一種篩選、檢測磷脂酶c的方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測磷脂酶C酶活的方法以及檢測磷脂酶C酶活的產品。使用本發明的方法或產品，可以精確定量酶活，檢測成本低，便于大量篩選、檢測，還便于高通量進行篩選或檢測。
【專利說明】一種篩選、檢測磷脂酶c的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及磷脂酶C檢測領域，具體而言，涉及一種篩選、檢測磷脂酶C的方法。
【背景技術】
[0002] 食用油精煉過程中的脫膠一直是精煉工藝發展的難題。常用的水化脫膠，酸煉脫 膠等化學法脫膠手段，都無法高效、低殘留地去除毛油中的磷脂，并且去除磷脂的同時還會 吸附大量的食用油，降低了精煉產率。近年來酶法脫膠是研究的熱點。鑒于生物酶反應具有 特異性，高效性及可控性等一系列優點，該脫膠法可以對食用油中的磷脂進行有效地去除， 并且減少脫膠過程中食用油的損失，雖然現在還未廣泛采用，但是理論上認為酶法脫膠是 優于傳統脫膠方法的。例如在sn-3位酶切下磷酯酰基團，從而使油中的磷脂分解成甘油二 酯及溶于水的磷酸復合物(磷脂頭)，這類酶被稱為磷脂酶C(PLC)。磷脂酶C大致按底物類 型可以分為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C (PC-PLC)，磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C (PI-PLC)、 磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C (PE-PLC)以及磷脂酸特異性磷脂酶C (PA-PLC)等。
[0003] 在豐富的微生物來源中尋找產出高活力PLC的菌種，是現今磷脂酶研究的主要方 向之一。怎樣在龐大復雜的微生物群落中快速地找到目標菌種，是研究中技術需要突破的 地方，其實也就是指PLC活力的檢測及其高通量篩選的方法開發。
[0004] PLC酶活力檢測的方法現在已有很多（高林.微生物磷脂酶C檢測方法的研究進 展.Journal of Anhui Agri Sci2010, 38(23):12412-12413):如
[0005] 卵黃平板法：根據PLC對平板培養基中的卵黃中卵磷脂的水解作用，會在平板上 產生乳白色暈圈，根據暈圈直徑大小來判斷酶活高低。由于材料簡單，操作方便，在酶活力 初篩時被廣泛應用，但是無法用于精確定量檢測酶活，一般只能用于定性檢測。
[0006] 酸堿滴定法：利用PLC水解卵磷脂釋放出的酸性水解產物，即磷酸膽堿，然后用 NaOH來滴定磷酸膽堿的量，從而測定PLC的活力。該方法特點反應時間快，但是釋放出的酸 性水解產物量少，滴定誤差大、操作繁瑣，工作效率太低。
[0007] 放射性同位素法：利用不同的放射性同位素標記不同的磷脂底物，待PLC水解各 種底物后，利用放射性檢測設備就可以對不同放射性同位素標記的水解產物進行檢測，從 而不僅可以對該PLC的活力進行測定，對其磷脂底物的偏好性也可以進行了解。該方法專 一性強，結果準確，但是技術性過高、底物昂貴并且對儀器設備有要求。
[0008] NPPC法：該法利用一種卵磷脂類似結構的合成物質，即對硝基磷酸膽堿（NPPC)， 作為PLC的反應底物，水解后產生了對硝基苯酚，該物質在410nm處有最大吸收波長。此法 重復性好，操作方便，反應時間短，但是由于合成物質成本較大，所以有一定的局限性。
[0009] HPLC法：利用HPLC對PLC的水解產物進行紫外分析，此法準確度最好，并且能掌 握底物消耗速率，特異性的底物種類等多種信息，但是由于技術性過高，對技術人員的儀器 操作水平等都有較高的要求，并且成本較高、檢測速度慢，所以未被廣泛采用。
