專利名稱：毛細管電泳柱上直流電導檢測方法
技術領域：
本發明涉及毛細管電泳直流電導檢測方法，屬于微機電系統(MEMS)和分析檢測領域。
背景技術：
毛細管電泳是基于在細長的分離通道中施加高電場的方法對溶液中的混合組分進行分析分離的方法。毛細管電泳的分離通道可以是圓形管狀通道，也可以是其他形狀的分離通道，例如通過刻蝕或其他微加工方法在片狀基材上加工而成的微通道(芯片電泳)。常用于毛細管電泳的檢測手段以光學檢測方法最為常用，例如光度法和熒光法等。對于透明材料制成的分離通道，光學檢測方法較容易實現柱上檢測(即分離通道上檢測)。但是由于環境光的干擾，檢測系統必須進行嚴格避光，因此限制了系統的開放性和電泳操作的方便性。電化學檢測法對環境光不敏感，開放性好，操作方便。常用的電化學檢測方法主要有兩種，即安培法和電導法。根據檢測電極所處的位置還可分為柱上檢測和柱端檢測兩種方式。柱端法中檢測電極系統位于分離通道的出口端，避免了在微小分離通道內(數十微米)安置電極的困難，因此成為經常采用的方法。柱端檢測需要對電極系統相對于分離通道出口的位置進行精確的定位控制。柱上檢測法具有死體積效應小，電極固定等優點。但在數十微米級的分離通道上集成微小檢測電極存在技術和條件方面的諸多限制。此外，無論是柱端法還是柱上法，毛細管電泳條件下的電化學檢測均存在電泳高壓電場對電化學檢測系統的電耦合問題，控制不當可能對電化學檢測系統造成嚴重干擾甚至損壞。
柱上電導檢測根據檢測電極與支持電解質之間的接觸方式可分為接觸型和非接觸型。非接觸型電導檢測中檢測電極與分離介質之間無直接電接觸，從而避免了電耦合問題(Electrophoresis，2001，222537)。非接觸電導檢測采用高頻交流激發源，電路系統較復雜，且對環境干擾敏感。接觸型電導檢測中檢測電極與分離介質直接電連通，根據信號激勵方式可分為主動和被動型。主動型需要專門的電導檢測激勵，通常是交變電壓，通過一支檢測電極引入，另一支檢測電極接收信號，通過檢測池對該信號源的變化進行檢測。檢測電極通常置于分離通道上。由于電耦合作用可導致檢測電極發生電解而產生電極極化，氣泡產生，電極老化等問題，直接影響電泳分離的正常進行，限制了電泳分離的性能(Electrophoresis，2001，22235；Anal Chem，2007，79870)。被動接觸電導檢測無需專門的信號激勵，直接利用電泳分離電場本身作為信號的激勵，通過對檢測區電位差的測定可實現電導檢測(Anal Chim Acta，1999，383203；Electrophoresis，2003，242174；Anal Chem，2004，763126；Electrophoresis，2004，25909；US Patent 6843901)。現有相關檢測方法存在如下問題直接將微電極定位安裝在微分離通道上很困難；電極直接與組分接觸容易產生電極老化等問題；相對于常用光刻法形成的數十微米的分離通道和機械鉆頭加工的數毫米尺度的分離通道出口，檢測通道與分離通道出口間的距離很難準確控制，檢測池的邊界難以確定；對于圓形毛細管分離通道，通過將毛細管拉長來控制檢測點位置的方法雖然不致于增加死體積，但是需要專門設備，而且導致分離通道中電場分布的變化，同時使檢測池的電位差過大，給檢測帶來困難；在電泳毛細管上制作裂紋以形成導電通路的方法對保持分離通道的完整性不利；用微加工的方法在芯片上制作位置和大小均可控的多孔導電膜的工藝條件要求很高；檢測電極與電泳電極共用或同置于分離通道出口儲液池時，由于電泳過程中電泳電極上的電解造成電極附近組成變化，加之電泳廢液的累積造成檢測電極的電位變化而影響電位差的準確測定；用電阻分壓的方法測定電位差難以使檢測回路的電流得到完全抑制，而容易導致檢測池中的電極也可能發生電極反應而影響接觸電位的穩定性。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明提供一種毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，利用微加工方法(方肇倫等，微流控分析芯片，北京科學出版社，2003年第一版)將分離通道或其一部分和檢測單元集成在同一芯片上，電泳高壓電源同時作為信號源，通過與分離通道相聯通的兩個檢測通道對分離通道上兩個給定點間(作為柱上電導檢測池)的電位降進行測量的方法對檢測池中溶液的電阻變化進行測定，從而完全避免了電極極化等問題的影響。
