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專利名稱：弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法及金標(biāo)檢測(cè)卡和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于診斷、檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的方法，以及用于該方法的弓形蟲(chóng)抗
體金標(biāo)快速檢測(cè)卡和其制備方法。
背景技術(shù)：
弓形蟲(chóng)感染系全球性分布，是最常見(jiàn)的人畜共患寄生蟲(chóng)病。近年來(lái)隨著人們生活 水平的提高，養(yǎng)貓、狗等寵物的人越來(lái)越多，感染弓形蟲(chóng)的機(jī)會(huì)也隨之增多。估計(jì)目前感染 者約占世界人口的四分之一以上。弓形蟲(chóng)是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)，免疫功能低下是弓形蟲(chóng) 感染率增高的一個(gè)主要因素。據(jù)國(guó)外報(bào)道，艾滋病合并弓形蟲(chóng)病占艾滋病人20% 80%， 國(guó)外已有較多惡性腫瘤并發(fā)弓形蟲(chóng)的報(bào)道，而且長(zhǎng)期使用免疫抑制劑者或免疫功能受損或 下降者，器官移植者等合并或出現(xiàn)全身性泛發(fā)性弓形蟲(chóng)的報(bào)道亦逐漸增多。此外，弓形蟲(chóng)感 染也是引起新生兒出生缺陷的一個(gè)重要因素，先天性弓形蟲(chóng)感染對(duì)優(yōu)生優(yōu)育產(chǎn)生的危害極 大，直接影響著人口素質(zhì)的發(fā)展。近年來(lái)，許多經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國(guó)家已將弓形蟲(chóng)檢測(cè)作為孕期常規(guī) 篩查項(xiàng)目，我國(guó)也開(kāi)展了包括弓形蟲(chóng)在內(nèi)的TORCH檢測(cè)項(xiàng)目。弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡 可用弓形蟲(chóng)感染的快速診斷。
本發(fā)明的公開(kāi) 本發(fā)明的第一目的是為了提供一種弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)方法，該方法為"一步法"快 速檢測(cè)方法，靈敏度高、特異性強(qiáng)；而且速度快，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專門(mén)設(shè)施，適用于臨床檢測(cè)、 流行病學(xué)調(diào)查等。 本發(fā)明的第二目的是為了提供一種弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡，該檢測(cè)卡針對(duì)弓 形蟲(chóng)抗體檢測(cè)提供一種簡(jiǎn)便、快速、而且直接的"一步法"檢測(cè)卡，利用該檢測(cè)卡檢測(cè)弓形蟲(chóng) 抗體的靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且速度快，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需專門(mén)設(shè)施。 本發(fā)明的第三個(gè)目的是為了提供一種弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡的制備方法，該 方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。 本發(fā)明的第一 目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn) —種弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法，包括下述步驟(l)將膠體金標(biāo)記的弓形蟲(chóng)分泌抗原
載于玻璃纖維或無(wú)紡布載體上；并在與膠體金載體相連的硝酸纖維膜(NC)載體上包被弓
形蟲(chóng)分泌抗原形成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)分泌抗原抗體形成的控制線；(2)取人血清滴于
膠體金標(biāo)記的載體上，如血清中有弓形蟲(chóng)抗體則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線，檢測(cè)載體上檢
測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。 本發(fā)明的第二目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn) —種弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡由檢測(cè)條和塑料卡盒組成，檢測(cè)條安裝在塑料卡 內(nèi)。 所述的檢測(cè)條是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層 和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)弓形蟲(chóng)分泌抗原層；在檢測(cè)層上包被有由弓形蟲(chóng)分泌抗原形 成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)抗體形成的控制線。