[0010] 熒光標記法，化學發光檢測法及分光光度法：這幾類方法采用的策略相似，分別 利用熒光基團，發光基團等標記了磷脂底物，經PLC水解，分別通過熒光檢測，底片感光或 者分光光度計對產物進行檢測。這些方法策略是現在PLC檢測方法開發的主要方向，特異 性強，靈敏度高，具有很好的準確度，但是底物合成困難、合成成本較高，也存在一定的局限 性。
[0011] 鑰藍定磷法：經PLC水解磷脂底物后，釋放出的磷酸復合物，經磷酸酶作用，可以 水解出無機磷酸。在酸性條件下，經還原劑作用，無機磷酸可以與鑰酸鹽形成鑰藍絡合物， 從而在680-800nm處有吸收值，從而對PLC的活力進行測定。
[0012] 鑰藍定磷法的起始思想是來自于混合樣品中用于測定含磷量的方法：將樣品酸解 或灼燒，使其中的有機磷全部轉化為無機磷，從而通過鑰藍定磷法檢測總磷含量，即為國標 方法中的定磷法。但是將其應用至磷脂酶活力檢測是后續發展的一個新方向。然而在之前 的文獻報道中顯示，該方法雖然具有很好的重復性，但是為了保證PLC反應后的磷酸復合 物最大程度地釋放無機磷酸，對磷酸酶的用量要求很大，而且為了避免反應中其他因素生 成磷鑰藍絡合物，需要有一定的方法來去除這些因素的影響。
[0013] 在一些研究中已經報道磷脂酶的活力檢測進入高通量篩選模式。Invitrogen公司 的AmplexRedphosphatidylcholine試劑盒[9]以多重生物酶反應為手段，可以針對磷脂 酰膽堿特異性的磷脂酶C進行檢測。當磷脂酶C對磷脂酰膽堿切下磷酸膽堿后，利用磷酸 酶切下膽堿單體，使其在膽堿氧化酶的作用下被氧化，釋放出過氧化氫，從而利用辣根過氧 化物酶產生化學發光。而該試劑盒中的AmplexRed試劑是一種突光試劑，在化學發光產生 的情況下，會受到該波長的光從而被激發出熒光，最后通過熒光檢測，可以對PLC活力進行 測定。該方法特異性強，靈敏度高，但是也具有很多局限性。例如由于該試劑盒中的特色試 劑是與膽堿單體連接的，所以只能檢測磷脂酰膽堿特異性的磷脂酶活力，并且底物合成成 本較大，不適合高通量篩選用途；多重生物酶反應由于其復雜性，也具有弊端，從產物發生 到熒光檢測，其中任何一個物質反應出現問題就會造成結果無法分析。
【發明內容】
[0014] 本發明的發明人發現，使用磷脂酶C(例如磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰肌醇 特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、磷脂酸特異性磷脂酶C)和/或稀釋后的磷 脂酶C酶解復合磷脂(包括但不限于大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂)，然后將酶解 液固液分離，將獲得的溶液加入到磷酸酶反應體系中反應，再將反應液與鑰酸或鑰酸鹽(例 如包括但不限于鑰酸銨、鑰酸鈉、鑰酸鉀)溶液接觸，檢測吸光值，在一定的稀釋度下，PLC的 酶活與鑰藍吸光值正相關，因此，可以使用該方法檢測PLC酶活。發明人還發現，該方法可 直接用于發酵液中PLC酶活的檢測。發明人還發現，在合適的稀釋度下，僅根據吸光值的大 小就可確定發酵液的酶活的相對高低，因此，可用于菌株的快速篩選或發酵條件的快速選 擇。發明人還發現，使用有機溶劑和/或水溶解的復合磷脂，均可用于本發明，但當使用有 機溶劑(包括但不限于三氯甲烷）溶解復合磷脂時，其反應速度明顯快于使用水溶解復合磷 脂的反應速度。
[0015] 因此，本發明的一個目的在于，提供一種檢測磷脂酶C酶活的方法.
