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專利名稱：微生物的捕獲的制作方法
微生物的捕獲本發(fā)明涉及從懸浮物中捕獲微生物的方法，以及其隨后的檢測和/或鑒定。背景在許多應用中希望從其懸浮物中捕獲微生物，這作為第一個步驟而允許隨后對所述微生物進行其它工作，例如將微生物濃縮為不含雜質和污染物的小體積，用于例如診斷目的。所述微生物可起初存在于大體積樣品材料中，例如痰，血液，分散的食物或飲用水中。濃縮為不含樣品污染物的小體積在診斷程序中會優(yōu)化靈敏度并去除抑制物，所述診斷程序是例如顯微鏡檢查，免疫測定或核酸擴增程序，例如PCR。現(xiàn)存的用于實現(xiàn)微生物濃縮的方法包括使用涂覆了微生物特異性抗體的順磁珠子；所述珠子可被用于從樣品中特異性地捕獲微生物，從而允許通過各種方法對其進行隨后的檢測(US7166425)。然而，在一些應用中，捕獲條件可能不適于基于抗體的系統(tǒng):例如，在從痰中捕獲分枝桿菌時，所述痰已用氫氧化鈉稀釋并且保持為高PH，這將使抗體失活。在這些以及其它嚴苛條件的情形中，不能使用抗體捕獲。此外，在其它應用中可能需要捕獲可能存在于樣品中的任何微生物。例如，在敗血癥中，重要的是捕獲可能存在于血液中的任何細菌或真菌細胞從而可進行診斷。類似地，在測試血液產品時(例如在血小板篩選中)，重要的是了解所述血液產品(在此情形中是血小板)究竟是否被任何微生物污染。在這種情形中，用基于抗體的方法將難以進行這些，因為抗體傾向于是生物體或物種特異性的。曾描述過不是基于抗體的方法。JP2001112497描述了通過沉淀其中的磷酸鈣而從堿凈化的液體中去除分枝桿菌的方法，推測沉淀物在形成時帶下細菌。W02009/086343描述了將碳水化合物涂覆的表面與生物素結合蛋白以及類固醇或三萜的兩親性糖苷一起使用以結合微生物。W028072242A2描述了以氨基酸衍生的聚合物基質作為結合表面，且W029046191A2描述了使用以各種金屬或無機表面涂覆的硅藻土顆粒來實現(xiàn)相同的結果。這些方法比基于抗體的方法更為通用但是不是真正通用的，因為某些細菌種類比其它種類更好地被捕獲，且某些細菌種類或菌株可能根本不被捕獲。此外，沒有顯示這些方法用于捕獲真菌。這些問題是依賴于結合基質的表面特性(其在性質上必然受限)來結合可具有多樣的外細胞壁結構的細菌的結果。在本發(fā)明中，我們描述了新的方法，其較少依賴于表面基質的性質并且被顯示出除對分枝桿菌(傾向于具有獨特的疏水性細胞壁)起作用外，也對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌以及真菌起作用。發(fā)明簡述我們現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了有可能使用水溶性聚合物來引起懸浮的微生物沉積在固體表面上。此方法還起作用以引起微生物的可沉淀和不可沉淀的片段沉積在固體表面上。雖然已經(jīng)得知通過加入水溶性聚合物例如聚乙二醇(PEG)或右旋糖苷而不涉及固體表面可引起溶液中的蛋白沉淀有一段時間了，但是關于微生物及其片段的這些發(fā)現(xiàn)是出人預料的。W095/32304使用水性兩相聚合物分離系統(tǒng)來選擇性提高靶微生物相對于背景菌群的數(shù)目，但是沒有暗示捕獲至固體表面。因此，本發(fā)明現(xiàn)在提供了將水性液體中的微生物和/或其片段捕獲至固體表面上的方法，所述方法包括在固體表面的存在下向所述液體中加入足量的水溶性聚合物以將所述微生物和/或片段從所述液體轉移至所述固體表面。或者表述為，所述方法可包括將固體表面與含有微生物和/或其片段的水性液體及水溶性聚合物一同提供，以將所述微生物和/或其片段從所述液體轉移至所述固體表面上。可以此方式被捕獲的微生物片段包括可沉淀的片段，可利用以4，OOOx g離心20min來離心所述片段而從液體中沉積，其中4，OOOx g是通常用于沉淀細菌的速度。