專利名稱：雌二醇化學發光定量檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于體外臨床檢驗和化學發光免疫法技術領域，具體涉及一種用于雌二醇 (E2)定量檢測試劑盒及相關制備方法和使用方式。
背景技術：
雌二醇(estradiol，E2)是一種A環為苯環的18碳類固醇激素，分子量272. 4Da, 為人體雌激素(estrogen)的主要組成部分。血中70%雌二醇與性激素結合球蛋白(SHBG) 結合，25%與血漿白蛋白結合，其余為游離型。E2主要由卵巢濾泡、黃體及妊娠時胎盤產生， 極少量由睪丸合成或為睪酮的代謝物，并成為男性雌激素的主要來源。雌激素的另一組成 成分雌三醇(estriol，E3)，除孕期胎盤可直接分泌外，均為E2在肝臟中降解的代謝產物。 雌激素中除了 E2和E3外，還包括雌酮(estrone)，但三者以E2的活性最強，雌酮的活性僅 為E2的20%，E3活性最低。雌二醇的合成呈周期性變化，能夠促進女性生殖器官的形成及發育，第二性征的 出現及維持，并與孕激素協同形成月經周期。此外，還具有廣泛的代謝調劑作用。正常妊娠 E2輕度升高，胎盤娩出后急劇下降。異常妊娠時，E2大都升高，如雙胎或多胎妊娠以及糖 尿病孕婦；若E2降低，則可能為妊娠高血壓綜合征重癥、胎兒宮內死亡或葡萄胎等情況，宜 結合其它檢查予以確定，以便及時處理。此外，引起E2升高的病理性原因還可能為卵巢癌 (如卵巢顆粒層細胞瘤、卵巢胚瘤、卵巢脂肪樣細胞瘤等)、心臟病(如心肌梗塞、心絞痛、冠 狀動脈狹窄)以及其他疾病(系統性紅斑狼瘡、肝硬化、男性肥胖癥等)。病理性E2降低的 因素較多，如卵巢發育低下、原發性卵巢衰竭、垂體性閉經或不孕、柯興氏綜合征、阿狄森氏 病、惡性腫瘤、較大范圍的感染、腎功能不全、腦及垂體的局灶性病變等。由此可見，E2對于 臨床疾病的診斷具有廣泛的意義，是重要的評價指標之一。化學發光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年問世， 1985年第一代化學發光免疫試劑盒研制成功并投放市場。上世紀70年代中期Arakawe首 次報道用發光信號進行酶免疫分析，利用發光的化學反應分析超微量物質，特別是用于臨 床免疫分析中檢驗超微量活性物質。目前，這一技術已從實驗室的稀有技術過渡到臨床醫 學的常規檢測手段。化學發光免疫分析是將化學發光或生物發光體系與免疫反應相結合， 用于檢測微量抗原或抗體的一種新型標記免疫測定技術。其檢測原理與放射免疫(RIA)和 酶免疫(EIA)相似，不同之處是以發光物質作為底物，并藉助其自身的發光強度直接進行 測定。化學發光標記免疫分析是用化學發光劑直接標記抗原或抗體的免疫分析方法。常 用于標記的化學發光物質有吖啶酯類化合物一acridinium ester (AE)，是有效的發光標記 物，其通過起動發光試劑(NaOH-H2O2)作用而發光，強烈的直接發光在一秒鐘內完成，為快 速的閃爍發光。還有以三聯吡啶釕(Ru(byp)32+)標記物為發光底物，用另一反應物三丙胺 (TPA)來激發光反應，在電極表面反復進行氧化還原反應從而產生高效穩定連續發光的電 化學發光免疫分析。這些免疫分析方法都需要高精度復雜的自動測量儀器，目前在國內還難以實現。化學發光酶免疫分析是以酶標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免 疫反應，免疫反應復合物上的酶再作用于發光底物，在信號試劑作用下發光，用發光信號測 定儀進行發光測定。目前常用的標記酶為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(ALP)，它們 有各自的發光底物。HRP常用的底物為魯米諾(3-氨基鄰苯二甲酰胼，luminol)或其衍生 物如異魯米諾(4-氨基鄰苯二甲酰胼)等，魯米諾的氧化反應在堿性緩沖液中進行，在過氧 化物酶及活性氧的存在下，生成激發態中間體，當其回到基態時發光，其波長為425nm。發光 強度依賴于酶免疫反應物中酶的濃度。如果不使用增強劑，魯米諾體系的發光基本上為閃 光型且信號弱，通過加入某些特殊的增強劑可增強發光的信號并可大大延長發光的持續時 間。化學發光免疫分析既具有放射免疫的高靈敏度(檢測限度可達10_15 10_18mol/ L)，又具有酶聯免疫的操作簡便、快速的特點，易于標準化操作，且測試中不使用有害的試 劑。試劑保持期長，應用于生物學、醫學研究和臨床實驗診斷工作，成為非放射性免疫分析 法中最有前途的方法之一。但是，國外的自動化學發光酶免疫分析儀及與之相匹配的試劑 盒多采用封閉體系配合使用，價格昂貴，操作復雜，在國內不易推廣。