[0016] 本發明提供的方法包括以下步驟：
[0017] 1)使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0018] 2 )固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值；
[0019] 3)確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度，
[0020] 4 )計算所述磷脂酶C酶活。
[0021] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂為：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一種或多種。
[0022] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于水和/或有機溶劑中。
[0023] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于有機溶劑。
[0024] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于三氯甲烷。
[0025] 在本發明的一個實施方案中，所述分離后溶液與磷酸酶接觸為：將分離后溶液與 磷酸酶于30-45°C反應30min以上。
[0026] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為35_42°C。
[0027] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為37-40°C。
[0028] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應時間為0. 5h_2h。
[0029] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測600_810nm的吸光值。
[0030] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測650-750nm的吸光值。
[0031] 在本發明的一個實施方案中，所述磷脂酶C為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
[0032] 本發明還提供了一種篩選表達磷脂酶C的菌株的方法。
[0033] 本發明提供的方法包括以下步驟：
[0034]1)使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0035]2)固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值。
[0036] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂為：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一種或多種。
[0037] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于水和/或有機溶劑中。
[0038] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于有機溶劑。
[0039] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于三氯甲烷。
[0040] 在本發明的一個實施方案中，所述分離后溶液與磷酸酶接觸為：將分離后溶液與 磷酸酶于30-45°C反應30min以上。
[0041] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為35-42°C。
[0042] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為37-40°C。
[0043] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應時間為0. 5h_2h。
[0044] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測600_810nm的吸光值。
[0045] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測650_750nm的吸光值。
[0046] 在本發明的一個實施方案中，所述磷脂酶C為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
[0047] 本發明還提供了一種檢測發酵液中磷脂酶C酶活的方法。
[0048] 本發明提供的方法包括以下步驟：
[0049] 1)使用發酵液和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0050] 2 )固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值；
[0051] 3)確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度；
[0052] 4 )計算所述磷脂酶C酶活。
[0053] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂為：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂， 蓖麻磷脂中的一種或多種。
[0054] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于水和/或有機溶劑中。
