檢測人pgii蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及檢測人PGII蛋白的熒光免疫層析試紙及其制備方法。所述試紙通過雙抗體夾心法檢測人PGII蛋白，所述雙抗體夾心法采用標記有熒光微球的第一PGII單克隆抗體作為捕獲抗體，所述第一PGII單克隆抗體來源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的一者；并且所述雙抗體夾心法采用第二PGII單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGII單克隆抗體來源于序列表SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的序列中的另一者。本發明的熒光免疫層析試紙操作簡便、快速、檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好。
【專利說明】檢測人PGI I蛋白的巧光免疫層析試紙及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于多膚化學和免疫學領域，具體涉及人胃蛋白酶原II (PGII)抗原表位 膚、用該抗原表位膚制備的PGII特異性抗原和相應的單克隆抗體或多克隆抗體、所述抗體 在制備人PGII體外診斷試劑盒上的用途，人PGII體外診斷試劑盒，W及一種用于定量檢測 待測物中人PGII蛋白的英光免疫層析試紙及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 胃蛋白酶原（PG)是胃液中胃蛋白酶的無活性前體。人胃蛋白酶原按其電泳遷移 率由快至慢，可分為PG1至PG7走種同工酶原，并且根據其生化性質、免疫原性、細胞來源W 及組織內分布可分為PGI和PGII兩個亞群。走種同工酶原中的PG1至PG5免疫原性近似， 稱為胃蛋白酶原I (PGI)，其主要由胃腺的主細胞和黏液頸細胞分泌；PG6至PG7被稱為胃 蛋白酶原II (PGII)，除了由胃體和胃底黏膜的泌酸腺的主細胞分泌外，泌酸腺的黏液頸細 胞、賞口腺和胃竇的幽口腺的黏液細胞W及十二指腸上段的化unner腺也能產生PGII。胃 幾乎是PG的唯一來源，并且在分泌階段的分泌量會發生變化。血清PGI和PGII反映了胃 粘膜不同部位的分泌功能。合成后的PG大部分進入胃腔，在酸性胃液作用下活化成胃蛋白 酶，只有少量PG (約1%)透過胃黏膜毛。因此，血清PG濃度可W反映其分泌水平。正常人 血清中的PGI是PGII的6倍，當胃黏膜發生病理變化時，血清PG含量也隨之發生改變。
[0003] 血清PG含量與幽口螺桿菌（HP)感染、慢性胃炎、胃癌等相關。在不同胃部疾病中， 血清PGI、PGII和PGI/PGII的值發生相應變化，其升高、降低還是不變并不一致，作為診斷 或治療結果指標的靈敏度和特異度也各不相同。因此，對于不同胃部疾病，血清PGI、PGII 和PGI/PGII的值也有不同的判斷標準。
[0004] 胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其病死率居各種惡性腫瘤之首，其早期診斷、早 期治療成為提高患者生存質量、降低病死率的唯一途徑。國內外學者對胃癌患者血清PG變 化作了大量的研究發現；當患胃癌時，血清PGI水平降低，PGII水平基本保持正常或升高， 進而，測定血清PGI的水平和PGI/PGII的比值有助于胃癌的鑒別診斷，過低的PGI和PGI/ PGII應警惕早期胃癌。由于血清PG的含量直接反映胃黏膜的功能，因此胃癌患者血清PGI 水平明顯下降，表明胃癌患者胃黏膜分泌能力下降。80% W上的胃癌伴有萎縮性胃炎，而萎 縮性胃炎可導致胃黏膜主細胞丟失，從而影響其分泌功能；胃癌患者血清PGI水平明顯下 降與胃癌患者胃黏膜萎縮、腸化從而分泌降低有關。因此血清PGI及PGI/PGII明顯下降對 監測早期胃癌具有重要的臨床意義，可有效應用于胃癌高發區人群的初步篩查。PG檢測作 為非侵入性方法，可降低胃病患者或胃癌高危人群檢查的痛苦，并且簡便、經濟，具有重大 意義。
[0005] 檢測血清中的PGII水平的最理想的方法是免疫測定。因此，尋找合適的具有免疫 原性的PGII抗原表位膚、制備特異性的PGII抗原及抗體即成為了重點。
[0006] 英光免疫層析方法測血液中的待測物操作簡便、快速，只需10分鐘就能完成樣品 檢測，并且檢測范圍寬，靈敏度好，能夠迅速及時地幫助診斷病情，監測預后。中國專利申 請No. 200910117820. 8公開了一種英光微球免疫層析試紙條的制備方法及定量檢測方法； 中國專利申請No. 200910047352. 1公開了一種英光免疫層析試紙及其制備方法和應用。然 而，目前還沒有針對人PGII蛋白的英光免疫層析試紙。