眾所周知，任何電極與溶液接觸均有一定的接觸電位，電位的大小與電極材料及溶液組成有關(能斯特方程)。電化學中以氫電極在標準條件下的電極電位為標準0電位對此進行度量。對于同處于一個電解質溶液中的兩支不同的電極，由于電極電位不同在電極之間產生電位差，該電位差可以用電位計進行測量，如圖1A所示。當兩支電極1，2相同時，該電位差為零。當在兩支電極之間施加電壓時，如圖1B所示，則同上系統成為電解池，根據施加電壓的大小在電極上可發生不同程度的電解反應。通常在水溶液中陽極發生析氧反應，同時氫離子的累積，pH降低；陰極發生析氫反應，氫氧根離子累計，pH增高。電解反應過程中由于電極的極化和電極附近溶液組成的變化等原因可導致電極電位的明顯變化。
毛細管電泳系統從整體上可視為一個電解池，與普通電解池不同的是陰陽極之間通過充滿支持電解質溶液的電泳分離通道相聯通，如圖2A所示。在電泳分離過程中，直流電源通過兩個電泳電極7，8在分離通道11上施加電壓，從而在分離通道中產生一定的電泳電流，兩個電極在電泳過程中均有如圖1B所示的電極電解反應。電泳過程中不同分離組分在分離通道出口儲液池10中的累積也可使溶液組成發生變化。通常采用具有一定緩沖容量的緩沖溶液3作為電泳的支持電解質以避免pH變化的影響；用定時更換的方法避免電極溶液組成變化對電泳分離的影響。若在分離通道上建立儲液池14，15，并使之與分離通道內的溶液電導通的同時又不致于對分離通道中的流動造成影響，則分離通道中對應點的電位可以通過位于儲液池14，15中電極電位確定的參比電極12，13進行測定，如圖2B所示。兩支相同的參比電極與組成相同的溶液接觸時分別建立相同的接觸電位，測得的兩個電極之間的電位差即為分離通道上對應兩個點之間的電位差。給定支持電解質條件下，一定的電泳電壓下通過分離通道的電泳電流一定，通過檢測兩點之間的電位差即可以對分離通道上兩個對應點之間溶液的導電性進行測量。由于空間上的隔離，該電位差的測量不受電泳電極電解及其所在的儲液池溶液組成變化的影響。根據歐姆定律，檢測的電位差和電泳電流相除即為檢測池溶液的電阻。通常毛細管電泳進樣帶相對很小，對分離通道中溶液的整體導電性的影響可以忽略，電泳高壓電源通常為恒壓源，分離通道中支持電解質確定，因此電泳電流恒定，則測定的電位差與電導池中溶液的電阻成正比；當電導檢測池中無導電性與支持電解質不同的組分通過時，該電位差(相當于譜圖的基線水平)與電導池長度的比值即為電場強度。如上為本發明進行毛細管電泳柱上直流電導檢測的依據和可在線進行電場強度測定的基礎。
本發明方法采用MEMS微加工方法，將分離通道或分離通道的一部分和檢測池集成在同一芯片上，檢測池由分離通道或部分分離通道和與之相連接的兩個檢測通道組成，電泳高壓電源同時用作電導檢測的驅動電路，檢測通道中注有與分離通道相同的支持電解質，兩支電泳電極兼做電導檢測的驅動電極，兩個相同的參比電極作為檢測電極分別置于檢測通道中或檢測通道出口的儲液池中，用兩個相同類型的參比電極對分離通道上對應點的電位差進行差分檢測，利用高阻抗電位計對檢測池的電位差進行檢測，記錄電位差信號隨時間變化得到電泳譜圖。
所述檢測池由分離通道或部分分離通道和與之相連接的兩個檢測通道組成，至少有兩個檢測通道與每個分離通道相連通，每兩個連接點之間形成柱上電導檢測池，檢測池位于電泳分離通道進出口之間，分離通道和檢測通道出口有儲液池。
所述檢測通道與分離通道相連，其連通點寬度等于或小于分離通道寬度0.05～500μm，兩個檢測點之間的中心距離大于連通點的寬度。
所述兩個檢測電極在所用支持電解質中有穩定且相同的接觸電位。