[0055] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于有機溶劑。
[0056] 在本發明的一個實施方案中，使用的復合磷脂溶于三氯甲烷。
[0057] 在本發明的一個實施方案中，所述分離后溶液與磷酸酶接觸為：將分離后溶液與 磷酸酶于30-45°C反應30min以上。
[0058] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為35_42°C。
[0059] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為37-40°C。
[0060] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應時間為0. 5h_2h。
[0061] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測600_810nm的吸光值。
[0062] 在本發明的一個實施方案中，所述檢測吸光值為檢測650-750nm的吸光值。
[0063] 在本發明的一個實施方案中，所述磷脂酶C為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰 肌醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
[0064] 本發明還提供了一種檢測磷脂酶C酶活的產品。
[0065] 本發明提供的產品包括：復合磷脂或復合磷脂溶液，磷酸酶儲存體系溶液，磷酸酶 反應體系溶液，和鑰藍顯色反應物溶液。
[0066] 在本發明的一個實施方案中，所述產品為檢測試劑盒。
[0067] 在本發明的一個實施方案中，所述產品還包括磷脂酶反應體系溶液。
[0068] 在本發明的一個實施方案中，所述磷脂酶為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰肌 醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
[0069] 本專利中，將鑰藍定磷法應用到PLC的活力檢測，磷酸酶對磷酯酰基團（磷脂經磷 脂酶作用后的產物）沒有選擇性，因而優于上述方法的磷脂酶底物局限性；鑰藍法對游離磷 的檢測技術很成熟，因而本方法可以用于精確定量酶活；可使用復合磷脂(包括但不限于大 豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂）作為酶活檢測底物，磷酯酰基團量低因而磷酸酶用 量很少，所以檢測成本低，便于大量篩選、檢測；反應體積上進行了小量化，使之能在96孔 板規模上進行，便于高通量進行篩選或檢測；本方法在去除未反應的磷脂底物方法上進行 了改進，直接將復合磷脂溶于氯仿，使PLC酶在一個兩相體系中反應，這樣優于利用有機溶 劑來萃取底物的方法，不僅操作簡便，而且可以將復合磷脂中的雜質成分隔離在有機相，不 會影響到水相的后續檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0070] 圖1為磷鑰藍檢測的標準曲線。
[0071] 圖2顯示磷酸酶反應速度與底物（P0，）濃度增加的關系。
[0072] 圖3顯示磷酸酶（CIAP)反應產物生成率與其濃度增加的關系。
[0073] 圖4顯示磷鑰藍絡合物在700nm處吸光值與PLC濃度的關系。
【具體實施方式】
[0074] 本文所公開的"范圍"以下限和上限的形式。可以分別為一個或多個下限，和一個 或多個上限。給定范圍是通過選定一個下限和一個上限進行限定的。選定的下限和上限限 定了特別范圍的邊界。所有可以這種方式進行限定的范圍是包含和可組合的，即任何下限 可以與任何上限組合形成一個范圍。例如，針對特定參數列出了 60 - 120和80 - 110的 范圍，理解為60 - 110和80 - 120的范圍也是預料到的。此外，如果列出的最小范圍值1 和2,和如果列出了最大范圍值3,4和5,則下面的范圍可全部預料到：1 一 3、1 一 4、1 一 5、 2 - 3、2 - 4、和 2 - 5。
[0075] 在本發明中，除非有其他說明，組合物的各組分的含量范圍以及其優選范圍之間 可以相互組合形成新的技術方案。
[0076] 在本發明中，除非有其他說明，"其組合"表示所述各元件的多組分混合物，例如兩 種、三種、四種以及直到最大可能的多組分混合物。
[0077] 在本發明中，除非有其他說明，所有"份"和百分數（％)都指重量百分數。
[0078] 在本發明中，除非有其他說明，所有組合物中各組分的百分數之和為100%。
[0079] 在本發明中，除非有其他說明，數值范圍"a_b"表示a到b之間的任意實數組合的 縮略表示，其中a和b都是實數。例如數值范圍"0-5"表示本文中已經全部列出了 "0-5" 之間的全部實數，"0-5"只是這些數值組合的縮略表示。
[0080] 在本發明中，除非有其他說明，整數數值范圍"a-b"表示a到b之間的任意整數組 合的縮略表示，其中a和b都是整數。例如整數數值范圍"1-N"表示1、2……N，其中N是 整數。
[0081] 如果沒有特別指出，本說明書所用的術語"一種"指"至少一種"。
[0082] 如果沒有特別指出，本發明所述的百分數(包括重量百分數）的基準都是所述組合 物的總重量。
[0083] 在本文中，除非另有說明，各組分的比例或者重量都指干重。
[0084] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有實施方式以及優選實施方 式可以相互組合形成新的技術方案。
[0085] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有技術特征以及優選特征可 以相互組合形成新的技術方案。
