一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于：將步驟①中的樣品包埋于經固定液預處理的豆制品中，與現有技術相比，本發明的優點在于：將豆制品可以作為中華鱉胚胎期性腺組織的預包埋材料，其來源廣泛且成本很低，經過預包埋后，胚胎期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影響后續的組織包埋和切片，本發明避免了傳統方法的不足，特別是避免了中華鱉早期性腺組織小不容易操作和觀察的缺點；另外，由于預包埋性腺的位置固定并且可以一次處理多個性腺組織，這樣有利于大規模進行切片制作和分析，也特別適合于針對不同個體進行的研究。
【專利說明】一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種石蠟切片的制作方法，尤其涉及一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法。
【背景技術】
[0002]爬行動物的原始生殖細胞，經過分化、遷移進入生殖嵴或原始性腺分化成生殖細胞，而原始生殖細胞的起源要追溯到胚胎早期發育階段，不同動物原始生殖細胞進入生殖嵴的遷移方式不同，在生殖嵴(生殖腺原基)發生時，原始生殖細胞在生殖嵴中進行分化，原始生殖細胞在遷移過程中不斷分裂增殖，隨胎齡增長，性別發生分化，生殖嵴分化為雄性的睪丸或雌性的卵巢，原始生殖細胞形成精子或卵子。
[0003]中華鳘(Pelodiscus sinensis),又稱甲魚、王八、水魚、元魚、團魚、腳魚和老鳘，隸屬脊椎動物亞門(Vertebtata)、爬行綱(Reptilia)、龜鳘目(Chelonia)、鳘科(Trionychidae),廣泛分布于我國除寧夏、新疆、青海及西藏外的其它各省，以長江流域和華南地區為多見，是我國養殖最廣泛的水生爬行動物，具有重要的經濟和藥用價值；國外分布于日本、朝鮮和越南。中華鱉營養豐富，肉味鮮美，又是珍貴的藥材，其成分含動物膠、角蛋白、維生素D及碘等，具有滋陰清熱，平肝益腎、破結軟堅及消淤功能。鱉頭、甲、肉、膽、血等可入藥。研究中華鱉原始生殖細胞的起源、遷移以及性腺分化發育的機制，可為中華鱉的生產活動尤其是雄性化苗種選育提供可靠的理論依據和技術指導。
[0004]但是，由于中華鱉自孵化開始，至最初的原始生殖細胞開始遷移、生殖嵴形成、性腺開始分化、精巢或卵巢形成，分別需要孵化至第3、5、16和22天。在胚胎期以及出殼后3月之內，雌性和雄性性腺在外形上非常相似，難以用肉眼來判斷。因此，用組織學方法就成為了一種簡單而可靠的研究手段。另外，中華鱉胚胎早期性腺分化和性別決定的機理研究還少有報道。因此，通過常規石蠟組織切片的方法為詳盡研究中華鱉胚胎早期性腺分化和性別決定提供了可靠的條件。但由于中華鱉早期性腺體積微小，采用傳統的石蠟切片操作過程中，通常會出現如下問題:(1)性腺組織顏色淺，在組織透明后更加不易被觀察到，很容易丟失；(2)操作過程中容易使性腺損傷，從而破壞了性腺的完整性；(3)性腺組織體積小，不容易操作。為了解決這些問題，就需要對傳統的石蠟切片技術作進一步的改進。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術現狀而提供一種方法簡單易行并能夠最大程度地保持性腺的完整性的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法。
[0006]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于:將步驟①中的樣品包埋于經固定液預處理的豆制品中。
[0007]具體地，所述豆制品的預處理包括如下步驟:先將豆制品進行切塊處理，切成厚度為3mm?2cm的方型平板狀,然后再切成截面積為0.5cm2?6cm2的細條,用固定液固定6h~96h后在0.1%~10%的鹽酸溶液中浸泡0.5h~96h,最后在流水中沖洗后浸泡于50%~80%的酒精溶液中。
[0008]進一步地,所述步驟①~⑤的具體處理如下:
[0009]①樣品固定:收集中華鱉胚胎發育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復合體，將取出的復合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h~24h之后轉移到50%~80%酒精溶液中保存；
[0010]②脫水與透明程序:將步驟①的中華鱉性腺預包埋于經固定液預處理的豆制品中并用梯度乙醇脫水；先后米用70%乙醇浸泡Imin~60min、80%乙醇浸泡Imin~60min、90%乙醇浸泡30s~SOmiru lOO1^乙醇浸泡Imin~60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s~40min,再用二甲苯浸泡處理20s~40min,使之透明；