本發明檢測方法的具體實施在微加工方法(中國發明專利公開號CN1811421A)制備的芯片上進行。以芯片電泳的電導檢測為例，芯片的結構如圖3所示，主要由分離通道11和檢測通道17，18組成。檢測池16為分離通道的一部分，由分離通道11和兩個檢測通道17，18的連通點之間限定。檢測通道與分離通道保持電連通，而對分離通道中的電場分布及流動狀態無影響。檢測通道用于傳導檢測池兩端電位信號的同時又使被檢測組分與檢測電極之間空間上隔離。檢測池位于分離通道進出口儲液池9，10之間，通常在接近分離通道出口10一端。對于芯片電泳，電泳分離通道及進樣通道可與檢測通道同處在同一芯片上。當用圓形毛細管作為分離通道時，毛細管與芯片上的分離通道之間通過無死體積連接(Anal Chem，1999，713292)后進行電導檢測。芯片用非導電基材制成，例如玻璃或高分子聚合物等，圖4A為同時有進樣、分離和檢測系統的玻璃芯片照片，圖4B和圖4C分別為玻璃光刻法和PMMA熱壓法制備的可用于本法電導檢測的芯片檢測區的CCD放大圖。對于陣列毛細管電泳，如上檢測單元可用于每個分離通道上給定位置的電導及電場強度的檢測，每個分離通道可分別供高壓電場，也可通過共用進出口儲液池的方法共用一個高壓電源。
電極通常用絲狀惰性金屬材料制成，例如Pt絲。檢測電極可利用Pt，也可利用電化學中常見的其它參比電極。檢測電極直接置于檢測通道出口儲液池中即可。絲狀檢測電極也可直接置于檢測通道中，出口用膠封閉(參見中國發明專利申請號200610047737.4)。電進樣(Electrophoresis，2002，23782)用電極同電泳電極。檢測電極也可以置于電泳分離通道尾端的廢液池10中，但是接觸電位容易受電泳電極8上的電解和溶液組成變化的影響，如圖5A所示，而且檢測池的邊界及長度難以確定，如圖5B所示。
檢測電路系統框圖如圖6所示，電泳電極上的電壓由電泳高壓電源23提供，檢測電極12，13之間的電位差直接用高阻抗電位計24讀取。由于檢測池距離電泳地可能有一定的距離而存在一定的對地電壓，因此可在電位計24中的信號輸入和輸出之間添加隔離單元以避免對記錄單元的電沖擊。讀取的電壓差與電泳電流相除得到檢測池中溶液電阻直接相關的信號28。
典型的操作方法如下，使芯片通道系統水平放置，于通道系統中注入相同的支持電解質，使各儲液池中溶液液位相同以避免液位差不同造成的流動；將電泳電極，進樣電極及檢測電極分別插入對應的儲液池中，按通常的電泳操作方法進行進樣和分離，在分離過程中直接讀取檢測電極的電位差信號或經運算處理的電阻信號即可得到電導檢測的電泳譜圖。
本發明的有益效果是1.毛細管電泳分離系統與電導檢測系統無縫結合，電泳分離用的高壓電源同時作為電導檢測的激發源；2.利用MEMS微加工方法同時將分離通道(或其一部分)和檢測通道集成在同一芯片上，檢測池定位準確，無需通道上集成電極，檢測池的邊界條件及死體積可以得到準確的控制；3.以支持電解質溶液作為電位傳導介質，通過檢測通道引出后用位于分離通道外的參比電極對分離通道上給定點的電位進行測定，避免了檢測電極與被測組分直接接觸可能帶來的電極鈍化、污染等影響；
4.用兩支相同類型的參比電極進行差分檢測，接觸電位的影響自動消除，檢測電極與電泳電極分立避免了電泳電極上電解反應及廢液池溶液組成變化的影響；5.利用高阻抗電位計直接對檢測池的電位差進行檢測，無需電阻分壓操作，準確度高，電路簡單，最大程度地減小了檢測回路的電流，避免了檢測電極的極化對檢測準確度的影響；6.所得電位差信號既可直接用于電泳過程中的電導檢測，還可用于分離通道中電場強度的在線監測，結合電泳電流可直接得到檢測池中樣品溶液的電導或電阻值。
圖1A-電位差檢測示意圖，圖1B-電解池反應示意圖，圖2A-毛細管電泳系統示意圖，圖2B-毛細管電泳柱上直流電導檢測示意圖，圖3電導檢測芯片通道結構示意圖，圖4A-集成電導檢測的芯片電泳芯片圖，圖4B-玻璃檢測芯片CCD放大圖，通道寬度100um，圖4C-聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片CCD放大圖，通道寬度70微米，圖5A-檢測池及分離通道尾端示意圖，圖5B-玻璃檢測芯片檢測池與尾端廢液池部分CCD圖，圖6檢測電路系統示意圖，圖7電位差與電泳電流的關系曲線圖，圖8A-電位差隨電泳電壓階越變化曲線圖，圖8B-電位差與場強之間的關系曲線圖，圖9K+和Na+離子連續5次進樣分離電泳電導檢測譜圖，峰1為K+，峰2為Na+，峰3為系統峰，電泳電壓1961V，圖10不同電泳電壓條件下相對電阻電泳電導檢測譜圖(背景支持電解質的相對電阻為1)，電泳電壓分別為1961(實線)；1555(虛線)；808V(淺色線)，圖11K+的電泳電導檢測校正曲線，2mM Tris-HCl pH 8.7緩沖體系，圖12電泳譜圖，峰1為15uM K+，峰2為系統峰，2mM Tris-HCl，pH 8.7，分離電壓352V，圖13毛細管與芯片連接示意圖，圖14陣列毛細管電泳電導檢測方法示意圖，
