專利名稱：一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法
技術領域：
本發明涉及一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法。
背景技術：
自由基是含有未成對電子的原子、分子或原子團，它是線粒體在電子傳遞的 過程中產生的。在生命活動的代謝過程中不斷產生各種自由基，包括超氧陰離子
(02—)、羥自由基('OH)、氫過氧基(H02、)、烷氧基(RO)、烷過氧基 (ROO)、過氧化氫(H202)、 一氧化氮(NO)等。羥基自由基是作用最強 的、重要的活性氧自由基。正常的生理條件下，自由基的產生以及抗氧化防御系 統之間存在動態平衡機制，對機體是有利的，當自由基的產生超出平衡機制，此 時機體產生氧化應激。研究表明，自由基的細胞毒性包括對脂類和細胞膜的損傷， 引發脂質過氧化，從而導致細胞壞死；對蛋白質、酶的損傷作用，引起蛋白過氧 化和一些功能酶的失活、變性；對遺傳物質核酸和染色體的破壞，引起染色體畸 變，導致DNA雙鏈斷裂或形成加合物等。此外，近年的研究發現，自由基，如 NO，被認為是一類新發現的信號分子，通過與靶分子非共價結合引起靶分子空 間結構和活性的變化傳遞信號。
目前，自由基造成的線粒體損傷以及由此而引發的一系列機體健康問題己成 為生物醫學領域研究的前沿。在環境科學領域，已有研究表明，污染物脅迫下生 物體自由基的產生及其氧化損傷可能是污染物致毒的重要路徑。許多研究都觀察 到活性氧自由基與污染物水平存在相關性，研究污染物脅迫下生物體自由基的產 生及其分子毒性作用機制，對于生態系統安全的早期預警及生態風險評價具有非 常重要的意義。自由基參與生命過程中許多重要的生化反應逐步為人們所認識， 特別是隨著現代檢測分析技術的日新月異，自由基在生物和病理學領域的作用研 究迅速發展。而尋求快速、準確、高效、直接的自由基檢測方法己成為研究自由 基生物學作用的關鍵。
然而，由于活性氧自由基的壽命很短，并且在組織中存在的濃度極低，檢測 較為困難。目前，常用的測定自由基的方法主要有化學發光法、高效液相色譜法、氣相色譜法和熒光法等，但是這些測定方法大多是通過間接測定的方法。有些研
究者采用NBT還原法、細胞色素法、羥胺氧化等化學方法測定生物體的自由基， 但由于這些方法的干擾因素多，獲得的結果不盡理想。如果能夠直接測定生物體 內的自由基，對于預測污染生物體早期傷害將更有意義。
電子順磁共振(EPR)結合自旋捕獲技術是當前研究自由基最直接、最有效 的方法，近來已廣泛應用于動物毒理、生物醫學等領域的研究。此方法的基本原 理是利用捕獲劑與活潑自由基反應形成較穩定的自由基，即自旋加合物，然后再 用EPR進行檢測。目前比較常用的自旋捕捉劑有N氾，PBN等。NtB具有較快 的捕捉速率常數，其自旋加合物的波譜也比較確定，但此物質微溶于水，且對光 不穩定。PBN相對較穩定，自旋加合物壽命長。EPR結合自旋捕獲技術提供了 大量重金屬、有機物等化學品環境下老鼠、魚類體內羥自由基的生成的依據，然 而至今，未有研究提供污染物脅迫下土壤生態系統生物活體體內活性氧產生的直 接證據。
蚯蚓作為土壤中生物量最大的動物類群之一，在土壤的物理、化學和生物過 程中扮演重要的角色。它們在有機質降解、營養循環和土壤形成中起重要作用。 蚯頓是生態系統中的重要物種并被廣泛用做環境污染的生物指示者。有些敏感的 蚯蚓種屬，如赤子愛勝蚓(Bs印/afef/'c/a)在毒理學實驗中占據重要地位，它們 被廣泛應用于土壤污染的環境評估，是標準毒理實驗的典型生物。目前，關于蚯 蚓在各種不同污染物暴露脅迫下所產生的自由基對于機體所產生的氧化損傷的 研究較多，多使用抗氧化酶的響應或活性氧毒性作用終點產物的測定來推測機體 所受的氧化脅迫，而提供污染物脅迫誘導自由基產生的直接證據鮮見報道。