本發(fā)明的第三個(gè)目的可通過(guò)如下措施來(lái)實(shí)現(xiàn) —種弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡的制備方法主要包括金標(biāo)抗原層和檢測(cè)層及其 上包被控制線和檢測(cè)線的制備，以及檢測(cè)條和檢測(cè)卡的組裝。 所述的金標(biāo)抗原層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備在濃度為 0. 004 % 0. 012 %的氯金酸中加入其體積的1. 3 % 2 % 、濃度為1 % 3 %的檸檬酸三 鈉，煮沸10 20分鐘，可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記弓形蟲(chóng)抗原，在 膠體金溶液中用0. 2m碳酸鉀溶液調(diào)0 8. 4，按4 12mg/100ml加入弓形蟲(chóng)抗原， 攪拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4t:靜置2 4小時(shí)；iii將 上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液 經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60 80分鐘離心得沉淀物；v將沉淀物按4 10ml/100ml溶于 0. 02MPh7. 4Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含0. 2 % 0. 6 %的動(dòng)物血清蛋白 和0. 01% 0. 06%疊氮鈉；vi將上述膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡布至液體開(kāi)始滲出 為止，37t:干燥形成金標(biāo)抗原層。 所述的檢測(cè)層的制備，在制備的純化兔或羊抗弓形蟲(chóng)抗體和弓形蟲(chóng)分泌抗原中 加入固定劑，用專用噴膜機(jī)在纖維素膜上形成控制線和檢測(cè)線；其制備方法是在濃度為 0. 8-2. 4mg/ml的抗原或抗體溶液中加入0. 1% -0. 3%的固定劑，利用專用噴膜機(jī)將抗原或 抗體在NC膜上噴線，噴膜后37t:干燥，再用含10%小牛血清的0. 01mPH7. OPBS液封閉30 分鐘，O. 01mPH7. OPBS漂洗、37。C干燥得檢測(cè)層。
所述的固定劑選自甲醛、丙酮中的一種。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn) 1、本發(fā)明的檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體的方法為一步法，具有高度的特異性和高靈敏度，其 檢測(cè)快速，結(jié)果判定在3 15分鐘內(nèi)完成，無(wú)需專門(mén)設(shè)施。 2、本發(fā)明的檢測(cè)卡檢測(cè)弓形蟲(chóng)抗體時(shí)具有高度的特異性和高靈敏度，檢測(cè)過(guò)程操 作迅速、快捷，方便，適合弓形蟲(chóng)感染人群的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。
3、本發(fā)明的檢測(cè)卡的制備方法簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。
圖面說(shuō)明

圖1是本發(fā)明檢測(cè)卡的結(jié)構(gòu)示意圖
1-檢測(cè)卡 2-加樣孔 3-觀察孔
圖2是本發(fā)明檢測(cè)卡的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖
4-加樣端吸水層 5-金標(biāo)抗體層 6-
7-檢測(cè)線 8-檢測(cè)層 9- 10-襯板
本發(fā)明的實(shí)施方式 本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述
實(shí)施例一 —種弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法，包括下述步驟(l)將膠體金標(biāo)記的弓形蟲(chóng)抗原載于 玻璃纖維或無(wú)紡布載體上；并在與膠體金載體相連的硝酸纖維膜(NC)載體上包被弓形蟲(chóng) 抗原形成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)抗體形成的控制線；(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記的載體 上，如血清中有弓形蟲(chóng)抗體則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線，檢測(cè)載體上檢測(cè)線、控制線雙線為
控制線
