一種齊考諾肽及其雜質的檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于有效分離和分析齊考諾肽及其雜質的高效液相色譜（HPLC）方法。
【專利說明】一種齊考諾肽及其雜質的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用于有效分離和分析齊考諾肽及其雜質的高效液相色譜(HPLC)方法。
【背景技術】
[0002]齊考諾肽(Ziconotide)是一種鈣離子通道抑制劑，具有鎮痛的作用。齊考諾肽對那些使用阿片類及非留體類鎮痛劑無效的嚴重慢性疼痛患者會產生顯著的鎮痛作用，而且不會讓人上癮和產生抗藥性。
[0003]專利CN101709082中提及了一種固相合成齊考諾肽的制備工藝。在齊考諾肽的化學合成過程中，存在幾個關鍵的中間步驟，所以在最終產品中可能殘留相應的中間體，因此建立分離分析方法對其中間體及雜質進行質量控制是非常必要的。
[0004]齊考諾肽及其雜質的結構如下:
[0005]I)齊考諾肽
[0006]Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-GIy-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-CyS-NH2, [二硫鍵(Disulfidebridges): 1-16, 8-20, 15-25]
[0007]2)雜質 A
[0008]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0009]2)雜質 B
[0010]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-CyS-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0011]3)雜質 C
[0012]D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25]
[0013]4)雜質 D
[0014]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr- Y -Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2 [二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25]
[0015]5)雜質 E
[0016]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cy s-Arg-Ser-Gly-Ly s-Cy S-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0017]6)雜質 F
[0018]H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cy s-Arg-Ser-Gly-Ly s-Cy S-NH2 [ 二硫鍵:1-16，8-20, 15-25]
[0019]從以上各化合物結構來看，其結構非常相似，而從極性角度考慮，又有部分雜質與齊考諾肽存在較大的極性差異，因此要想在同一色譜柱上實現各組分的完全有效分離是非常困難的。[0020]無疑，上述化合物在采用不同的色譜條件時，均可以單獨的分離檢測，但選用多個色譜條件分別分離檢測在人力物力上都存在極大的浪費。因此，有必要尋找一種既能有效分離相似結構化合物又能有效檢出弱極性物質的色譜條件。本發明人通過大量研究，發現了適宜的色譜條件，可有效的分離分析以上各化合物。
【發明內容】
[0021]本發明提供了一種分離分析齊考諾肽及各雜質的高效液相色譜法，從而實現對齊考諾肽與其中間體及雜質的分離和分析測定。
[0022]本發明所說的用高效液相色譜法分析分離齊考諾肽雜質及其最終產品的方法，是選用柱色譜法，以緩沖液與有機溶劑不同比例配制的流動相A、流動相B為流動相，梯度洗脫。用該方法可以快速有效的分離分析齊考諾肽和中間體及各雜質。
[0023]在一個實施方案中，所述方法中使用的流動相的流速為流速為0.8-1.2ml/min。在一個優選的實施方案中，所述流動相的流速為1.0ml/min。
[0024]在一個實施方案中，所述方法中使用的色譜柱的填料為十八烷基鍵合硅膠填料。
[0025]在一個實施方案中，所述有機溶劑選自下列化合物:甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇。在一個優選的實施方案中，所述有機溶劑為乙腈與甲醇。在一個更優選的實施方案中，所述有機溶劑為乙腈。
[0026]在一個實施方案中，所述緩沖液選自:磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉和磷酸氫二銨緩沖液。在一個優選的實施方案中，所述緩沖液為磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉。在一個更優選的實施方案中，所述緩沖液為磷酸二氫鉀。
[0027]在一個實施方案中,所述緩沖液的pH為6-7ο在一個優選的實施方案中，所述緩沖液的PH為6.2-6.8。在另一個優選的實施方案中，所述緩沖液的pH為6.5。
[0028]在一個實施方案中，所述pH是使用三乙胺或磷酸調節。
[0029]在一個實施方案中，所述緩沖液的濃度為2-50mmol/L。在一個優選的實施方案中，所述緩沖液的濃度為10-30mmol/L。在另一個優選的實施方案中，所述緩沖液的濃度為20mmol/L。
[0030]在一個實施方案中，所述流動相A為含有0-15% (體積比)上述有機溶劑的緩沖液溶液。在一個優選的實施方案中，所述流動相A為含乙腈/緩沖液(10:90)(體積比)的溶液。在一個更優選的實施方案中，所述流動相A為含乙腈/磷酸二氫鉀緩沖液(10:90)(體積比)的溶液。
[0031]在一個實施方案中，所述流動相B為含有40 - 60% (體積比)上述緩沖液的有機溶液。在一個優選的實施方案中，所述流動相B為含緩沖液/乙腈(50:50)的溶液。在一個更優選的實施方案中，所述流動相B為含磷酸二氫鉀緩沖液/乙腈(50:50)(體積比)的溶液。
