘即可取樣分析。
全文摘要
一種反相氨基酸專用色譜柱及紫外吸收定量測定法，采用如下結構的填料填充色譜柱。
文檔編號G01N30/60GK1087173SQ9211187
公開日1994年5月25日 申請日期1992年11月17日 優先權日1992年11月17日
發明者商振華, 于億年, 周良模 申請人:中國科學院大連化學物理研究所
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