圖中1，2電極；3支持電解質溶液；4容器；5電位計；6直流電源；7，8電泳電極；9分離通道進口儲液池；10分離通道出口儲液池；11分離通道；12，13檢測電極；14，15檢測電極儲液池；16柱上電導檢測池；17，18檢測通道；19芯片；20樣品儲液池；21樣品廢液池；22組分累積物及電泳電極電解產物；23電泳高壓電源；24高阻抗電位差計；25電流計；26除法器；27檢測池電位差信號；28檢測池電阻或電導信號；29毛細管。
具體實施例方式
例1以圖3所示的芯片電泳的電導檢測為例敘述如下，實物芯片照片見圖4A。該芯片用玻璃光刻和高溫封合方法制備(參見中國發明專利公開號CN1811421A)，分離通道總長53mm，寬度100um，深30um；檢測通道長5mm，檢測池(參見圖4B)長300微米，檢測通道15距分離通道尾端出口10的邊沿約500um；樣品引入通道長度5mm，雙T結構之間距離300um。微通道出口用直徑1.5mm金剛砂鉆頭加工而成，用于引入支持電解質。在通道出口用環氧膠粘接內徑約5mm的塑料環構成儲液池。用真空或加壓的方法在微通道系統中灌注10mM pH的8.7Tris-HCl緩沖溶液，所用的電極均為直徑約1mm的Pt絲電極。電泳高壓電源(沈陽瑞馳科技有限公司研制)的電壓輸出大小和時間由計算機程序控制，輸出的電壓及對應的電流值由LED數碼顯示。信號檢測單元由包括ISO122隔離放大器的高阻抗電位計測量，電位差輸出信號經DAQ卡(PCI 1711，Advantech)和LabView(Ver 5.0，National Instrument，USA)編寫的程序記錄。
用本發明方法測得的電壓差與電泳電流關系曲線如圖7所示，二者之間有很好的線性關系，表明本發明方法構建的柱上電導檢測池的電學行為符合歐姆定律，由此計算得到的檢測池中溶液的電阻值為472kΩ。電泳電壓進行時間程序變化時得到電壓降與時間變化曲線(圖8A)及電壓降與分離通道電場強度的關系(圖8B)。由于本法構建的電導檢測系統的檢測回路無電流通過，即檢測電極上無電解發生，因此兩個檢測電極的接觸電位相同，直接檢測到的電位差即為電導檢測池的電壓降，加之兩個檢測通道之間的柱上電導檢測池邊界明確，因此與電場強度之間也有良好的線性關系，線性相關系數0.9999，從而成為準確測定電場強度的基礎。電導池的電壓降信號隨電泳電壓變化快速響應是進行快速電泳分離檢測的重要條件。可見此檢測系統的準確度和響應速度均滿足高速毛細管電泳分離和檢測的需要。
將芯片電泳進樣池中的緩沖溶液換為濃度均為5mM的KCl和NaCl樣品混合溶液，利用電夾流進樣法進樣(Electrophoresis，2002，23782)后進行電泳分離，連續5次進樣分離檢測得到的毛細管電泳電導檢測譜見圖9，由圖可見，K+和Na+得到了有效和重現的分離和檢測。被分離組分離子的導電性大于支持電解質的導電性，因此電壓差信號減小從而表現為負峰。該電泳譜圖是通過直接記錄檢測池電壓降信號隨電泳時間的變化得到的。圖10是相同樣品相同進樣條件下改變電泳電壓得到的電泳譜圖的疊加，相對電阻信號是電壓降與電泳電流相除后歸一的結果(支持電解質的相對電阻為1)。電泳高壓的增大使峰的遷移時間減小，分離速度顯著加快，1961V電泳電壓下給定的兩個離子的分離在20秒內完成。雖然不同電壓下的遷移時間不同，但同一組分峰的相對電阻信號強度基本保持不變。表1為電泳電導檢測譜圖峰高和遷移時間的重現性，給定條件下峰高的變異系數小于5％，遷移時間的變異系數小于0.5％。
表1峰高及保留時間重現性(n＝5)
注50mM Tris-H3PO4，pH 8.5，5mM K+and Na+混合標準溶液，分離電壓300V。