發明內容
1、 要解決的技術問題 本發明主要是針對現有自由基測定方法的不足，提供了一種測定蚯頓體內羥
基自由基的方法，采用EPR結合自旋捕獲技術測定蚯蚓體內羥基自由基，可以 快速、準確、直接的進行自由基檢測，為污染物脅迫誘導生物機體產生自由基提 供直接證據。
2、 技術方案一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法，包括如下幾個步驟.-步驟(1)，蚯蚓清腸，清洗。
將經暴露的蚯蚓取出，放在鋪有干凈濾紙的燒杯中清腸6小時。 步驟(2)，自由基的PBN捕獲。
將清腸后的蚯蚓取出放入冰生理鹽水反復清洗，用濾紙吸干體表水分，迅速 稱量0.1g蚯蚓置于玻璃勻漿器內，加入1mL 二甲基亞砜為溶劑配制的濃度為 50mmol/L的PBN溶液(加入過程中，避免水分進入，影響EPR波譜信號)， 冰浴條件下勻漿后，靜置3-5min，待組織勻衆液出現有機相與水相的兩相分層 后，取上層液40(VL注入直徑為3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，準備進 行EPR測定。在捕獲前半個小時，在密閉操作箱中導入氮氣以徹底去除氧氣， 以防產生甲氧基對結果進行干擾。以上整個操作過程在以導入氮氣與氧氣隔絕的 密閉操作箱中進行。整個過程應避免水分沾入。
步驟(3), EPR測定。
EPR測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EPR操作參 數測試溫度(TE)室溫，微波功率(SP) 20mW，微波頻率(SF) 9.751GHz，調制 頻率(MF) 100KHz，調制幅度(MA) 0.5G，中心磁場(CF) 3470G,掃場時間(TI) 84s，時間常數(TC)41ms，掃場寬度(SW) 200G，信號為5次疊加。 3、有益效果
本發明采用EPR結合自旋捕獲技術，公開了一種測定蚯蚓體內自由基方法， 與以往的技術相比，本發明具有以下優點
(1) 快速、高效。本發明操作較為簡單，容易掌握，并能在很短的時間內 測得蚯蚓的羥基自由基。
(2) 直接、準確。根據EPR波譜圖的超精細結構參數可確定所測定的自 由基是羥基自由基，而不像化學法和色譜法那樣專一性不強。
(3) 具有較好的劑量效應關系。研究結果顯示自由基的強度與暴露物的濃 度存在著較好的劑量-效應關系，可以用來作為敏感的蚯蚓生物標志物。
(4) 實用性較廣。本發明對其它蚯蚓屬種也同樣適用，對于不同的污染物 暴露都能直接測出羥基自由基，同時可應用于野外原位實驗。
圖1為Cd脅迫下蚯蚓體內自由基的信號圖譜圖2為Cd暴露濃度和羥基自由基的關系圖3為TBBPA脅迫下蚯蚓體內自由基的信號圖譜圖4為TBBPA暴露濃度和羥基自由基的關系
具體實施例方式
以下通過實例進一步說明本發明的實施應用
實施例1重金屬Cd脅迫下蚯蚓體內羥基自由基的測定
選擇國際土壤生態毒理學研究的模式生物物種一赤子愛勝蚵(￡&eA7Zafetofa)，經過馴養一段時間后，選擇體重0.3~0.4g，大小基本一致，具有成熟環帶的健康成蚓，蚯蚓清腸24小時后，用超純水在室溫下反復沖洗蚯蚓2-3遍,用濾紙吸干蚯蚓體表水分。將蚯蚓暴露于不同濃度Cd污染的土壤中14天，Cd濃度為0， 0.1， 0.5， 1.0， 5.0， 10.0mg/kg土壤，每個濃度組4個平行。暴露完成后將蚯蚓取出放入冰生理鹽水反復清洗，迅速稱量0.1g蚯蚓置于玻璃勻漿器內，加入1mL 二甲基亞砜為溶劑配制的濃度為50mmol/L的PBN溶液(加入過程中，避免水分進入，影響EPR波譜信號)，冰浴條件下勻漿后，靜置3-5 min,待組織勻漿液出現有機相與水相的兩相分層后，取上層液400pL注入直徑為3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，準備進行EPR測定。整個操作過程在以導入氮氣與氧氣隔絕的密閉操作箱中進行。整個過程應避免水分沾入。