發明內容
本發明將化學發光技術與免疫分析技術相結合，提供了一種能夠定量檢測E2的 試齊U盒。本發明技術方案如下一種雌二醇化學發光定量檢測試劑盒，包括反應板，酶結合物，發光底物，校準品， 質控品，濃縮洗滌液，所述的反應板包被有雌二醇抗體。所述的校準品以雌二醇純品配制，濃度優選為0、25、100、250、500、1000pg/ml。所述的質控品以雌二醇純品配制，由質控品I和質控品II兩部分組成，質控品I 的濃度為3-M0pg/ml，質控品II的濃度為255-950pg/ml。所述的質控品I的濃度優選為85. 6pg/ml，質控品II的濃度優選為917. 5pg/ml。所述的酶結合物為HRP標記的雌二醇抗原，所述的反應板材質是不透明的聚苯 乙烯或聚乙烯，所述的發光底物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，所述的濃縮洗滌液是 pH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。本發明提供的試劑盒具有開放性系統，可以應用于多種不同公司的化學發光檢測 儀器，無需昂貴的專用配套儀器，并具有簡便，快速，穩定的檢測能力，易于在國內市場推
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1 :E2定量檢測試劑盒的制備
(1)抗E2的抗體包被板制備a.包被取 lmol/L Na2HPO4 77. 4ml 和 lmol/L NaH2PO4 22. 6ml 混勻，加入去離子水 定容至IOOOml即成10倍包被液，臨用前稀釋十倍，加入適量抗E2單抗(購買自Meridian lifescience)混勻，然后加入到微孔板板孔中，100 μ 1/孔，4°C 16小時；b.封閉棄去包被液，在吸水紙紙上拍干，加入含有3% BSA和0.05%防腐劑 (Procl in 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4), 200 μ 1/ 孔，37°C 2 小時；c.封袋棄去封閉液，在吸水紙上拍干，室溫下于真空干燥箱中抽5小時，立即進 行真空封袋，檢查有無漏氣，如有重新封袋，貼上標簽后于2-8°C保存。(2)酶標記物的制備用含有2. 5% BSA、1.5%的脫脂奶粉和0.05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽 緩沖液(pH 7.4)配制緩沖系統。E2(購買自Meridian lifescience)用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶交聯。(3) E2校準品的制備用含有3% BSA和0. 05%防腐劑(Proclin 300)的磷酸鹽緩沖液(pH 7. 4)配制 緩沖系統。用E2純品配制校準品工作液(E2純品購買自Meridian lifescience)，分別為 0、25、100、250、500、1000pg/ml 共 6 個濃度。(4) E2質控品的制備小牛血清與去離子水6 4混合，并添加0. 05%防腐劑(Proclin 300)，配制成 質控品緩沖液。用E2純品制備質控品工作液(E2純品購買自Meridian lifescience)分裝 85. 6pg/ml、917. 5pg/ml。