[0011]③透臘和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石臘過渡處理30s~IOmin, 56°C~70°C熔點的石蠟透蠟20min~40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進行包埋；
[0012]④切片和烤片:用切片機切片，切片厚度控制在4μπι~1511111，經351:~451:水浴中進行展片，載玻片撈片后放置于35°C~40°C烤片機上進行烤片固定；
[0013]⑤染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色IOs~5min伊紅染色5s~5min ;然后用中性樹膠封片。
[0014]在進行所述步驟⑤染色之前還進行脫蠟復水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin~15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin~3min ;復水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s~30min、90%乙醇浸泡30s~30min、70%乙醇浸泡30s~30min、50%乙醇浸泡30s~30min、最后用流水沖洗。
[0015]進一步地，所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明礬溶于200mL蒸餾水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
[0016]進一步地，所述的伊紅染液為I %的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
[0017]進一步地，所述步驟①固定液為4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液。
[0018]作為優選，所述豆制品為硬度較高的豆腐或素雞。
[0019]與現有技術相比，本發明的優點在于:將豆制品作為中華鱉胚胎早期性腺組織的預包埋材料，其來源廣泛且成本很低，經過預包埋后，胚胎早期性腺可以被很好地包裹在豆制品中，不影響后續的組織包埋和切片。本發明避免了傳統方法的不足，特別是避免了中華鱉早期性腺組織小不容易操作和觀察的缺點；另外，由于預包埋性腺的位置固定并且可以一次處理多個性腺組織，這樣有利于大規模進行切片制作和分析，也特別適合于針對不同個體進行的研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為本發明實施例1中包埋于豆腐中的中華鱉性腺的圖片；
[0021]圖2為本發明實施例1中性腺組織被完整地包埋進豆腐中的切片；
[0022]圖3為本發明實施例1中豆腐中的一個孔穴和在該孔穴性腺組織的切片；
[0023]圖4為圖3中央部分的局部放大圖；
[0024]圖5為圖4中央部分的放大圖；[0025]圖6為本發明實施例1中豆腐基質的HE染色圖。
【具體實施方式】
[0026]以下通過結合附圖、序列表及實施例對本發明作進一步說明。
[0027]首先配制蘇木精染液、伊紅染液和福爾馬林、波恩氏固定液。
[0028]蘇木精染液:先稱取鉀明礬20g溶于200mL蒸餾水中，邊加熱邊攪拌，再稱取蘇木精1.0g溶于IOmL無水乙醇，邊加熱邊攪拌，待鉀明礬和蘇木素溶解后，混和二溶液，加熱至沸騰(89-91°C)，然后稱取0.51g HgO緩緩加入沸騰的混合液中，邊加入邊攪拌使溶解，以防產生大量氣泡，最后待溶解后使其稍降溫置于冷水中，有少許HgO結晶，使用前濾紙過濾，避光保存。
[0029]伊紅酒精染液:將Ig伊紅溶于99mL70%的乙醇中即得到伊紅染液。
[0030]福爾馬林溶液:量取甲醛lOOmL，加入磷酸二氫鈉6.5g，溶解后加蒸餾水補足IOOOmL0
[0031 ] 波恩氏液:苦味酸飽和水溶液液75mL，甲醛(37%?40% ) 25mL,冰醋酸5mL，混合。
[0032]4%多聚甲醛:按IOOmL配比為:多聚甲醛4g，0.1M PBS (pH=7.4) 80mL，加熱至60°C水浴溶解，邊攪拌邊滴加IM Na0H2mL溶液至澄清，之后添加IM HC12mL左右，調節pH值后定容為lOOmL。(現用現配以防多聚甲醛聚合)
[0033]實施例1
[0034]1、豆制品的預處理和固定
[0035]豆制品采用硬度較高的豆腐，大塊豆腐先進行切塊處理，切成厚度為Icm的方型平板狀，之后再切成截面積大約Icm2的細條，輕輕交叉堆疊放置于可密封塑料盒中。用4%的多聚甲醛固定液固定6h，之后在1%的鹽酸溶液中浸泡0.5h，在流水中沖洗后浸泡于70%的酒精溶液中。
[0036]2、成型和打孔
[0037]把預處理好的條狀豆制品切成合適的厚度，用硬質毛細管進行打孔處理，其中孔的大小可以用不同直徑和形狀的毛細管或管狀物進行控制，管壁不要追求切割的圓滑，不規則的形狀有利于后期對性腺的固定。