圖11為K+的電泳電導檢測校正曲線，由圖可見校正曲線的線性范圍優于兩個數量級，線性相關系數優于0.999。未借助任何濃縮手段取得了15uM(K+)的撿出限(S/N＝3)，對應的譜圖參見圖12。
例2圖13給出了用于圓形毛細管作為電泳分離通道時進行本法電導檢測時的連接示意圖，將電泳用毛細管的尾端與芯片上的通道進行無死體積連接后即可進行柱上電導檢測。
例3圖14給出了用于芯片陣列電泳時的柱上電導檢測的一種實施方法，多個分離通道共用一個高壓電源，通過電泳電極7，8和公共進出口儲液池9，10施加高壓電場于每個分離通道上，通過每個分離通道上的檢測通道和與檢測通道聯通的檢測電極分別對各自柱上電導檢測池的電位差進行檢測。
權利要求
1.一種毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于利用MEMS微加工方法，將分離通道或分離通道的一部分和檢測池集成在同一芯片上，檢測池由芯片上的分離通道和與之相連接的兩個檢測通道組成，電泳高壓電源同時用作電導檢測的驅動電路，檢測通道中注有與分離通道相同的支持電解質，兩支電泳電極兼做電導檢測的驅動電極，兩個相同的參比電極作為檢測電極分別置于檢測通道中或檢測通道出口的儲液池中，用兩個相同類型的參比電極對檢測池的電位差進行差分檢測，利用高阻抗電位計對檢測池的電位差進行檢測，記錄電位差信號隨時間變化得到電泳譜圖。
2.如權利要求1所述的毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于所述檢測池由分離通道或部分分離通道和與之相連接的兩個檢測通道組成，至少有兩個檢測通道與每個分離通道相連通，每兩個連接點之間形成柱上電導檢測池，檢測池位于電泳分離通道進出口之間，分離通道和檢測通道出口有儲液池。
3.如權利要求2所述的毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于所述檢測通道與分離通道相連，其連通點寬度(0.05～500μm)等于或小于分離通道寬度，兩個檢測點之間的中心距離大于連通點的寬度。
4.如權利要求1所述的毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于所述兩個檢測電極在所用支持電解質中有穩定且相同的接觸電位。
5.權利要求1所述毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于當用于毛細管進行電泳分離檢測時，將電泳用毛細管的尾端與芯片上的通道進行無死體積連接后即可進行柱上電導檢測。
6.權利要求1所述毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，其特征在于該方法用于陣列毛細管電泳的電導檢測時，多個分離通道共用一個高壓電源，通過電泳電極和公共進出口儲液池施加高壓電場于每個分離通道上，通過每個分離通道上的檢測通道和與檢測通道聯通的檢測電極分別對各自柱上電導檢測池的電位差進行檢測。
全文摘要
一種毛細管電泳柱上直流電導檢測方法，屬于微機電系統和分析檢測領域。本發明采用MEMS微加工方法，將分離通道或分離通道的一部分和檢測池集成在同一芯片上，檢測池由芯片上的分離通道和與之相連接的兩個檢測通道組成，電泳高壓電源同時用作電導檢測的驅動電路，檢測通道中注有與分離通道相同的支持電解質，兩支電泳電極兼做電導檢測的驅動電極，兩個相同的參比電極作為檢測電極分別置于檢測通道中或檢測通道出口的儲液池中，用兩個相同類型的參比電極對檢測池上的電位差進行差分檢測，利用高阻電位計對檢測池的電位差進行測量，記錄電位差信號隨時間變化得到電泳譜圖。本發明檢測池定位準確，準確度高，電路簡單。
文檔編號G01N27/06GK101038268SQ20071001102
公開日2007年9月19日 申請日期2007年4月19日 優先權日2007年4月19日
發明者吳志勇, 方芳 申請人:東北大學
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