令人驚訝地，所述方法也起作用以捕獲片段，所述片段可包括在這種離心條件下不能被引起沉積并且可被稱為不可沉淀的可溶性蛋白或其它可溶性細胞組分。可根據(jù)聚合物的性質自由調節(jié)水性液體中所添加的水溶性聚合物的濃度，從而產生所希望的將微生物和/或片段從待沉積液體中的懸浮物或溶液中轉移至固體表面上。任選地，所述聚合物濃度為2至30%w/v,優(yōu)選5至20%w/v,更優(yōu)選7至15%w/v,最優(yōu)選約10%w/ν.這些濃度特別適于與以PEG或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(作為所述聚合物)一起使用。優(yōu)選地，所述水溶性聚合物是非離子親水性聚合物。其例如可以是右旋糖苷，PVP或PEG。所述PEG可以是在分子量方面多分散的或者是單分散的，可以是分支的或直鏈的并且可以是星型的。適當?shù)兀鏊苄跃酆衔锞哂械闹鼐肿恿繛?00至100，000。其可例如具有下列分子量1，000至20，000，更優(yōu)選5，000至13，000，例如約8000。這些分子量特別適于PEG或PVP的情形。可通過使用高離子強度條件來提高微生物與固體表面的結合。適當?shù)兀ㄟ^加入水溶性無機鹽而將所述水性液體的離子強度提高到150mM至6M，更優(yōu)選0.25至0.75M，例如 0.5M。可向所述溶液中加入許多不同的鹽以實現(xiàn)高離子強度，例如硫酸銨，氯化銨，硫酸鎂，氯化鎂，但是氯化鈉是優(yōu)選的。可在1-14范圍中的高或低pH條件下進行與表面的結合。當所述微生物是分枝桿菌時，高pH、例如9至14可以是優(yōu)選的，以消滅或降低繁殖可能存在的其它種類的細菌的能力。此外，可在去污劑的存在下進行與表面的結合，所述去污劑可包括離子性(例如十二烷基硫酸鈉)或非離子性(例如Tween20和Triton X100)去污劑。優(yōu)選的是，所述固體表面具有高的比表面積，因而優(yōu)選通過珠子提供所述固體表面。術語“珠子”包括但不限于下述不可溶顆粒:其性質為球形的或不規(guī)則的，大小為0.1微米至5mm。根據(jù)本發(fā)明的方法還可包括從所述液體中分離所述固體表面。對于微生物的一般性濃縮有完善的物理方法，例如:過濾樣品，其中細胞被俘獲在尺寸排阻濾器的表面上或深度濾器的結構內；或者離心，其中細胞被沉淀。雖然這些方法可用于制備不含樣品污染物的微生物濃縮懸浮物，它們也有缺點。在過濾方法中，捕獲確定大小的完整生物體是簡單的(受制于過濾的內在缺點)，但是以這種方式來捕獲不確定大小的生物體片段是更加困難的。此外，在通過過濾器俘獲了微生物之后可能難以回收它們，并且當通過洗脫或逆流清洗過程進行回收時，所述微生物可能不利地存在于相對大的流體體積中。再一次地，離心可被用于濃縮完整的生物體但是在所使用的速度和時間下微生物的片段可能是不可沉淀的。此外，離心需要設備并且此步驟也不能被容易地并入微生物濃度和檢測的自動化程序中。此外，在離心之后，以所希望的小體積可靠地重懸含有微生物的經(jīng)沉淀的沉淀物是困難的，通常需要更大的體積來確保完全分散管中的沉淀物。因此，優(yōu)選的是，在其上接受微生物和/或片段的固體表面的性質使得不使用過濾或離心而能將所述固體表面從懸浮液體分離。因此優(yōu)選的是，所述珠子可被吸引至磁體以進行分離或者其足夠致密從而即使含有聚合物的液體十分粘稠也可通過沉淀被分離。因此，優(yōu)選的是所述珠子是順磁的或者具有充分高于所述液體密度的密度從而它們在不離心時發(fā)生沉淀，例如高于2.0g/ml，更優(yōu)選高于3.0g/ml。備選地，它們可具有充分低于所述液體密度的密度從而它們將分離以浮在所述液體上，例如空心珠，其可以是玻璃的。此類有浮力的珠子可具有低于0.8g/ml的密度,例如0.4至0.7mg/mL.