【發明內容】
[0007] 為解決上述現有技術中所存在的問題，本發明提供了一種用于定量檢測待測物中 人PGII蛋白的英光免疫層析試紙及其制備方法。
[0008] 具體而言，本發明提供了：
[0009] 一種用于定量檢測待測物中人PGII蛋白的英光免疫層析試紙，該試紙通過雙抗 體夾也法檢測所述人PGII蛋白，其中：
[0010] 所述雙抗體夾也法采用標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體作為捕獲抗體， 所述第一 PGII單克隆抗體來源于人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的一者；并且
[0011] 所述雙抗體夾也法采用第二PGII單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGII單克 隆抗體來源于人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的另一者；
[001引所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)分別為：
[0013] (1) Lys-Lys-Phe-Lys-Ser-Ile-Arg-Glu-T虹-Tyr ;
[0014] (2)Tyr-Thr-Pro-Ser-Arg-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-T虹-Leu-Gln-Leu-Pro-Gl u-LySn
[0015] 優選地，所述第一 PGII單克隆抗體是由第一 PGII抗原制備而成的，該第一 PGII 抗原是通過使所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯制備而成的；并 且
[0016] 所述第二PGII單克隆抗體是由第二PGII抗原制備而成的，該第二PGII抗原是通 過使所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯制備而成的。
[0017] 優選地，所述英光微球的粒徑為320皿至400皿。
[0018] 優選地，所述英光微球上的英光物質為異硫氯酸英光素、四己基羅丹明、四甲基異 硫氯酸羅丹明或X-羅丹明，其中優選為X-羅丹明；所述英光微球的微球材料為聚苯己帰、 聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋的共聚物。
[0019] 優選地，所述英光微球的激發波長為350?600皿，優選為390皿；發射波長為 500 ?700nm,優選為 615nm。
[0020] 優選地，所述英光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板上沿使用時的層析方向 依次W接觸方式設置有；樣品墊、結合墊、反應膜、吸水濾紙，所述結合墊包被有所述的標記 有英光微球的第一 PGII單克隆抗體，所述反應膜包括檢測區和質控區，所述檢測區包被有 所述第二PGII單克隆抗體，所述質控區包被有能與所述的標記有英光微球的第一 PGII單 克隆抗體特異性結合的抗抗體。
[0021] 優選地，所述反應膜為在大于550nm的波長下基本上不發英光的硝酸纖維素膜。
[0022] 優選地，所述底板基本上不具有英光性質。
[0023] 優選地，所述抗抗體為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優選 為羊抗鼠IgG單克隆抗體。
[0024] 本發明還提供了一種制備所述的用于定量檢測待測物中人PGII蛋白的英光免疫 層析試紙的方法，其包括w下步驟：
[002引1)提供標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體；
[0026] 2)提供結合墊，其中在所述結合墊上包被所述的標記有英光微球的第一 PGII單 克隆抗體；
[0027] 3)提供反應膜，其中在所述反應膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二PGII單 克隆抗體和抗抗體，W分別形成檢測區和質控區；和
[0028] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設置樣品墊、所述結合墊、所述 反應膜、吸水濾紙，從而制成所述英光免疫層析試紙。
[0029] 優選地，所述步驟1)包括：
[0030] a)用碳二亞胺活化英光微球，優選地，將英光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述英光微球；