[0086] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的所有步驟可以順序進行，也可以 隨機進行，但是優選是順序進行的。例如，所述方法包括步驟（a )和（b )，表示所述方法可包 括順序進行的步驟（a)和（b)，也可以包括順序進行的步驟（b)和（a)。例如，所述提到所述 方法還可包括步驟（c)，表示步驟（c)可以任意順序加入到所述方法，例如，所述方法可以 包括步驟（a)、（b)和（c)，也可包括步驟（a)、（c)和（b)，也可以包括步驟（c)、（a)和（b)等。 [0087] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文所提到的"包括"表示開放式，也可以是封 閉式。例如，所述"包括"可以表示還可以包含沒有列出的其他元件，也可以僅包括列出的 元件。
[0088] 在本發明中，如果沒有特別的說明，本文實施例中的具體數值以及具體物質可與 本文描述部分的其他特征結合。例如，本文描述部分提到反應的溫度為l〇-l〇〇°C，而實 施例提到的反應溫度為20°c，那么可以認為本文已經具體公開了 10-20°c的范圍，或者 20-100°C的范圍，且該范圍可以描述部分的其他特征結合起來形成新的技術方案。又例如， 本文描述部分提到一類化合物醇，而實施例提到的具體的醇為乙醇，那么乙醇可以與描述 部分的其他特征結合起來形成新的技術方案。
[0089] 本發明的發明人發現，使用磷脂酶C(例如磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰肌醇 特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C、磷脂酸特異性磷脂酶C)和/或稀釋后的磷 脂酶C酶解復合磷脂(包括但不限于大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂)，然后將酶解 液固液分離，將獲得的溶液加入到磷酸酶反應體系中反應，再將反應液與鑰酸或鑰酸鹽(例 如包括但不限于鑰酸銨、鑰酸鈉、鑰酸鉀)溶液接觸，檢測吸光值，在一定的稀釋度下，PLC的 酶活與鑰藍吸光值正相關，因此，可以使用該方法檢測PLC酶活。發明人還發現，該方法可 直接用于發酵液中PLC酶活的檢測。發明人還發現，在合適的稀釋度下，僅根據吸光值的大 小就可確定發酵液的酶活的相對高低，因此，可用于菌株的快速篩選或發酵條件的快速選 擇。發明人還發現，使用有機溶劑和/或水溶解的復合磷脂，均可用于本發明，但當使用有 機溶劑(包括但不限于三氯甲烷）溶解復合磷脂時，其反應速度明顯快于使用水溶解復合磷 脂的反應速度。
[0090] 在本發明中，術語"磷酸酶"指的是能催化磷酸單酯的水解的酶，但不能催化磷酸 二酯以及磷酸三酯的水解的磷酸酶。
[0091] 因此，本發明提供了一種檢測PLC酶活的方法，該方法包括以下步驟：
[0092] 1)使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0093] 2 )固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值；
[0094] 3)確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度；
[0095] 4 )計算所述磷脂酶C酶活。
[0096] 本發明還提供了一種篩選表達磷脂酶C的菌株的方法，該方法包括以下步驟： [0097] 1)使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0098] 2 )固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值。
[0099] 本發明還提供了一種檢測發酵液中磷脂酶C酶活的方法，該方法包括以下步驟：
[0100] 1)使用發酵液和/或其稀釋液酶解復合磷脂；
[0101] 2 )固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸 光值；
[0102] 3)確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度；
[0103] 4 )計算所述磷脂酶C酶活。
[0104] 在本發明的一個實施方案中，所述復合磷脂為本領域中常規使用的復合磷脂，包 括但不限于：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂中的一種或多種。
[0105] 在本發明的一個實施方案中，所述的磷脂酶C為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂 酰肌醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶C和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
[0106] 在本發明的一個實施方案中，所述復合磷脂溶于水、有機溶劑或水與有機溶劑組 成的混合溶劑中。
[0107] 在本發明的另一個實施方案中，所述復合磷脂溶于有機溶劑。
[0108] 在本發明的另一個實施方案中，所述復合磷脂溶于三氯甲烷。
[0109] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系為包含磷酸酶、Mg2+和緩沖液的 磷酸酶反應體系。
[0110] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系為包含磷酸酶、Ca2+和緩沖液的 磷酸酶反應體系。
[0111] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系中的磷酸酶為l〇_15U/mL。