合適的致密珠子材料，或珠核心材料是氧化鋁，碳化硅，氮化硅，碳化鈦，氧化鐵(例如磁石)和玻璃。所述固體表面可以是由具有正電或負電表面基團的聚合物構成的。合適的表面基團的實例是胺，季銨，羧酸，磺酸或硫酸鹽基團。合適的材料包括硫酸葡聚糖和聚(二甲基二烯丙基氯化銨)(pDADMAC)。所述珠子可以整個是一種材料的或者可以具有帶有表面涂層的核心。我們發(fā)現(xiàn)使用呈現(xiàn)磁石表面的顆粒(未涂覆的磁石顆粒)具有特別的優(yōu)勢。此類顆粒是鐵磁的(廣義的，包括亞鐵磁的)并因此容易地從液體培養(yǎng)基中被分離且通過液體培養(yǎng)基中可溶性聚合物的存在而容易地引起微生物和/或其片段附著至此類顆粒的表面。此外，去除含有此種聚合物的液體培養(yǎng)基以及用其中不存在此種聚合物的液體對其進行替代提供了從所述固體表面去除經(jīng)捕獲的材料的便利手段。根據(jù)本發(fā)明的方法還可包括在將所述固體表面從所述液體分離后從所述固體表面洗脫所述微生物和/或片段。所述洗脫可以在廣泛的條件下進行，例如在具有150mM至6M鹽濃度的緩沖液中。此外，可包括非離子性、離子性或兩性離子去污劑、例如Tween20，Triton X-100, CTAB，十二烷基肌氨酸鈉或SDS來幫助從所述珠子表面洗脫。為了實現(xiàn)微生物和/或片段的濃縮，優(yōu)選將所述微生物和/或片段從固體表面洗脫到這樣的液體體積中:其至少2倍、例如至少4倍少于所述微生物和/或片段原本在其中懸浮的液體的體積。本發(fā)明的方法還可包括檢測被捕獲至固體表面上的微生物和/或片段。這可在從所述固體表面洗脫之后或者當所述微生物和/或片段保留在所述固體表面上時進行。這可在從所述固體表面去除水性液體之后或者當所述水性液體仍保留時進行。例如，在將微生物和/或片段捕獲至珠子之后，可加入經(jīng)標記的結合劑(例如特異于所述微生物和/或片段的抗體或者金胺染料)并且可使所述液體通過細胞分選裝置以檢測經(jīng)標記的珠子。可用微生物染料對珠子或者帶有微生物和/或片段的其它形式的固體表面進行染色，所述染色是直接的或者是在培養(yǎng)所述生物體以增加其數(shù)目之后。例如，可通過使用用于可視化的酸快速染料(acid fast stain)來顯示分枝桿菌。對于微生物本身或其細胞組分可使用其它的檢測形式，例如核酸擴增技術(如PCR)，代謝物的檢測，基于抗體的檢測(例如ELISA)。一種合適的用于檢測分枝桿菌和/或片段的ELISA方法是例如GB1004710.8中公開的。本文中所描述的捕獲方法可被用作GB1004709.0中所描述的方法的修改。所使用的檢測方法可以是要求存在活微生物的那種，例如培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明可被捕獲的微生物和/或片段包括細菌、病毒、真菌細胞、動物細胞和植物細胞，以及它們的細胞組分。通過下面的具體實施例將進一步描述和闡釋本發(fā)明。實施例1結合至不同珠子類型的生物體的證明原理使用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和光滑念珠菌(Candida glabrata)的過夜培養(yǎng)物來研究在各種條件下與各種珠子類型的結合。使用了足夠的每種培養(yǎng)物從而溶液是渾濁的且可通過眼睛追蹤結合以及隨后的洗脫。方法1.以8，OOOx g將IOml細菌培養(yǎng)物離心5min并重懸于IOml蒸餾水中以提供渾濁的生物體懸浮物。2.用 IM NaCl 或 IM NaCl，20%(w/v) PEG8000 (引起培養(yǎng)基中的 PEG 濃度為 10%)將500 μ I的每種懸浮物稀釋至1ml。3.加入25 μ I各種順磁珠子(約Img珠子)的懸浮物并孵育IOmin。4.使用磁力架將所述珠子拉至管子側邊并去除上清液。