EPR測定使用Bmker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EPR操作參數測試溫度(TE)室溫，微波功率(SP) 20mW，微波頻率(SF) 9.751GHz，調制頻率(MF) 100KHz，調制幅度(MA) 0.5G，中心磁場(CF) 3470G，掃場時間(TI)84s，時間常數(TC)41ms，掃場寬度(SW) 200G,信號為5次疊加。
圖1是重金屬Cd暴露后蚯蚓體內自由基信號變化的EPR波譜。說明蚯蚓經重金屬Cd誘導可能產生自由基，被PBN捕獲生成PBN-加合物，并且能被EPR光譜檢測到。根據譜圖的超精細結構常數和譜圖的形狀分析，在本實驗中捕獲到的活性氧是，OH。說明重金屬Cd誘導蚯蚓產生了，OH。
從圖2中可看出，重金屬Cd誘導蚯蚓的，OH強度隨著暴露的濃度增加而增加。當暴露濃度是0.5mg/kg時，OH的信號強度是對照組的150%，與對照組相比具有顯著性差異(p句.05),當暴露濃度是5.0-10.0 mg/kg時，OH的信號強度是對照組的196%-266%,與對照組相比具有極顯著性差異(p0.01)。線性回歸分析表明，暴露濃度和產生的自由基強度之間呈明顯的線性劑量-效應關系y=4.56*103x + 4.27*103， R2 = 0.927, y代表羥基自由基信號強度，x代表Cd暴露濃度。線性回歸方程表明隨著重金屬Cd暴露濃度增加產生的自由基強度亦隨之增加的線性模式，對蚯蚓可能產生了氧化損傷。
實施例2四溴雙酚A (TBBPA)脅迫下蚯蚓體內羥基自由基的測定
選擇國際土壤生態毒理學研究的模式生物物種一赤子愛勝蚓(Bsen/'afef/da),經過馴養一段時間后，選擇體重0.3~0.4g，大小基本一致，具有成熟環帶的健康成蚓，蚯弼腈腸24小時后，用超純水在室溫下反復沖洗蚯躬l 2-3遍，用濾紙吸干蚯蚓體表水分。將蚯蚓暴露于不同濃度TBBPA污染的土壤中14天，TBBPA濃度為0， 0.01， 0.05， 0.1， 0.5， 1.0mg/kg土壤，每個濃度組4個平行。暴露完成后將蚯蚓取出放入冰生理鹽水反復清洗，迅速稱量0.1g蚯蚓置于玻璃勻漿器內，加入1mL 二甲基亞砜為溶劑配制的濃度為50mmol/L的PBN溶液(加入過程中，避免水分進入，影響EPR波譜信號)，冰浴條件下勻漿后，靜置3-5min，待組織勻漿液出現有機相與水相的兩相分層后，取上層液40CVL注入直徑為3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，準備進行EPR測定。整個操作過程在以導入氮氣與氧氣隔絕的密閉操作箱中進行。整個過程應避免水分沾入。
EPR測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀。EPR操作參數測試溫度(TE)室溫，微波功率(SP) 20mW，微波頻率(SF) 9.751GHz,調制頻率(MF) 100KHz，調制幅度(MA) 0.5G，中心磁場(CF) 3470G，掃場時間(TI)84s，時間常數(TC)41ms，掃場寬度(SW) 200G,信號為5次疊加。
圖3是TBBPA暴露后蚯蚓體內自由基信號變化的EPR波譜。說明蚯頓經TBBPA誘導可能產生自由基，被PBN捕獲生成PBN-加合物，并且能被EPR光譜檢測到。根據譜圖的超精細結構常數和譜圖的形狀分析，在本實驗中捕獲到的活性氧是OH。說明TBBPA誘導蚯頓產生了，OH。