[0112] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系中的Mg2+為2-20mM。
[0113] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系中的Ca2+為2_20mM。
[0114] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系的緩沖液為 40-100mMTris-Cl(pH8. 0-9. 0)〇
[0115]在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系包含10-15U/mL磷酸酶，2_20mM Mg2+ 和 / 或 40-100mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)。
[0116]在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系包含10-15U/mL磷酸酶，2_20mM Ca2+ 和 / 或 40-100mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)。
[0117] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶反應體系為：50mM Tris-Cl (pH9.0)， 10mM MgCl2，堿性磷酸酶 10U/mL。
[0118] 在本發明的一個實施方案中，使用的鑰酸鹽為鑰酸銨、鑰酸鈉、鑰酸鉀中的一種或 多種。
[0119] 在本發明的一個實施方案中，使用的鑰酸鹽的濃度為2-3%，優選為2. 4-2. 6%。
[0120] 在本發明的一個實施方案中，使用的鑰酸鹽的濃度為2%，2. 1%，2. 2%，2. 3%，2. 4%， 2. 5%，2. 6%，2. 7%，2. 8%，2. 9%，或 3. 0%。
[0121] 在本發明的一個實施方案中，所述分離后溶液與磷酸酶接觸為：將分離后溶液與 磷酸酶于30-45°C反應至少30min。
[0122] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為35_42°C。
[0123] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為37-40°C。
[0124] 在本發明的一個實施方案中，分離后溶液與磷酸酶的反應溫度為3〇°c，3rc， 32°C，33°C，34°C，35°C，36°C，37°C，38°C，39°C，4(TC，41°C，42°C，43 攝氏度，44°C，或 45°C。
[0125] 在本發明的一個實施方案中，所述分離后溶液與磷酸酶的反應時間為0. 5_2h。
[0126] 在本發明的一個實施方案中，與磷鑰藍標準曲線比較，確定不同稀釋度下磷脂酶C 酶活與吸光值線性相關區域。
[0127] 在本發明的一個實施方案中，于600-810nm檢測吸光值，優選于650-750nm檢測吸 光值。
[0128] 在本發明的一個實施方案中，于 600nm，610nm，620nm，630nm，640nm，650nm，660nm, 670nm，680nm，690nm，700nm，710nm，720nm，730nm，740nm，750nm，760nm，770nm，780nm， 690nm，800nm，或810nm檢測吸光值。
[0129] 在本發明的一個實施方案中，計算所述磷脂酶C酶活為：計算吸光值線性相關的 稀釋度下磷脂酶C酶活，計算上述稀釋度下磷脂酶C酶活的平均值。
[0130] 本發明還提供了一種檢測磷脂酶C酶活的產品。
[0131] 本發明提供的產品包括：復合磷脂或復合磷脂溶液，磷酸酶儲存體系溶液，磷酸酶 反應體系溶液，和鑰藍顯色反應物溶液。
[0132] 在本發明的一個實施方案中，本發明提供的產品包括磷脂酶反應體系溶液。在本 發明中，可使用的磷脂酶反應體系溶液為本領域的技術人員所熟知的體系，也可根據本發 明公開的內容或實際需要，進行適當調整。在本發明的一個實施方案中，磷脂酶反應體系溶 液包括緩沖體系及提供PLC反應所需的活性金屬離子。在本發明的一個實施方案中，PLC 反應所需的活性金屬離子為Ca 2+，Zn2+中的一種或多種；緩沖體系為pH6. 5-8. 0的緩沖溶 液，優選的緩沖溶液為Tris-Cl。在本發明的一個實施方案中，用于PLC反應的溶液包括： 25-50mM Tris-Cl (pH6. 5-8. 0),2-5mM CaCl2〇
[0133] 在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶儲存體系溶液包括磷酸酶及穩定所述磷 酸酶的溶液。在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶儲存體系溶液包括400-10, 000U/mL 的磷酸酶。在本發明的一個實施方案中，所述磷酸酶儲存體系溶液中穩定所述磷酸酶的溶 液包括：50-150mM Tris-Cl(pH8. 0-9. 0)，5-10mM MgCl2。在本發明的一個實施方案中，所述 磷酸酶儲存體系溶液為：50-150mM Tris-Cl (pH8. 0-9. 0)，5-10mM MgCl2,500U/mL 磷酸酶。
[0134] 在本發明中，可使用的磷酸酶反應體系溶液為本領域的技術人員所熟知的體系， 也可根據本發明公開的內容或實際需要，進行適當調整。在本發明的一個實施方案中，用于 磷酸酶反應體系溶液包括緩沖體系及提供磷酸酶反應所需的活性金屬離子。在本發明的一 個實施方案中，磷酸酶反應所需的活性金屬離子為Mg 2+，Ca2+中的一種或多種；緩沖體系為 pH8. 0-9. 0的緩沖溶液，優選的緩沖溶液為Tris-Cl。在本發明的一個實施方案中，用于磷 酸酶反應的溶液包括：200-500mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，10-100mM MgCl2。