[0031] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優選地，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球用N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液洗涂、分散，并經超聲波處理；
[0032] C)用步驟b)所獲得的英光微球標記第一 PGII單克隆抗體，優選地，將步驟b)所 獲得的英光微球與第一 PGII單克隆抗體混合，用BSA-己醇胺緩沖液封閉，離也，用BSA-吐 溫水溶液分散，經超聲波處理，從而得到標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體。
[0033] 優選地，在所述步驟2)中，所述的標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體的包被 濃度為0. 5?2mg/ml。
[0034] 優選地，在所述步驟3)中，所述檢測區和所述質控區間隔3mm至8mm，所述第二 PGII單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0. 5?2mg/ml。
[00巧]本發明與現有技術相比具有W下優點和積極效果：
[003引1.本發明的人PGII抗原表位膚具有良好的抗原性，用其制備的抗原娩疫原）免 疫動物能夠產生高度特異性的單克隆抗體和多克隆抗體。
[0037] 2.用本發明制備的PGII單克隆抗體和多克隆抗體能夠高度特異地與血液樣本中 的PGII結合。
[003引 3.本發明的人PGII體外診斷試劑盒可W有效地監測血清中的PGII的水平，并且 制備方法簡單，成本低，適于規模化生產。
[0039] 4.本發明將英光分析技術與快速層析免疫技術相結合，提供了一種用于定量檢測 待測物中人PGII蛋白的英光免疫層析試紙，用該試紙檢測待測物中的人PGII蛋白，操作簡 便、快速，只需10分鐘就能完成樣品檢測，并且檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好，能夠迅速 及時地幫助診斷病情，監測預后。
[0040] 5.本發明在制備所述人PGII蛋白的英光免疫層析試紙的過程中，通過大量的試 驗摸索，優化了各方面的制備條件，使得用本發明的英光免疫層析試紙進行檢測時，英光信 背比大大提高，從而提高了檢測靈敏度和結果可信度；此外，本發明還通過試紙的檢測區與 質控區的英光強度比值的變化來反應樣品中PGII的含量，該與傳統的層析技術只考查檢 測區的絕對英光強度相比，最大程度上減少了外界條件和背景等的影響，進一步提高了檢 測結果可信度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041] 圖1為示出本發明的人PGII體外診斷試劑盒的檢測結果與已知試劑盒的檢測結 果的相關性的圖，其中橫坐標為用已知試劑盒測得的樣品中PGII濃度的值，單位為ng/ml， 縱坐標為用本發明試劑盒測得的樣品中PGII濃度的值，單位為ng/ml。
[0042] 圖2示意性示出本發明的一個實施方案的英光免疫層析試紙的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0043] W下通過【具體實施方式】的描述并參照附圖對本發明作進一步說明，但該并非是對 本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可W做出各種修改或改進，但是只 要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的范圍之內。
[0044] 一、人PGII抗原表位膚
[004引本文中所述的人PGII蛋白是本領域已知的，其氨基酸序列是本領域已知的，可W 在NCBI等專業數據庫中查到。
[0046] 本發明提供了一種人PGII抗原表位膚（1)和（2)，其氨基酸序列分別如序列表SEQ ID No. 1 和 SEQ ID No. 2 所示，為：
[0047] (l)K-K-F-K-S-I-R-E-T-Y ;和
[0048] (2) Y-T-P-S-R-A-A-P-P-S-S-TA-QA-P-E-K。
[0049] 本發明的發明人經過大量的理論研究和實驗摸索，最終篩選得到兩種具有良好的 抗原性的抗原表位膚。
