專利名稱：：一種人體外自身抗體放射免疫定量檢測方法
技術領域：
：本發明涉及生物醫學
技術領域：
檢測方法，是一種用于人體外自身抗體定量檢測的放射配體(納米磁顆粒)定量分析方法即一種人體外自身抗體放射免疫定量檢測方法
背景技術：
：自身抗體是指抗自身組織、器官、細胞及細胞成分的抗體。人體的生長、發育和生存有完整的自身免疫耐受機制的維持，正常的免疫反應有保護性防御作用，即對自身組織、成分不發生免疫反應。一旦自身耐受的完整性遭到破壞，則機體視自身組織、成分為"異物"，而發生自身免疫反應，產生自身抗體。正常人體血液中可以有低滴度的自身抗體，但不會發生疾病。但如果自身抗體的滴度超過某一水平，就可能對身體產生損傷，誘發疾病。自身抗體的產生可能是致病抗原(細菌、病毒等)與自身成分之間存在某些相同的分子結構出現了與自身抗原發生交叉反應的免疫應答；也可能是某些感染因素使自身抗原變性，免疫系統對這些暴露的新抗原產生自身抗體。一些特定自身抗體的定量檢測對于許多疾病的診斷、預防、治療及療效評價具有十分重要的意義。下面以谷氨酸脫羧酶自身抗體為例做具體說明，谷氨酸脫羧酶(Glutamicaciddecarboxylase,GAD)是人及動物體內抑制神經遞質y-氨基丁酸(GABA)的合成酶，y-氨基丁酸有GAD65與GAD67兩種形式的同工酶。糖尿病是現代疾病中危害僅次于癌癥的第二殺手，i型糖尿病是遺傳易感個體通過自身抗原介導的免疫反應所引起胰島e細胞破壞的自身免疫性疾病，GAD65是此免疫反應關鍵的始動耙抗原，因此GAD65-Ab是糖尿病前期個體較特異的免疫指標。由于大多數糖尿病患者的死因來自于疾病的長期并發癥和后遺癥，而在糖尿病明確診斷以前，患者的并發癥其實早已經開始，80%90%的胰島{3細胞功能喪失，此時各種免疫干預措施均難以奏效，因此防治工作的關鍵在于早期診斷。所以應用適當的診斷標準進行早期診斷對糖尿病的預防和控制以及對其并發癥的治療具有十分重大的意義。總之，定量檢測GAD65自身抗體對臨床糖尿病的早期診斷、分型及藥物治療效果的觀察具有十分重要的價值。
發明內容本發明的目的在于提供一種自身抗體放射免疫定量檢測方法:建立人血清中自身抗體的快速、準確的定量檢測技術平臺，可用于多種自身抗體的定量檢測。用谷氨酸脫羧酶Glutonicaciddecarboxylase,GAD65自身抗體放射免疫定量檢測方法建立舉例說明，本方法將放射免疫分析(RadioimmunoassayRIA)定量檢測技術與納米磁顆粒配體技術相結合，是一種基于配體檢測原理的直接檢測方法，其核心在于巧妙地利用SPA能與人和小鼠體內的免疫球蛋白IgG的Fc結合位點發生反應的共同特性，用自創SPA包被納米磁顆粒配體技術建立自身抗體的配體免疫定量分析方法。下面以GAD65自身抗體(GAD65-Ab)的定量檢測為例作具體說明。首先將蛋白A包被于納米磁顆粒表面，利用高親和力、高特異性的單克隆抗體配制標準品(用以建立標準曲線)，用相對過量的標記抗原+GAD65(高度純化的125I-GAD65)分別與標準品中的GAD65單克隆抗體及血清樣品中的GAD65自身抗體結合形成免疫復合體(GAD65-Ab)-*GAD65。在包被于納米磁性顆粒表面的蛋白A的參與作用下，形成三明治式復合體系，原因是蛋白A會被(GAD65-Ab)^GAD65免疫復合體的Fc部分結合。其中蛋白A部分包被于納米磁性顆粒表面上，從而形成一個固相，以磁板進行固液相分離，吸去包含未結合標記物的上清液并洗珠后，直接用Y-計數器檢測放射強度(CPM)，根據標準品的CPM值建立標準曲線，可從標準曲線上査出病人GAD65自身抗體的濃度值。樣品或標準品中GAD65-Ab濃度越高則標記物特異性結合越多，因此所檢測到的放射性強度也越強，即放射強度(CPM)是與GAD65-Ab濃度成正比的。在樣品中沒有GAD65-Ab情況下無免疫體系形成，因為標記物僅結合GAD65-Ab，而不結合蛋白A。