(5)化學發光底物液的制備使用 PIERCE 公司的SuperSignaf ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate 作為配套檢測液。A液、B液各1瓶。(6) 20 X濃縮洗滌液制備取NaCl 170g吐溫-20 IOml加水定容至IL即成，臨用前稀釋20倍。(7)半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝后即為半成品。抽檢合格后組裝成試劑盒成品，成品還需 抽檢，合格后才能出廠。實施例2 :E2定量檢測試劑盒的使用方法1.試劑和樣本準備(1)試劑準備a.將試劑盒置室溫(1816°C )平衡20分鐘。b.從試劑盒中取出濃縮洗滌液，用新鮮的純化水1 20稀釋后加入洗板機的洗液 瓶中。(2)樣本準備使用前將待測的合格血清或血漿置室溫(1846°C )平衡20分鐘。2.操作步驟a.取出所需的E2抗體包被微孔板置于微孔架上
b.加入校準品1-6、質控品1-2和待測樣本，每孔20 μ 1。c.加入酶標記物100 μ 1/孔。d.輕柔震蕩混勻。e.室溫孵育35分鐘。f.棄去孔內廢液。手工洗滌棄去孔內液體，洗滌液注滿各孔、靜置5秒，甩干，重復5次后拍干；洗板機洗滌每孔350 μ 1，重復4次，洗滌后拍干。g.加發光底物A、B每孔各50μ 1，充分混勻，立刻加入化學發光儀中檢測信號值。3.實驗結果的計算可以采用作圖法或計算法進行結果計算作圖法以標準品抗原含量的Ig值為橫坐標⑴，以其對應的信號值為縱坐標⑴ 繪制出標準曲線，然后根據檢測樣本測得的信號值在標準曲線上查出相應的抗原含量Ig 值，再計算出抗原含量。計算法以標準品抗原含量的Ig值為自變量(X)，以其對應的信號值為因變量 (Y)，求出回歸方程，將待測標本的信號值帶入回歸方程，求得相應的抗原含量。
權利要求
1.一種雌二醇化學發光定量檢測試劑盒，其特征在于，包括反應板，酶結合物，發光底 物，校準品，質控品，濃縮洗滌液，所述的反應板包被有雌二醇抗體。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的校準品以雌二醇純品配制，濃度為 0、25、100、250、500、1000pg/ml。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的質控品以雌二醇純品配制，由 質控品I和質控品II兩部分組成，質控品I的濃度為3-M0pg/ml，質控品II的濃度為 255-950pg/mlo
4.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的質控品I的濃度為85.6pg/ml，質 控品II的濃度為917. 5pg/ml。
5.如權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶結合物為HRP標記的雌二醇，所 述的反應板材質是不透明的聚苯乙烯或聚乙烯，所述的發光底物為魯米諾、異魯米諾或其 衍生物，所述的濃縮洗滌液是pH7. 0-pH8. 0的中性緩沖液。
全文摘要
本發明公開了一種雌二醇化學發光定量檢測試劑盒，該試劑盒包括雌二醇檢測反應板，反應板包被有雌二醇抗體。雌二醇定量檢測試劑盒，還包括酶結合物，發光底物，校準品，質控品，濃縮洗滌液。本發明可以專一的定量檢測出病人血清雌二醇的含量，用于輔助診斷卵巢發育低下、原發性卵巢衰竭、垂體性閉經或不孕、柯興氏綜合征、阿狄森氏病、惡性腫瘤、腦及垂體的局灶性病變等疾病。與傳統的ELISA技術相比，本發明不僅保留了ELISA技術的高度特異性，檢測結果的穩定性、可靠性和操作的簡便性，同時采用的化學發光法能提高檢測的靈敏度。
文檔編號G01N33/74GK102095880SQ20091020039
公開日2011年6月15日 申請日期2009年12月11日 優先權日2009年12月11日
發明者汪寧梅, 王通, 穆宇豪, 穆海東 申請人:上海裕隆生物科技有限公司
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