[0050] PGII 抗原表位膚（1) W 人 PGII 蛋白（NCBI 序列號（NCBI Reference Sequence)) ;NP_001159896. ON端第24至32位的一段含9個氨基酸殘基的膚段作 為抗原決定簇，并且在其C端添加有Y。在C端添加Y是為了使該抗原表位膚通過抓B (Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交聯到載體蛋白（例如血藍蛋白（KLH))上，從而 作為抗原來制備抗體。PGII抗原表位膚（1)具有親水性高、抗原性強并且易于合成的特點。
[0051] PGII 抗原表位膚（2) W人 PGII 蛋白（NCBI 序列號（NCBI Reference Sequence); NP_001159896. 1 乂端第229至245位的一段含17個氨基酸殘基的膚段作為抗原決定簇，并 且在其N添加有Y。在N端加Y是為了使該抗原表位膚通過抓B(Bis-diazotize化enzidine dichloride)交聯到載體蛋白（例如血藍蛋白（KLH))上，從而作為抗原來制備抗體。PGII抗 原表位膚（2)也具有親水性高、抗原性強并且易于合成的特點。
[0052] 目前，本發明研究發現，本發明的PGII抗原表位膚具有如下功能：
[0053] 1.具有抗原性；2.與載體蛋白連接后作為免疫原刺激動物產生特異性的抗體； 3.用抗原表位膚制備的抗體可特異性地與人PGII結合。
[0054] 本發明的PGII抗原表位膚的制備方法可用化學合成法；利用美國ABI431A型多膚 自動合成儀，通過固相法合成抗原表位膚。本發明的抗原表位膚（1)和（2)的分子量分別 為1299. 66和1943. 41，可用質譜進行確定，并通過多膚序列測定鑒定所合成的抗原表位膚 序列。膚段的純度用薄層色譜和高效液相色譜進行評定，并測定抗原表位膚的濃度。
[005引二、PGII 抗原
[0056] 本發明還提供了一種PGII抗原，其通過使本發明的人PGII抗原表位膚（1)和 (2)中的一者與載體蛋白偶聯制備而成。具體而言，本發明提供了 PGII抗原（1)和（2)，所 述PGII抗原（1)通過使本發明的人PGII抗原表位膚（1)與載體蛋白偶聯制備而成；所述 PGII抗原（2)通過使本發明的人PGII抗原表位膚（2)與載體蛋白偶聯制備而成。本發明的 PGII抗原具有免疫原性和特異性，是一種免疫原，可用來免疫動物從而制備特異性的PGII 抗體。在本發明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH(鑰孔血藍蛋白）、牛血清白蛋白（BSA)、 卵清蛋白OVA等。由于KLH (鑰孔血藍蛋白）免疫原性強，結合位點多，免疫效果較好，并且 與免疫動物親緣關系較遠，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應，因此是優選的。
[0057] H、PGII單克隆抗體、PGII多克隆抗體和人PGII體外診斷試劑盒
[0058] 本發明還提供了人PGII單克隆抗體和人PGII多克隆抗體，所述抗體可W分別利 用本發明的PGII抗原（1)和（2)(免疫原）免疫動物制備而得。制備方法可采用本領域的 常規技術，具體可參見實施例2。
[0059] 本發明的PGII單克隆抗體和多克隆抗體可W用于制備人PGII體外診斷試劑盒， 該試劑盒可W基于免疫方法對人血液標本中的PGII進行檢測。
[0060] 因此，本發明提供了一種人PGII體外診斷試劑盒，其包含本發明的人PGII單克隆 抗體或多克隆抗體。
[0061] 目前已知可用于臨床檢驗的免疫實驗方法主要包括W下幾種；ELISA法、化學發 光法、英光層析法、膠體金免疫測定法等。
[0062] 而化ISA法包括W下幾種類型；雙抗體夾也法檢測抗原、雙抗原夾也法檢測抗體、 間接法測抗體、競爭法測抗體、競爭法測抗原、捕獲包被法測抗體等。
[006引本發明的人PGII體外診斷試劑盒優選采用ELISA雙抗體夾也法來檢測PGII蛋 白。該試劑盒可W包含包被抗體、結合抗體、酶標記的第二抗體和/或必要的工具和試劑 等。
[0064] 優選的是，所述人PGII體外診斷試劑盒采用本發明的人PGII單克隆抗體作為包 被抗體。在此，術語"包被抗體"是指包被于固相的酶標板上的抗體。此外，所述人PGII體 外診斷試劑盒還優選包含人PGII多克隆抗體W作為結合抗體，其中，當所述結合抗體來源 于本發明的人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的一者時，所述包被抗體來源于所述抗原表位 膚（1)和似中的另一者。在此，術語"結合抗體"是指試劑盒中可與待測抗原及酶標記第 二抗體結合的特異性抗體。所述試劑盒還可W包含酶標記的第二抗體，該第二抗體可W為 羊抗兔IgG抗體，所述酶標記可W為辣根過氧化物酶、堿性磯酸酶等。
[0065] 在本發明的試劑盒中，還可W包含檢測所需的任何試劑或工具，例如預包被板、洗 涂液、顯色劑、終止液等。