本方法中作為標準品的單克隆抗體與血清樣品中的自身抗體并不進入同一反應體系，只是利用了它們具有與SPA特異結合的共性進行對照，因此不會發生交叉反應，所以檢測效果具有特異性強、靈敏度及準確度高等優點，且不會出現假陰性或假陽性現象。本方法包括以下步驟(一)試劑盒組成成分GAD65-Ab放射免疫配體定量分析診斷試劑盒主要組分為標記物(125I-GAD65),標準品(GAD65單抗)，配體試劑(SPA-納米磁顆粒)，洗滌液。(二)試劑盒各組分的制備1、標記抗原的制備采用乳過氧化物酶法標記技術制備125I-GAD65，使其放化純度達到95%以上。2、特異性單克隆抗體的制備用GAD65抗原免疫小鼠，通過細胞融合雜交瘤技術制備GAD65單克隆抗體(GAD65-Ab),作為繪制參照曲線的標準品。3、葡萄球菌蛋白A(SPA)—納米磁顆粒的制備將SPA通過碳二亞胺包被于有機硅烷化磁性納米粒子表面，作為進行固液分離的配體試劑。(二)GAD65-Ab放射配體(納米磁顆粒)定量分析方法及臨床檢測標準的建立。1、建立人血清中GAD65-Ab的放射配體(納米磁顆粒)定量分析方法，并制定試劑盒的實驗操作方法及質量控制標準。2、經大量臨床試驗結果顯示，用本項目完成的試劑盒測定受檢者血清中GAD65-Ab的含量，用以判斷糖尿病的診斷及分型，其臨床符合率》95%。因此，本試劑盒的GAD65-Ab臨床測定值，可為糖尿病早期診斷及其正確分型，早期干預治療、正確用藥及療效評價提供可靠依據。圖1是放化純度圖圖2是結合率圖具體實施例方式本方法的內容，通過以下實施例作具體說明GADM自身抗體化學發光配體(納米磁顆粒)定量分析方法的建立(一)試劑盒各組分的制備1、標記抗原(125I-GAD65)的制備(1)采用改進的乳過氧化物酶法標記技術制備125I-GAD65:稱GAD651050jig溶于PH6.5磷酸緩沖液50200pl中，加入Na125I18mCi、乳過氧化物酶溶液40150ngC105(V1)、過氧化氧(H202)400800ng(50100nl)，37°C溫育中，滴加&02400800ng(50100h1)，510分鐘內完成，再繼續反應25分鐘后，加入0.52.0ml20mmol/L巰基乙醇3060秒以終止反應，反應液迅速轉移到預先用PH6.57.5磷酸緩沖液平衡的SephadexG50或SephadexG25柱上層析分離，以平衡液洗脫，自動收集，用Y-計數器檢測放射強度。收集第一峰。以紙層析法鑒定1251-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的放化純度，以聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定"I-谷氨酸脫羧酶(GAD65)的化學純度。(2)放化純度的測定放化純度指在標記物中結合在抗原上的放射性活度占該標記物總放射性活度的百分比。我們采用兩種方法進行鑒定a、紙層析法鑒定1)將lcmxl2cm濾紙浸于P/。KI溶液中過夜備用。2)使用前將浸過的濾紙吹干，并按每lcm距離用鉛筆標出。3)將待鑒定的標記物5jiL10nL點樣于距端點lcm處，晾干。4)將已點樣的濾紙條放于層析缸內，然后加展開劑。展開劑為正丁醇乙醇氨水水=20:1:0.5:1。層析時間為2小時。5)展開后將濾紙取出并吹干，然后按每lcm距離剪開，并分段進行計數。以每段的cpm為縱坐標，分段紙條的序號為橫坐標作圖。近原點的第一峰為標記抗原峰。參見圖16)按下列公式計算放化純度抗原峰的放射性強度(cpm)放化純度(％)=-X100%總放射性強度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>b、游離碘檢査法檢査方法如下取O.lmL收集液，加入1%載體蛋白溶液和5。/。三氯乙酸(TCA)4.8mL，立即出現白色沉淀，靜置數小時，4000rpm下離心10min，分別測上清液和沉淀部分的放射性強度<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>2、GAD65單克隆抗體的制備及性能檢測(1)抗原提純與動物免疫谷氨酸脫羧酶(GAD65)加完全福氏佐劑并經充分乳化，選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠進行動物免疫。