[0032]本發明的梯度可以根據流動相A、流動相B各自所含的緩沖液、有機溶劑比例不同而改變。其改變的最終依據是:
[0033]0-25分鐘時，兩相混合后流動相中的有機溶劑比例為5%_20% ;在一個優選的實施方案中，兩相混合后流動相中的有機溶劑比例為11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%。在另一個優選的實施方案中，兩相混合后流動相中的有機溶劑比例為14-16%。在另一個優選的實施方案中，在0-25分鐘期間，流動相中的有機溶劑的比例可以是變化的，例如勻速增加的；或者可以是不變的；
[0034]在25-40分鐘時間段內，逐漸增加流動相中的有機溶劑比例至25%~35%,保持10分鐘。在一個優選的實施方案中，流動相中的有機溶劑比例增加至27-32.5%，例如27%、28%和32.5%。在另一個優選的實施方案中，流動相中的有機溶劑比例增加至28%。在另一個優選的實施方案中，在25-40分鐘期間，流動相中的有機溶劑比例是勻速增加的。
[0035]然后在50-55分鐘時間段內，將有機溶劑比例逐漸降回5-15%。在一個優選的實施方案中，流動相中的有機溶劑比例降低至11.5-14%，例如11.5%、12%、14%和15%。在另一個優選的實施方案中，流動相中的有機溶劑比例降低至14%。在另一個優選的實施方案中，在50-55分鐘分鐘期間，流動相中的有機溶劑比例是勻速降低的。
[0036]在一個優選的實施方案中，當流動相A為0.01M磷酸二氫鉀水溶液(pH = 6.5):乙腈=90:10，流動相B為0.01M磷酸二氫鉀水溶液(pH = 6.5):乙腈=50:50時，可表述為下表1所示。
[0037]
【權利要求】
1.一種分離和分析齊考諾肽及各雜質的方法，包括: 在柱色譜法中，將分別以緩沖液與有機溶劑按不同比例配制的流動相A和流動相B按不同比例混合作為流動相，梯度洗脫含齊考諾肽及各雜質的樣品， 其中所述流動相A為含有0-15體積％有機溶劑的緩沖液溶液，所述流動相B為含有40-60體積％緩沖液的有機溶液； 其中所述齊考諾肽及各雜質結構如下: 1)齊考諾肽
Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2, 二硫鍵:1-16, 8-20, 15-25 ； 2)雜質A
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20, 15-25 ； 2)雜質B
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 3)雜質C
D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 4)雜質D
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr- Y -Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 5)雜質E
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25 ； 6)雜質F
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫鍵:1-16，8-20，15-25。
2.權利要求1所述的方法，其中所述柱色譜法的色譜柱填料為十八烷基鍵合硅膠填料。
3.權利要求1所述的方法，其中所述流速為0.8-1.2ml/min ;優選地，所述流速為1.0ml/min。
4.權利要求1所述的方法，其中所述有機溶劑選自下列化合物:甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇；優選地，所述有機溶劑為乙腈與甲醇；更優選地，所述有機溶劑為乙腈。
5.權利要求1所述的方法，其中所述緩沖液指由磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸二氫銨、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉或磷酸氫二銨水溶液；優選地，所述緩沖液為磷酸二氫鉀和磷酸二氫鈉；更優選地，所述緩沖液為磷酸二氫鉀。
6.權利要求5所述的方法，其中所述緩沖液的pH為至6-7;優選地，所述緩沖液的pH為6.2-6.8 ;更優選地，所述緩沖液的pH為6.5。
7.權利要求5或6所述的方法，其中所述緩沖液的濃度為2mmOl/L-50mmOl/L;優選地，所述緩沖液的濃度為10-30mmol/L ;更優選地，所述緩沖液的濃度為20mmol/L。
8.權利要求1所述的方法，其中所述流動相A為含有O- 15%的權利要求4所述有機溶劑的緩沖液溶液；所述流動相B為含有0-45%的權利要求5所述的緩沖液的有機溶液。
9.權利要求8所述的方法，其中所述流動相A為乙腈:緩沖液=10:90)的溶液，流動相B為含緩沖液:乙腈=50:50的溶液。
10.前述權利要求任一項所述的方法，其中所述梯度為: 0-25分鐘時間段內，流動相A和流動相B混合后的流動相中有機溶劑比例為5-20%，優選11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%，更優選14-16%，在此期間有機溶劑的比例可以是變化的，例如勻速增加的，或者可以是不變的； 在25-40分鐘時間段內，改變流動相A和流動相B的混合比例逐漸將有機溶劑比例增加至25% -35%,并保持10分鐘，優選27-32.5%，例如27%,28%和32.5%，更優選28% ； 在50-55分鐘時間段內，改變流動相A和流動相B的混合比例逐漸將有機溶劑比例降回 5-15%，優選 11.5-14%，例如 11.5%、12%、14% 和 15%，更優選 14% ； 優選地，所述增 加或減少均為勻速增加或減少。
【文檔編號】G01N30/88GK103884808SQ201210562697
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年12月21日 優先權日:2012年12月21日
【發明者】康旭, 宓鵬程, 馬亞平, 袁建成 申請人:深圳翰宇藥業股份有限公司
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