[0066] 四、用于定量檢測人PGII蛋白的英光免疫層析試紙
[0067] 本發明還提供了一種用于定量檢測待測物中人PGII蛋白的英光免疫層析試紙， 該試紙通過雙抗體夾也法檢測所述人PGII蛋白，其中：
[0068] 所述雙抗體夾也法采用標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體作為捕獲抗體， 所述第一 PGII單克隆抗體來源于人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的一者；并且
[0069] 所述雙抗體夾也法還采用第二PGII單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGII單 克隆抗體來源于人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的另一者；
[0070] 所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)分別為：
[0071] (1)Lys-Lys-Phe-Lys-Ser-Ile-Arg-Glu-T虹-Tyr ;
[0072] (2)Tyr-Thr-Pro-Ser-Arg-Ala-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Hir-Leu-Gln-Leu-Pro-Gl u-LySo
[0073] 在本發明中，在雙抗體夾也法英光免疫層析試紙中，"捕獲抗體"是指能夠首先特 異性識別待測抗原的抗體，其通常包被在結合墊上；"檢測抗體"是指另一種能夠特異性識 別待測抗原的抗體，其與捕獲抗體分別識別待測抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固 定在反應膜的檢測區上。
[0074] 在本發明中，所述第一 PGII單克隆抗體可W由第一 PGII抗原制備而成，該第一 PGII抗原可W通過使所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的一者與載體蛋白偶聯制備而 成；并且所述第二PGII單克隆抗體可W由第二PGII抗原制備而成，該第二PGII抗原可W 通過使所述人PGII抗原表位膚（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯制備而成。
[007引在本發明中，可用的載體蛋白的例子包括KLH (鑰孔血藍蛋白）、牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH (鑰孔血藍蛋白）免疫原性強，結合位點多，免疫效果較 好，并且與免疫動物親緣關系較遠，用其作為載體蛋白不易引起交叉反應，因此是優選的。
[0076] 優選地，本發明的英光免疫層析試紙中所用的英光微球的粒徑為320nm至400nm， 優選為360nm，英光微球上的英光物質可為異硫氯酸英光素、四己基羅丹明、四甲基異硫氯 酸羅丹明或X-羅丹明等，其中優選為X-羅丹明（可購自上海晶純公司）。英光微球的微球 材料可W為由聚苯己帰、聚甲基丙帰酸甲醋或甲基丙帰酸甲醋與其它單體共聚形成的共聚 物，其它單體的例子為苯己帰等。英光微球的激發波長可W為350?600nm，優選為390nm ; 發射波長可W為500?700皿，優選為615皿。
[0077] 在本發明中，英光微球的最大激發波長與發射波長差值較大，說明英光微球有較 大的斯巧克斯（Stokes)位移，該樣，英光試紙的背景干擾較低，W該微球做免疫層析標記物 有較強的優勢。
[0078] 在一個具體的實施方案中，本發明的英光免疫層析試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設置有；樣品墊、結合墊、反應膜、吸水濾紙，所述樣 品墊用于在使用時加載待測樣品，所述結合墊包被有所述的標記有英光微球的第一 PGII 單克隆抗體，所述反應膜包括檢測區和質控區，所述檢測區包被有所述第二PGII單克隆抗 體，所述質控區包被有能與所述的標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體特異性結合的 抗抗體。
[0079] 優選地，本發明的英光免疫層析試紙的樣品墊、結合墊、反應膜、吸水濾紙可W沿 使用時的層析方向依次搭接設置在底板上(參見圖2)。反應膜上間隔設置的檢測區和質控 區可W為，但不限于，線、帶、塊等形式，檢測區和質控區優選間隔3mm至8mm。
[0080] 在本發明中，反應膜優選為在大于550nm的波長下基本上不發英光的硝酸纖維素 膜。此外，底板優選基本上不具有英光性質。