末次免疫后34天，分離融合后的脾細胞。(2)骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備采用Sp2/0骨髓瘤細胞株進行培養，在融合前先用含8-氮鳥嘌呤的培養基作適應培養，在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為2xl05/ml,次日一般即為對數生長期細胞。采用小鼠腹腔細胞為飼養細胞(feedercell)。(3)細胞融合將骨髓瘤細胞與脾細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后用培養液稀釋PEG,消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋，分置培養板孔中培養。(4)有限稀釋法篩選陽性細胞株篩選陽性株選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株。融合細胞呈克隆生長，經有限稀釋后，吸取培養上清用ELISA檢測抗體含量。篩選出高抗體分泌孔，將孔中細胞再行克隆化，然后進行抗原特異的ELISA測定，選擇高分泌特異性細胞株進行擴大培養或凍存。下面是其中一個雜交瘤融合板的ELISA篩選結果，陽性克隆用藍色斜體字體表示，H12為陽性對照。一個典型的雜交瘤融合板的ELISA篩選結果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(5)單克隆抗體的制備和凍存抗體制備釆用小鼠腹腔接種法，選用BALB/c小鼠或其親代小鼠進行腹腔注射。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生。選出陽性細胞株并及早凍存。(6)單克隆抗體的純化用葡萄球菌A親和層析柱純化單克隆抗體，回收率達90%以上。洗脫液中的抗體濃度用紫外光吸收法粗測。經低pH洗脫后在收集管內預置中和液或速加中和液，以保持純化抗體的活性。(7)單克隆抗體的性能檢測我們對單克隆抗體的滴度、純度及特異性和親和力等進行了全面鑒定，其主要技術指標如下GAD^單克隆抗體的主要技術指標ELISA滴度(于1.0mg/ml)1:105檢測靈敏度<5.0pg/ml交叉反應率<0.1%親和常數4.97X10，滴度檢測以GAD65為檢測抗原，通過間接ELISA測定抗體滴度，其滴度(于1.0mg/ml)=1:105。純度檢測經提取純化后用非還原SDS-PAGE法檢測單抗純度，結果在160kD左右有一條清晰的條譜帶，經蛋白A親和層析其純度達95y。以上。特異性抗GAD65單抗的特異性良好，不與人血清白蛋白結合反應，來自ANA、DNA以及風濕因子的干擾很小，交叉反應率O.1%。親和力檢測根據Beatty等人所建立的方法，以5、2.5、1.25和0.625pg/ml4個濃度GAD65稀釋液依次包被微孔板,通過作圖法取其最大OD值一半(即OD的50%)處對應的抗體濃度。代入公式K=(n-1)/2(nAb，-Ab)計算親和常數，式中Ab和Ab，分別表示當抗原濃度為Ag和Ag'時,產生半數吸光值的抗體濃度(mol/L),i^Ag/Ag'。求其平均數得親和常K=4.97xl010M-1。3、SPA—納米磁顆粒的制備(1)SPA—納米磁顆粒的制備我們對納米磁顆粒與SPA的反應比例進行了一系列探討試驗。具體制備方法如下①取5-10mg有機硅烷化磁性粒子，用重蒸水洗1-2次；②用0.01~0.5mol/LpH5.6-6.2的PBS洗一次；③用0.01~0.5mol/LpH5.6-6.2的PBS調整總體積約為10ml;④加一定量SPA放在搖床上進行勻化10—60分鐘，SPA的具體質量根據納米磁顆粒與SPA的反應質量比而定；⑤加入碳二亞胺(EDAC)約5.010mg;⑥室溫反應，放在搖床上進行勻化1048小時；⑦用0.1mol/LpH7.4PBS+0.1。