[0135] 在本發明中，可使用的鑰藍顯色反應物溶液為本領域的技術人員所熟知的體系， 也可根據本發明的內容或實際，進行適當調整。在本發明的一個實施方案中，鑰藍顯色反應 物溶液包括鑰酸或鑰酸鹽溶液和硫酸。在本發明的一個實施方案中，所述鑰酸鹽為鑰酸銨， 鑰酸鈉和鑰酸鉀中的一種或多種。在本發明的一個實施方案中，鑰藍顯色反應物溶液包括 0? 1-0. 2%(w/v)鑰酸銨溶液，l-5%(v/v)硫酸。
[0136] 在本發明的一個實施方案中，該產品為檢測試劑盒。
[0137] 在本發明的一個實施方案中，檢測磷脂酶C酶活的產品中包括：
[0138] 提供PLC酶反應的底物的試劑1，例如可使用1-5% (w/v)的用氯仿溶解的復合磷 脂。
[0139] 進行磷酸酶反應的緩沖體系及提供磷酸酶反應所需的活性金屬離子的試劑2,例 如可使用 200-500mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，10-100mM MgCl2。
[0140] 提供反應所需的磷酸酶的試劑3,例如可使用400-10, OOOU/mL堿性磷酸酶， 50-150mM Tris-Cl (pH8. 0-9.0)，5-10mM MgCl2, 20-50% 甘油。
[0141] 提供鑰藍顯色反應所需的反應物的試劑4,例如可使用0. 1-0. 2%(w/v)鑰酸銨溶 液，1 -5% (v/v)硫酸。
[0142] 在本發明的一個實施方案中，檢測磷脂酶C酶活的產品中還包括：
[0143] 進行PLC反應的緩沖體系及提供PLC反應所需的活性金屬離子的試劑5,例如可使 用 25-50mM Tris-Cl (pH6. 5-8.0)，2-5mM CaCl2。
[0144] 本發明的產品使用時，還需要加入提供鑰藍顯色反應所需的還原劑，為更好地使 用還原劑，通常需要新鮮配制，因此，大多數情況下由使用者自制，也可以在產品中包括還 原劑。在使用本發明的產品的一個實施方案中，所述還原劑為8%_10%( w/v )抗壞血酸，1%-2% 氯化亞錫，或0. 5%-1%苯酚。
[0145] 實施例
[0146] 在本發明的下述實施例中，牛小腸來源的堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase-Calf intestine, AP)購自Takara公司，磷脂酰膽堿特異性磷脂酶購自帝斯 曼（中國）有限公司。
[0147] 實施例1、標準曲線制備
[0148] 取烘干的磷酸氫二鉀試劑粉末0. 1431g，溶于去離子水，定容至100mL，配制成 lmg/mL P0廣的磷酸氫二鉀溶液。
[0149] 從lmg/mL P0廣的磷酸氫二鉀溶液分別取出0, 2, 5,8,10,15, 20, 50 ii L，加入去離 子水補足至940 ii L，再加入20 ii L的10% (w/v)抗壞血酸溶液，搖勻30s后加入40 ii L的 2. 5% (w/v)鑰酸銨溶液(溶劑為30%硫酸溶液)，最后定容至lmL，最終的P0廣濃度是0, 2， 5,8,10,15, 20, 50 ii g/mL。每個濃度點平行做3個重復樣品。
[0150] 37°C水浴lOmin后，在吸光度700nm下進行吸光值檢測，對得到的數據進行線性擬 合，即得到磷鑰藍檢測的標準曲線，結果如圖1所示。
[0151] 圖1結果顯示：P0廣濃度在0-10 U g/mL的范圍內，磷鑰藍檢測無機磷的方法在線 性區間內，經擬合獲得線性回歸方程如下：y=〇. 〇58*x，R2=0. 9989。
[0152] 實施例2、
[0153] 配制 10 ii g/ ii L P043-的磷酸膽堿溶液，分別取 0, 5,10, 20,40, 50,80 ii gP043-的磷 酸膽堿溶液于總體系l〇〇y L中，該反應體系還含有50mM Tris-Cl (pH9. 0)，10mM MgCl2，加 入堿性磷酸酶到10U/mL。
[0154] 37°C水浴30min，加入到840iiL去離子水中，再加入20iiL的10%(w/v)抗壞血酸 溶液，搖勻30秒后加入40 y L的2. 5% (w/v)鑰酸銨溶液，最后定容至lmL。
[0155] 37°C水浴10min，在吸光度700nm下進行吸光值檢測，將得到的吸光值進行線性回 歸后得到對應的p〇43_的質量，將由此得到的產物p〇43_質量數除以起初加入的底物p〇43_質 量數，再除以反應時間，即得到相同量的堿性磷酸酶在不同底物p〇43_質量數時的反應速度。 以p〇43_底物質量數為橫坐標，以計算得到的反應速度為縱坐標，獲得兩者的關系，結果如圖 2所示。
[0156] 圖2結果顯示：30min反應過程中，P0廣底物量為50ii g時，反應速度已經不再明 顯增加，因此，選擇P〇/_底物量為50 y g，作為后續試驗的優化條件。
[0157] 實施例3、
[0158] 將堿性磷酸酶進行梯度稀釋，分別取0,0. 05,0. 1，0. 2,0. 4,0. 5，1.0，1.5U于 lOOuL體系中，該反應體系還含有50mM Tris-Cl (pH9. 0)，10mM MgCl2,50iig P0廣的磷酸 膽堿溶液。
[0159] 37°C水浴30min，按實施例2的方法進行鑰藍法顯色及檢測，將得到的吸光值進行 線性回歸后得到對應的P〇/_的質量，將由此得到的產物P〇/_質量數除以起初加入的50iig 底物P〇/_，再乘以100%，即得到反應產物P〇/_的生成率。以堿性磷酸酶濃度為橫坐標，以反 應產物生成率為縱坐標，獲得兩者的關系，結果如圖3所示。