[0081] 通常，常規的層析試紙組件(反應膜、底板等)在550nm波長下具有較明顯的英光背 景，該對英光信號的檢測產生很大干擾。本發明通過采用在大于550nm的波長下基本上不 發英光的硝酸纖維素膜和低英光性質的底板，從而克服了常規英光試紙的缺陷。此外，本發 明所用的英光物質X-羅丹明可產生較強的英光信號，從而進一步大大提高了英光信背比， 使得能夠很好地區分信號和背景，進而提高檢測靈敏度。
[0082] 在本發明中，樣品墊和結合墊的材料可采用本領域通常使用的材料，例如，樣品墊 和結合墊可W為玻璃纖維。
[0083] 本發明所采用的能與標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體特異性結合的抗抗 體可W為羊抗鼠IgG單克隆抗體或兔抗鼠IgG單克隆抗體，其中優選為羊抗鼠IgG單克隆 抗體，與多克隆抗體相比，單克隆抗體特異性更高。
[0084] 在一個具體的實施方案中，本發明的英光免疫層析試紙在使用時，在樣品墊上滴 加樣品液巧日含有PGII的血樣)，在毛細管作用下，樣品液向吸水濾紙一端移動，在結合墊處 與所述的標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體形成免疫復合物，該免疫復合物進一步 移動，在檢測線上與所述第二PGII單克隆抗體結合形成雙抗體夾也的免疫復合物，而未形 成免疫復合物的標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體則與質控線上的抗抗體結合。此 過程需要10分鐘至15分鐘，之后，用英光檢測儀進行檢測，如果質控線處未出現條帶，則說 明試紙失效；如果質控線處出現條帶，而檢測線處未出現條帶，則說明樣品中不含人PGII 蛋白；如果在質控線和檢測線上均出現條帶，則說明樣品中含有人PGII蛋白。
[0085] 在另一個方面，本發明提供了一種制備用于定量檢測待測物中人PGII蛋白的英 光免疫層析試紙的方法，其包括W下步驟：
[0086] 1)提供標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體；
[0087] 2)提供結合墊，其中在所述結合墊上包被所述的標記有英光微球的第一 PGII單 克隆抗體；
[0088] 3)提供反應膜，其中在所述反應膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二PGII單 克隆抗體和抗抗體，W分別形成檢測區和質控區；和
[0089] 4)在底板上沿使用時的層析方向依次W接觸方式設置樣品墊、所述結合墊、所述 反應膜、吸水濾紙，從而制成所述英光免疫層析試紙。
[0090] 本領域技術人員可W理解的是，可W根據實際需要對上述步驟的順序進行調整， 例如步驟3)可W在步驟1)之前，或在步驟1)和2)之間。
[0091] 本發明的方法還可W包括將制成的英光免疫層析試紙切割成適當寬度的步驟5)。
[0092] 本發明的發明人通過大量的試驗摸索，優化了制備本發明的用于檢測人PGII蛋 白的英光免疫層析試紙的方法的各個步驟的條件，從而使得本發明的英光免疫層析試紙能 夠針對人PGII蛋白獲得符合臨床檢測要求的結果，即，檢測范圍寬、特異性高、靈敏度好。
[0093] 因此，優選的是，在本發明的方法中，所述步驟1)包括：
[0094] a)用碳二亞胺活化英光微球，優選地，將英光微球的水分散液或MES緩沖液分散 液經超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述英光微球；
[0095] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，優選地，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球用N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液洗涂、分散，并經超聲波處理；
[0096] C)用步驟b)所獲得的英光微球標記第一 PGII單克隆抗體，優選地，將步驟b)所 獲得的英光微球與第一 PGII單克隆抗體混合，用BSA-己醇胺緩沖液封閉，離也，用BSA-吐 溫水溶液分散，經超聲波處理，從而得到標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體。
[0097] 在本發明的一個具體的實施方案中，所述步驟1)包括：