5.以8，OOOx g離心5min后就渾濁度以及生物體沉淀物的存在觀察上清液。6.為了洗脫所捕獲的生物體，將所述珠子重懸于250 μ 10.5Μ NaCl中，然后放回磁力架中。7.以8，OOOx g離心5min后就渾濁度以及生物體沉淀物的存在觀察上清液。結果結果顯示在下表中。所使用的順磁珠類型如下所列:A.BioMag Amine 珠(Bangs Laboratories,目錄號 ΒΜδ46)。B.如A中的，但是以pDADMAC涂覆。C.如B中的，但是以硫酸葡聚糖再涂一層。D.Dynalbeads M-270 胺(Invitrogen)。E.碳化硅珠子(50微米)，涂覆了 pDADMAC。F.碳化娃珠子(50微米)，未經(jīng)涂覆。
權利要求
1.將水性液體中存在的微生物和/或微生物片段捕獲到固體表面上的方法，所述方法包括在固體表面的存在下向所述液體中加入足量的水溶性聚合物以將所述微生物和/或片段從所述液體中轉移至所述固體表面。
2.權利要求1的方法，其中所述水性液體中添加的水溶性聚合物的濃度為2%至40%w/Vo
3.權利要求2的方法，其中所述濃度為5-15%w/v。
4.任意前述權利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物為非離子親水性聚合物。
5.任意前述權利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物為右旋糖苷，PVP或PEG。
6.任意前述權利要求中的方法，其中所述水溶性聚合物具有1,000至20，000的分子量。
7.權利要求6的方法，其中所述水溶性聚合物具有5，000至13，000的分子量。
8.任意前述權利要求中的方法，其中通過加入水溶性無機鹽將所述水性液體的離子強度提高至150mM至6M。
9.任意前述權利要求中的方法，其中所述鹽的濃度為0.25至2.5M。
10.任意前述權利要求中的方法，其中所述固體表面是由珠子提供的。
11.權利要求10的方法，其中所述珠子為順磁的，鐵磁的或具有使得它們在靜置時分離的密度。
12.權利要求11的方法，其中所述珠子為磁石的。
13.權利要求11的方法，其中所述珠子為碳化硅的。
14.任意前述權利要求中的方法，其中所述固體表面由具有帶正電或帶負電的表面基團的聚合物構成。
15.權利要求14的方法，其中所述表面基團為胺，季銨，羧酸，磺酸或硫酸鹽基團。
16.任意前述權利要求中的方法，還包括從所述液體中分離所述固體表面。
17.權利要求16的方法，其還包括在將所述固體表面從所述液體中分離后，從所述固體表面上洗脫所述微生物和/或片段。
18.權利要求17的方法，其中將所述微生物和/或片段從所述固體表面上洗脫到一定體積的液體中，所述體積為至少兩倍少于所述微生物和/或片段原始在其中懸浮的液體的體積。
19.任意前述權利要求中的方法，其還包括檢測被捕獲到所述固體表面上的微生物和/或片段。
20.權利要求19的方法，其還包括鑒定被捕獲到所述固體表面上的微生物和/或片段。
全文摘要
通過在固體表面的存在下向液體中加入足量的水溶性聚合物以使微生物和/或片段從液體轉移至所述固體表面而將存在于水性液體中的所述微生物、包括真菌、病毒和細菌例如分枝桿菌和/或微生物片段、例如細胞壁組分捕獲至固體表面。可通過珠子提供所述表面。所述水溶性聚合物可以是聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
文檔編號G01N33/569GK103189747SQ201180041506
公開日2013年7月3日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權日2010年7月2日
發(fā)明者C·J·斯坦利, S·M·威爾森 申請人:米克羅森斯醫(yī)療技術有限公司