[0038]3、中華鱉胚胎期性腺的分離和預包埋
[0039]取中華鱉胚胎，用眼科剪刀打開腹腔后，用鑷子取出“性腺-中腎-腎上腺”復合物，在組織固定5h后置于70%酒精溶液中短期存放，用裝上洗耳球的毛細管穿過打孔后的豆制品，在擠壓洗耳球后，吸取性腺組織，之后把毛細管向后回抽。性腺組織在通過孔穴時受到孔壁的擠壓，此時釋放性腺組織。這樣性腺組織就被包埋進豆制品中。在組織的投放中，注意性腺擺放的方向和深淺，盡量保證性腺所處的位置一致(如圖1)，圖1為包埋于豆腐中的中華鱉性腺，從圖1我們可以看到性腺組織可以被完整地包埋進豆制品中。
[0040]4、石蠟組織切片的制作和觀察
[0041]①脫水與透明程序:將包埋于豆腐中的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇浸泡20min、80%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡lOmin、100%乙醇浸泡IOmin ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20min,再用二甲苯浸泡處理20min,使之透明；[0042] ②透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理30s，60°C熔點的石蠟透蠟20min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進行包埋；
[0043]③切片和烤片:用切片機切片，切片厚度控制在1(^!11，經401:水浴中進行展片，載玻片撈片后放置于35°C烤片機上進行烤片固定；
[0044]④脫蠟復水:先用二甲苯浸泡3min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理2min ;復水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡10min、90%乙醇浸泡10min、70%乙醇浸泡10min、50%乙醇浸泡lOmin、最后用流水沖洗。
[0045]⑤染色、封片與觀察:染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色2min伊紅染色3min;然后用中性樹膠封片，封片時輕壓蓋玻片趕出樹膠內氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位，影響觀察，待樣片風干后用刀片刮去多余的樹膠。染色后的結果見圖2~6所示，從圖2~6我們可以看到性腺組織的切片組織保持完整，并且從圖6可以看出豆腐的染色背景均一。
[0046]實施例2
[0047]1、豆制品的預處理和固定
[0048]豆制品采用硬度較高的素雞，大塊素雞先進行切塊處理，切成厚度為2cm的方型平板狀，之后再切成截面積大約2cm2的細條，輕輕交叉堆疊放置于可密封塑料盒中。用福爾馬林固定液固定24h，之后在7%的鹽酸溶液中浸泡5h。在流水中沖洗后浸泡于80%的酒精溶液中。
[0049]2、成型和打孔
[0050]把預處理好的條狀豆制品切成合適的厚度，用硬質毛細管進行打孔處理，其中孔的大小可以用不同直徑和形狀的毛細管或管狀物進行控制，管壁不要追求切割的圓滑，不規則的形狀有利于后期對性腺的固定。
[0051]3、中華鱉胚胎期性腺的分離和預包埋
[0052]取中華鱉胚胎，用眼科剪刀打開腹腔后，用鑷子取出“性腺-中腎-腎上腺”復合物，在組織固定IOh后置于80%酒精溶液中短期存放，用裝上洗耳球的毛細管穿過打孔后的豆制品，在擠壓洗耳球后，吸取性腺組織，之后把毛細管向后回抽。性腺組織在通過孔穴時受到孔壁的擠壓，此時釋放性腺組織。這樣性腺組織就被包埋進豆制品中。在組織的投放中，注意性腺擺放的方向和深淺，盡量保證性腺所處的位置一致。
[0053]4、石蠟組織切片的制作和觀察
[0054]①脫水與透明程序:將包埋于素雞中的中華鱉性腺用梯度乙醇脫水；先后采用70%乙醇浸泡30min、80%乙醇浸泡30min、90%乙醇浸泡20min、100%乙醇浸泡20min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理30min,再用二甲苯浸泡處理30min,使之透明；
[0055]②透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理10min，70°C熔點的石蠟透蠟40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進行包埋；
[0056]③切片和烤片:用切片機切片，切片厚度控制在6 μ m，經37°C水浴中進行展片，展平后用載玻片撈片，然后放置于40°C烤片機上進行烤片固定；