[0098] a)用碳二亞胺活化英光微球，其中，取1 (w/v)%的英光微球水分散液，10000巧m至 15000巧m低溫(例如1(TC )離也5至10分鐘，去上清，將沉淀物分散到500 y 1的蒸觸水或 初洗緩沖液（0. 1M的MES水溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重復W上過程H次， 加入碳二亞胺lOmg至50mg，攬拌10?15分鐘，從而活化所述英光微球；
[0099] b)洗涂步驟a)所獲得的活化的英光微球，其中，將步驟a)所獲得的活化的英光 微球在1000巧m至1500化pm下離也5至10分鐘，將沉淀物分散到1ml偶聯緩沖液（20? lOOmM的N-輕基硫代玻巧醜亞胺-巧樣酸緩沖液)）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，重 復W上過程H次；
[0100] C)用步驟b)所獲得的英光微球標記第一PGII單克隆抗體，其中，按照ly 1至 3 y 1抗體（lOmg/ml) /100 y 1所述活化的英光微球的比例，將步驟b)所獲得的英光微球與 第一 PGII單克隆抗體混合，室溫（25C )下攬拌1. 5?3小時(優選2小時)，加入1ml封閉 緩沖液（1 (w/v) %BSA-〇. 05M己醇胺)，繼續攬拌1小時，在10000巧m至15000巧m下離也5至 10分鐘，重復離也3次，將沉淀物分散到500 y 1終洗緩沖液（0. 5 (w/v) %BSA-〇. 11 (v/v) %吐 溫水溶液）中，超聲波（240W)處理1至2分鐘，用所述終洗緩沖液定容至500 y 1。
[0101] 優選地，在本發明的方法中，所述步驟2)包括；將標記有英光微球的第一 PGII單 克隆抗體用抗體稀釋液（l%(w/v)BSA-〇. 01M PBS(抑7. 2)緩沖液)進行稀釋，W稀釋至0. 5? 2mg/ml，優選為Img/ml，然后用微量移液器均勻噴涂在結合墊上，之后烘干或真空冷凍干 燥。在本發明的方法的步驟2)中，所述的標記有英光微球的第一 PGII單克隆抗體的包被 濃度為0. 5?2mg/ml，優選為Img/ml。
[0102] 優選地，所述步驟3)包括；用噴金機將所述第二PGII單克隆抗體和抗抗體劃到硝 酸纖維素膜（固相載體)上W作為檢測區和質控區，使檢測區和質控區的間隔為3mm至8mm， 所述第二PGII單克隆抗體和所述抗抗體的濃度分別為0. 5?2mg/ml，優選為Img/ml。
[0103] 優選地，結果檢測利用專用的英光檢測儀(可購自深圳市安群生物工程有限公司， 型號AQ-3000)對質控區和檢測區進行檢測，檢測區與質控區英光強度的比值和待測樣品中 的PGII的含量成正比。采用檢測區與質控區英光強度的比值而不是直接采用檢測區的絕 對英光值可盡可能地減少反應條件、基質等的影響，并盡量避免背景干擾。
[0104] W下通過例子的方式進一步解釋或說明本發明的內容，但該些例子不應被理解為 對本發明的保護范圍的限制。
[0105] 實施例
[0106] 除非另有說明，W下所述溶液均為水溶液，溶液中的百分數均為體積百分數。
[0107] 實施例1 ;PGII抗原表位膚（1)和似的制備。
[0108] 制備方法用化學合成法：利用美國ABI431A型多膚自動合成儀，通過固相法分別 合成PGII抗原表位膚（1)和（2)。抗原表位膚的純度用高效液相色譜進行評定，并測定膚 段的濃度。本發明的抗原表位膚（1)和（2)的分子量分別為1299. 66和1943. 41，利用質譜 進行確定，通過多膚序列測定鑒定所合成的多膚序列。
[0109] -、PGII抗原表位膚（1)和似的合成
[0110] 上述膚段采用固相法合成。固相膚合成的主要思想是：先將所要合成膚鏈的駿基 末端氨基酸的駿基W共價鍵形式同一個不溶性的高分子化合物（樹脂）相連接，然后W此 結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份，經過脫去氨基保護基并同過量的活化駿基組份 反應，接長膚鏈。該樣的步驟可W反復地多次進行下去，最后達到所需要合成的膚鏈的長 度。該個合成過程如下所示。
[0111]
【權利要求】
1. 一種用于定量檢測待測物中人PGII蛋白的熒光免疫層析試紙，該試紙通過雙抗體 夾心法檢測所述人PGII蛋白，其中： 所述雙抗體夾心法采用標記有熒光微球的第一 PGII單克隆抗體作為捕獲抗體，所述 第一 PGII單克隆抗體來源于人PGII抗原表位肽（1)和（2)中的一者；并且 所述雙抗體夾心法采用第二PGII單克隆抗體作為檢測抗體，所述第二PGII單克隆抗 體來源于人PGII抗原表位肽（1)和（2)中的另一者； 所述人PGII抗原表位肽（1)和（2)分別為： (1) Lys-Lys-Phe-Lys-Ser-Ile-Arg-Glu-Thr-Tyr ； (2) Tyr-Thr-Pr〇-Ser-Arg-Ala-Ala-Pr〇-Pr〇-Ser-Ser-Thr-Leu-Gln-Leu-Pr〇-Glu-Ly So