7從圖4中可看出，TBBPA誘導蚯弼I的OH強度隨著暴露的濃度增加而增加。 當暴露濃度是0.01mg/kg時，，OH的信號強度是對照組的109%,，與對照組相 比具有顯著性差異(p《.05),當暴露濃度從0.05-1.0mg/kg時，*OH的信號強度 是對照組的123%-176%，與對照組相比具有顯著性差異(p0.01)。線性回歸分 析表明，暴露濃度和產生的自由基強度之間呈明顯的線性劑量-效應關系y = 2.22*103x +3.9.5*103， R2= 0.859， y代表羥基自由基信號強度，x代表TBBPA 暴露濃度。線性回歸方程表明隨著TBBPA暴露濃度增加產生的自由基強度亦隨 之增加的線性模式，對蚯頓可能產生了氧化損傷。
權利要求
1.一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法，包括如下幾個步驟第一步；對充分暴露的蚯蚓體進行清腸，清洗；第二步自由基的PBN捕獲；第二步EPR測定。
2. 根據權利要求1所述的一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法，其特征在于 在第二步自由基捕獲前半個小時，在密閉操作箱中導入氮氣以徹底去除氧氣，以防產生甲氧基對結果進行干擾。
3. 根據權利要求2所述的一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法，其特征在于第 三步具體為清腸后的蚯蚓取出放入冰生理鹽水反復清洗，用濾紙吸干體表 水分，迅速稱量0.1g蚯蚓置于玻璃勻漿器內，加入1mL二甲基亞砜為溶劑 配制的濃度為50mmol/L的PBN溶液，冰浴條件下勻漿后，靜置3-5 min， 待組織句漿液出現有機相與水相的兩相分層后，取上層液400nL注入直徑為 3mm石英管中，迅速放入液氮中保存，準備進行EPR測定；以上整個搡作 過程在以導入氮氣與氧氣隔絕的密閉搡作箱中進行。整個過程應避免水分沾 入。
4. 根據權利要求1~3中任一項所述的一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法， 其特征在于EPR測定使用Bruker公司的EMX 10/12型電子順磁共振儀， EPR操作參數測試溫度(TE)室溫，微波功率(SP) 20mW，微波頻率(SF) 9.751GHz,調制頻率(MF) 100KHz，調制幅度(MA) 0.5G,中心磁場(CF) 3470G,掃場時間(TI)84s,時間常數(TC) 41ms,掃場寬度(SW) 200G,信 號為5次疊加。
全文摘要
本發明公開了一種測定蚯蚓體內羥基自由基的方法。首先將充分暴露的蚯蚓清腸，清洗，在密閉的已經除氧的密閉操作箱中進行自由基的PBN捕獲，最后用EPR技術進行測定。本發明的優點在于操作較為簡單，容易掌握，并能在很短的時間內測得蚯蚓的羥基自由基；根據EPR譜圖的超精細結構常數和譜圖的形狀分析，發現所測定的自由基是羥基自由基，是目前測定羥基自由基最直接、最準確有效的方法；具有較好的劑量效應關系。研究結果顯示羥基自由基的強度與暴露物的濃度存在著較好的劑量-效應關系。
文檔編號G01N24/10GK101639454SQ200910034260
公開日2010年2月3日 申請日期2009年9月3日 優先權日2009年9月3日
發明者可 吳, 姜錦林, 王曉蓉, 薛銀剛, 顧雪元 申請人:南京大學
專業數控銑床產品供應商
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