[0057]④脫蠟復水:先用二甲苯浸泡3min，再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理3min ;復水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡20min、90%乙醇浸泡20min、70%乙醇浸泡20min、50%乙醇浸泡20min、最后用流水沖洗。
[0058]⑤染色、封片與觀察:染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色3min伊紅染色2min;然后用中性樹膠封片，封片時輕壓蓋玻片趕出樹膠內氣泡，注意壓片時用力要均勻，不宜用力過大，以免壓壞蓋玻片或使樣品移位，影響觀察，待樣片風干后用刀片刮去多余的樹膠。
[0059]實施例3
[0060]在豆制品的預處理和固定的步驟中用波恩氏液固定，其余步驟與實施例1相同。
【權利要求】
1.一種中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，包括①樣品固定、②脫水與透明程序、③透蠟和包埋、④切片和展片、⑤染色與封片，其特征在于:將步驟①中的樣品包埋于經固定液預處理的豆制品中。
2.根據權利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述豆制品的預處理包括如下步驟:先將豆制品進行切塊處理，切成厚度為3mm?2cm的方型平板狀，然后再切成截面積為0.5cm2?6cm2的細條,用固定液固定6h?96h后在0.1%?10%的鹽酸溶液中浸泡0.5h?96h，最后在流水中沖洗后浸泡于50%?80%的酒精溶液中。
3.根據權利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述步驟①?⑤的具體處理如下: ①樣品固定:收集中華鱉胚胎發育中后期胚胎的性腺-中腎-腎上腺的復合體，將取出的復合體立即投入到固定液中固定，固定0.5h?24h之后轉移到50?80%酒精溶液中保存； ②脫水與透明程序:將步驟①的中華鱉性腺預包埋于經固定液預處理的豆制品中并用梯度乙醇脫水；先后米用70%乙醇浸泡Imin?60min、80%乙醇浸泡Imin?60min、90%乙醇浸泡30s?30min、100%乙醇浸泡Imin?60min ;然后用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理20s?40min,再用二甲苯浸泡處理20s?40min,使之透明； ③透蠟和包埋:用體積比為1:1的二甲苯:石蠟過渡處理30s?10min，56°C?70°C熔點的石蠟透蠟20min?40min，2次；將脫水透蠟后的組織樣品進行包埋； ④切片和烤片:用切片機切片，切片厚度控制在4μπι?15μπι，經35°C?45°C水浴中進行展片，載玻片撈片后放置于35°C?40°C烤片機上進行烤片固定； ⑤染色與封片:染色采用伊紅-蘇木精復染方法，其中用蘇木精染色IOs?5min伊紅染色5s?5min ;然后用中性樹膠封片。
4.根據權利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:在進行所述步驟⑤染色之前還進行脫蠟復水，其中脫蠟步驟具體為:先用二甲苯浸泡Imin?15min,再用體積比為1:1的無水乙醇:二甲苯過渡處理Imin?3min ;復水步驟具體為:先后采用100%乙醇浸泡30s?30min、90%乙醇浸泡30s?30min、70%乙醇浸泡30s?30min、50%乙醇浸泡30s?30min、最后用流水沖洗。
5.根據權利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述的蘇木精染液配方為:lg蘇木精溶于IOOmL無水乙醇中，20g明帆溶于200mL蒸懼水中，兩液混合，加熱沸騰3min，稍冷卻加入0.51g氧化汞，溶解后即得到蘇木精染液。
6.根據權利要求3所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述的伊紅染液為I %的伊紅溶液，用70%乙醇溶解。
7.根據權利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述步驟①固定液為4%的多聚甲醛、福爾馬林或波恩氏液。
8.根據權利要求1所述的中華鱉早期性腺石蠟切片的制作方法，其特征在于:所述豆制品為硬度較高的豆腐或素雞。
【文檔編號】G01N1/28GK103954484SQ201410132532
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月2日 優先權日:2014年4月2日
【發明者】李彩燕, 錢國英, 王偉, 趙彩勝, 葛楚天, 尹尚軍, 樸龍斗 申請人:浙江萬里學院
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