2. 根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述第一PGII單克隆抗體是由第一 PGII抗原制備而成的，該第一 PGII抗原是通過使所述人PGII抗原表位肽（1)和（2)中的 一者與載體蛋白偶聯制備而成的；并且 所述第二PGII單克隆抗體是由第二PGII抗原制備而成的，該第二PGII抗原是通過使 所述人PGII抗原表位肽（1)和（2)中的另一者與載體蛋白偶聯制備而成的。
3. 根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的粒徑為320nm至 400nm。
4. 根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球上的熒光物質為異硫 氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明或X-羅丹明，其中優選為X-羅丹明；所 述熒光微球的微球材料為聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。
5. 根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述熒光微球的激發波長為350? 600nm，優選為390nm ;發射波長為500?700nm，優選為615nm。
6. 根據權利要求1所述的熒光免疫層析試紙，其中所述試紙具有底板，并且在該底板 上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設置有：樣品墊、結合墊、反應膜、吸水濾紙，所述結 合墊包被有所述的標記有熒光微球的第一 PGII單克隆抗體，所述反應膜包括檢測區和質 控區，所述檢測區包被有所述第二PGII單克隆抗體，所述質控區包被有能與所述的標記有 熒光微球的第一 PGII單克隆抗體特異性結合的抗抗體。
7. 根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述反應膜為在大于550nm的波長 下基本上不發熒光的硝酸纖維素膜。
8. 根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述底板基本上不具有熒光性質。
9. 根據權利要求6所述的熒光免疫層析試紙，其中所述抗抗體為羊抗鼠 IgG單克隆抗 體或兔抗鼠 IgG單克隆抗體，其中優選為羊抗鼠 IgG單克隆抗體。
10. -種制備根據權利要求1至9中任意一項所述的熒光免疫層析試紙的方法，其包括 以下步驟： 1) 提供標記有突光微球的第一 PGII單克隆抗體； 2) 提供結合墊，其中在所述結合墊上包被所述的標記有熒光微球的第一 PGII單克隆 抗體； 3) 提供反應膜，其中在所述反應膜上沿使用時的層析方向間隔固定第二PGII單克隆 抗體和抗抗體，以分別形成檢測區和質控區；和 4)在底板上沿使用時的層析方向依次以接觸方式設置樣品墊、所述結合墊、所述反應 膜、吸水濾紙，從而制成所述熒光免疫層析試紙。
11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述步驟1)包括： a) 用碳二亞胺活化熒光微球，優選地，將熒光微球的水分散液或MES緩沖液分散液經 超聲波處理并與碳二亞胺混合，從而活化所述熒光微球； b) 洗滌步驟a)所獲得的活化的熒光微球，優選地，將步驟a)所獲得的活化的熒光微球 用N-羥基硫代琥珀酰亞胺-檸檬酸緩沖液洗滌、分散，并經超聲波處理； c) 用步驟b)所獲得的熒光微球標記第一 PGII單克隆抗體，優選地，將步驟b)所獲得 的熒光微球與第一 PGII單克隆抗體混合，用BSA-乙醇胺緩沖液封閉，離心，用BSA-吐溫水 溶液分散，經超聲波處理，從而得到標記有熒光微球的第一 PGII單克隆抗體。
12. 根據權利要求10所述的方法，其中在所述步驟2)中，所述的標記有熒光微球的第 一 PGII單克隆抗體的包被濃度為0. 5?2mg/ml。
13. 根據權利要求10所述的方法，其中在所述步驟3)中，所述檢測區和所述質控區間 隔3mm至8mm，所述第二PGII單克隆抗體和所述抗抗體的包被濃度分別為0. 5?2mg/ml。
【文檔編號】G01N33/68GK104422774SQ201310370234
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月22日 優先權日:2013年8月22日
【發明者】朱建安 申請人:朱建安
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