吸水端吸水層陽(yáng)性，否則為陰性。 參照?qǐng)D1， 一種弓形蟲(chóng)抗體快速金標(biāo)檢測(cè)卡1 參照?qǐng)D2，所述弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡1是在襯板10上設(shè)有加樣端吸水層4、 檢測(cè)層8和吸水端吸水層9，在檢測(cè)層8和吸水端吸水層9之間設(shè)有金標(biāo)弓形蟲(chóng)抗原層5 ; 在檢測(cè)層8上包被有檢測(cè)線7和控制線6。其中加樣端吸水層4由多層玻璃纖維或無(wú)紡布 制成；吸水端吸水層9由多層濾紙制成；檢測(cè)層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素 膜、醋酸纖維膜；金標(biāo)抗原層為玻璃纖維或無(wú)紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體制成。
—種金標(biāo)弓形蟲(chóng)抗體快速檢測(cè)卡的制備方法包括金標(biāo)抗原層5和檢測(cè)層8上檢測(cè) 線7和控制線6的包被，然后在襯板10上組合弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡1。在塑料墊板 10的兩端分別粘貼加樣端吸水層4和吸水端吸水層9 ;在其中斷粘貼包被檢測(cè)線和控制線 的檢測(cè)層8，在加樣端吸水層4與檢測(cè)層8的交接部位，夾貼金標(biāo)抗原層5纖維載體，纖維 載體4/5部分夾在加樣吸水層4中間，1/5部分疊在檢測(cè)層8上。然后按4-5毫米寬、8厘 米長(zhǎng)規(guī)格切條，在組裝在塑料卡盒內(nèi)，盒蓋上加樣孔2正對(duì)檢測(cè)條加樣端吸水層4，觀察孔3 正對(duì)檢測(cè)層8。 所述的金標(biāo)抗原層5的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取100mg氯金酸 溶于1000ml三蒸水中，加入15ml、在濃度為1%的擰檬酸三鈉，煮沸15分鐘，可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記弓形蟲(chóng)抗原，取100ml膠體金溶液，用0. 2m碳酸鉀溶 液調(diào)2，入4mg弓形蟲(chóng)抗原，攪拌20分鐘，再加入240mg牛血清白蛋白(BSA)，繼續(xù)攪拌 5分鐘，4t:靜置2-4小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘，去沉 淀物，得上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘離心得沉淀物；v將沉淀物溶 于4ml 0. 02MPH7. 4Tris-Hcl緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含0. 25% BSA和0. 02%疊 氮鈉；vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡布至液體開(kāi)始滲出為止，37t:干燥2小時(shí)形成 金標(biāo)抗原層5。 所述膠體金標(biāo)記抗原為弓形蟲(chóng)分泌抗原。 所述的檢測(cè)層8是在硝酸纖維膜(NC)上設(shè)有弓形蟲(chóng)分泌抗原構(gòu)成的檢測(cè)線7和 有羊抗弓形蟲(chóng)分泌抗原抗體形成的控制線6。其制備方法是取弓形蟲(chóng)分泌抗原，調(diào)濃度為 lmg/ml，加入0. 2%甲醛，用專用噴膜機(jī)在NC膜中斷噴檢測(cè)線7 ;取羊抗弓形蟲(chóng)分泌抗原抗 體，調(diào)濃度為2mg/ml，加入0. 2%甲醛，用專用噴膜機(jī)在NC膜中斷，距檢測(cè)線0. 5cm處噴控 制線6，檢測(cè)線和控制線均按20ul/ml設(shè)置噴量，噴膜在37t:干燥2小時(shí)，再用含10%小牛 血清的0. 01mPH7. OPBS液封閉37 °C 30分鐘，O. 01mPH7. OPBS漂洗、37"C干燥。
實(shí)施例二 弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速檢測(cè)卡與例一同。 該檢測(cè)卡的制備方法除包被檢測(cè)層8上控制線6的抗體為兔抗弓形蟲(chóng)分泌抗原抗 體外，其他條件與例一同。
權(quán)利要求
一種弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法，包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的弓形蟲(chóng)抗原載于玻璃纖維或無(wú)紡布載體上，并在與膠體金載體相連的硝酸纖維膜(NC)載體上包被弓形蟲(chóng)分泌抗原形成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)抗體形成的控制線；(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記的載體上，如血清中有弓形蟲(chóng)抗體則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線，檢測(cè)載體上檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。
2. —種弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡(l)，其特征在于該檢測(cè)卡由檢測(cè)條和塑料卡盒組 成，檢測(cè)條安裝在塑料卡內(nèi)。