[0160] 圖3結果顯示：隨著CIAP酶量的增加，反應的產物生成率也增加，當達到10U/mL 時，產物率幾近平緩，指在P0廣底物（50 y g)富余情況下，10U/mL的堿性磷酸酶量已經能夠 進行最大的酶切力。因此，以10U/mL的堿性磷酸酶量作為后續試驗的優化條件。
[0161] 實施例4
[0162] 本實施例中，以大豆磷脂作為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶（PC-PLC，以下簡稱 PLC)的反應底物，檢測PLC酶活，并以p-NPPC合成底物的方法（Kook-HwaSeo&JongII Rhee.High-levelexpressionofrecombinantphospholipaseCfromBacillus cereusinPichiapastorisanditscharacterization. (2004)Biotechnology Letters26:1475 - 1479)檢測PLC酶活，進行對比，具體過程如下：
[0163] 4.1兩相反應
[0164] 將大豆磷脂溶于氯仿，進行兩相反應。
[0165] 在200iiL的反應體系中，含有終濃度0? 5%(w/v)的大豆磷脂，25mM Tris-Cl (pH7. 5)，5mM CaCl2。再對 PLC 酶進行稀釋，稀釋比例分別為 1:25,1:50,1:100,1:200， 1:400,1:500,1:800,1:1000,1:1600,1:2000,1:3200,1:4000,1:6400,1:12800,1:25600， 將每個稀釋度的酶液20 y L加入到反應體系中。對照組采用沸水浴5min的PLC并進行 1:500稀釋。將樣品置于37°C搖床上進行15min，30min，60min的反應，搖床轉速為150rpm。 再于 12, OOOrpm 離心 2min。
[0166] 吸取離心后的上清80iiL于lOOiiL的磷酸酶反應體系中，該體系還含有50mM Tris-Cl(pH9.0)，10mMMgCl2，AP10U/mL。在 37°C，水浴 30min。
[0167] 反應后，加入840iiL的離子水，再加入20iiL的10% (w/v)的抗壞血酸，及40iiL 的2. 5% (w/v)鑰酸銨溶液。37°C顯色10min。取顯色后的溶液于700nm檢測吸光度，其中， 反應301^11的檢測結果（？^：酶稀釋比例為1 :500-1:6400)如表1所示，并以于沸水浴5111111 滅活的PLC酶作為變性對照。
[0168] 表1磷鑰藍法對梯度稀釋后的商品酶PLC的活力檢測結果
[0169]
【權利要求】
1. 一種檢測磷脂酶C酶活的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂； 2) 固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸光 值； 3) 確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度， 4) 計算所述磷脂酶C酶活。
2. -種篩選表達磷脂酶C的菌株的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 使用磷脂酶C和/或其稀釋液酶解復合磷脂； 2) 固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸光 值。
3. -種檢測發酵液中磷脂酶C酶活的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： 1) 使用發酵液和/或其稀釋液酶解復合磷脂； 2) 固液分離，使用分離后溶液與磷酸酶接觸后，與鑰酸或鑰酸鹽溶液接觸，檢測吸光 值； 3) 確定磷脂酶C酶活與鑰藍吸光值線性相關的稀釋度； 4) 計算所述磷脂酶C酶活。
4. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于， 所述復合磷脂為：大豆磷脂，花生磷脂，芝麻磷脂，蓖麻磷脂中的一種或多種。
5. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述復合磷脂溶于水、有機溶劑 或水與有機溶劑組成的混合溶劑中，優選的有機溶劑為：三氯甲烷。
6. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述分離后溶液與磷酸酶接觸 為：將分離后溶液與磷酸酶于30_45°C反應30min以上，分離后溶液與磷酸酶的優選反應溫 度為35-42°C，更優選為37-40°C，優選的反應時間為0. 5h-2h。
7. 如權利要求1-3中任一項所述的方法，其特征在于，所述檢測吸光值為檢測 600-810nm的吸光值，優選為650-750nm的吸光值。
8. -種檢測磷脂酶C酶活的產品，其特征在于，所述產品包括：復合磷脂或復合磷脂溶 液，磷酸酶儲存體系溶液，磷酸酶反應體系溶液，和鑰藍顯色反應物溶液；優選的產品為檢 測試劑盒。
9. 如權利要求8所述的產品，其特征在于，所述產品還包括磷脂酶C反應體系溶液。
10. 如權利要求1-7所述的方法或權利要求8-9所述的產品，其特征在于，所述磷脂酶 C為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C、磷脂酰乙醇胺特異性磷脂酶 C、和/或磷脂酸特異性磷脂酶C。
【文檔編號】G01N21/31GK104450865SQ201310430394
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】謝文嫻, 許駿, 戴小軍, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:豐益(上海)生物技術研發中心有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