3. 如權(quán)利要求2所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡，其特征在于所述弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo) 快速檢測(cè)卡(1)是在襯板(10)上設(shè)有加樣端吸水層(4)、檢測(cè)層(8)和吸水端吸水層(9)， 在檢測(cè)層(8)和吸水端吸水層(9)之間設(shè)有金標(biāo)弓形蟲(chóng)抗原層(5)，在檢測(cè)層(8)上包被有 檢測(cè)線(7)和控制線(6)。
4. 如權(quán)利要求2所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于包括金標(biāo) 抗原層(5)和檢測(cè)層(8)及其上包被檢測(cè)線(7)和控制線(6)的制備，在襯板(10)上組合 弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)檢測(cè)條和檢測(cè)卡(1)。
5. 如權(quán)利要求4所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)快速檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于所述的金 標(biāo)抗原層(5)的制備方法包括下列步驟i膠體金的制備在濃度為0. 004% 0. 012%的 氯金酸中加入其體積的1. 3 % 2 % 、濃度為1 % 3 %的檸檬酸三鈉，煮沸10 20分鐘，可 得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記弓形蟲(chóng)抗原，在膠體金溶液中用0. 2m碳酸 鉀溶液調(diào)ra8. 0 8. 4，按4 12mg/100ml加入弓形蟲(chóng)抗原，攪拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4t:靜置2 4小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分 鐘離心10 15分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60 80分 鐘離心得沉淀物；v將沉淀物按4 10ml/100ml溶于0. 02MPh7. 4Tris-Hcl緩沖液得膠體金 溶液，該緩沖液中含0. 2% 0. 6%的動(dòng)物血清蛋白和0. 01% 0. 06%疊氮鈉；vi將上述 膠體金溶液浸入玻璃纖維或無(wú)紡布至液體開(kāi)始滲出為止，37t:干燥過(guò)濾形成金標(biāo)抗原層。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)檢測(cè)卡的制備方法，特征在于所述膠體金 標(biāo)記抗原為弓形蟲(chóng)分泌抗原。
7. 如權(quán)利要求4所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)檢測(cè)卡的制備方法，其特征在于所述的檢測(cè)層 (8)是在硝酸纖維膜上設(shè)有弓形蟲(chóng)分泌抗原構(gòu)成的檢測(cè)線(7)和由羊、兔抗弓形蟲(chóng)抗體形 成的控制線(6)。
8. 如權(quán)利要求7所述的弓形蟲(chóng)抗體金標(biāo)檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于所述的弓 形蟲(chóng)抗原為弓形蟲(chóng)分泌抗原。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種弓形蟲(chóng)抗體檢測(cè)方法及快速檢卡和制備方法，其檢測(cè)方法包括(1)將膠體金標(biāo)記的弓形蟲(chóng)抗原載于載體上，并在與膠體金載體相連的檢測(cè)載體上包被弓形蟲(chóng)分泌抗原形成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)抗體形成的控制線；(2)取人血清滴于膠體金標(biāo)記的載體上，如血清中有弓形蟲(chóng)抗體則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線，檢測(cè)載體上檢測(cè)線、控制線雙線為陽(yáng)性，否則為陰性。該檢測(cè)卡包括加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)弓形蟲(chóng)抗原層；在檢測(cè)層上包被有由弓形蟲(chóng)分泌抗原形成的檢測(cè)線和由抗弓形蟲(chóng)抗體形成的控制線。本發(fā)明的方法為“一步法”快速檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)；且快速、簡(jiǎn)便，無(wú)需專門(mén)設(shè)施。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101699289SQ200910022140
公開(kāi)日2010年4月28日 申請(qǐng)日期2009年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月3日
發(fā)明者李克生, 杜惠芬 申請(qǐng)人:李克生