/。BSA洗滌三次；⑧用重蒸水洗3次；⑨用0.1mol/LpH7.4PBS洗3次；⑩用0.05mol/LTris+0.004mol/LEDTApH7.5緩沖液洗3次；O用0.05mol/LTris+0.004mol/LEDTApH7.5緩沖液定容為1.0mg/ml,2-4。C保存，待用。(2)SPA結合量的測定SPA結合量一般以每毫升或每克有機硅烷化納米磁顆粒偶聯SPA的量表示，其數值可用作決定親和吸附劑實際用量的參數，采用直接測定法或間接測定法測定結合量。將納米磁顆粒與SPA按不同比例進行包被反應，測定SPA的結合率。測定結果顯示，當磁顆粒與SPA的比例至1:50時，SPA的結合量近乎飽和，因此，我們所采用的磁顆粒與SPA的比例為1:50。SPA結合率測定結果納米磁顆粒/SPA1:51:101:201:501:75100SPA結合率(。/0)25.6438.1347.1862.7163.7664.97參見圖2(二)試劑盒實驗操作方法及步驟建立GAD65-Ab放射配體定量分析方法，采取的實驗操作步驟如下1、將實驗所需試劑及樣本放置室溫，平衡至少30分鐘以上才可進行操作；2、去所需試管若干進行編號，所有實驗均做雙管重復，并將其按順序排列于試管架上;3、取各個濃度的標準品、質控血清和樣品2520(Hil加入相應編號的試管中；4、每管均各加入50200^1"I-GAD65溶液；5、倒置充分混勻SPA-納米磁顆粒，每管均各加入2510(HilSPA-納米磁顆粒；6、充分混勻，室溫振蕩16小時；7、將試管架放在磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；8、去除磁板，每管均各加入500100(^r冼滌液；9、振蕩5秒后，將試管架置于磁板上吸附磁顆粒，吸去上清液；10、重復一遍步驟8、9;11、用Y-計數器檢測每管的放射性強度；12、從標準曲線上讀取樣品及質控血清的濃度。(三)、臨床檢測應用情況統計分析1、糖尿病及對照組GAD65-Ab檢測結果比較<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>2、數據統計<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3、臨床結果分析用本試劑盒測定受檢者血清中GAD65-Ab的含量，正常人血清中GAD65-Ab檢出率為0;1型糖尿病患者中青少年發病者GAD65-Ab檢出率為96.08%，明顯高于2型糖尿病組的10.38%;成人遲發自身免疫型糖尿病組GAD65抗體檢出率為97.69%,亦明顯高于2型糖尿病組的檢出率，與文獻報道吻合。因此，本試劑盒的GAD65-Ab臨床測定值，具有靈敏度及準確度高，特異性強，檢測結果準確可靠等優點，可為糖尿病早期診斷及其正確分型、早期干預治療、正確用藥及療效評價提供可靠依據，爭取在糖尿病前期甚至更早給予免疫干預或使用外源性胰島素保護剩余的胰島0細胞功能，對糖尿病及其并發癥的治療具有十分重要的意義。權利要求1.一種人體外自身抗體放射免疫定量檢測方法，用谷氨酸脫羧酶Glutamicaciddecarboxylase，GAD65自身抗體放射免疫定量檢測方法建立舉例說明，其特征在于本方法將放射免疫分析——RadioimmunoassayRIA——定量檢測技術與納米磁顆粒配體技術相結合，是一種基于配體檢測原理的直接檢測方法，其核心在于巧妙地利用SPA能與人和小鼠體內的免疫球蛋白IgG的FC結合位點發生反應的共同特性，用自創SPA包被納米磁顆粒配體技術建立自身抗體的配體免疫定量分析方法。2、根據權利要求1所述的一種自身抗體放射免疫定量檢測方法，其特征在于首先將蛋白A包被于納米磁顆粒表面，利用高親和力、高特異性的單克隆抗體配制標準品---用以建立標準曲線，用相對過量的標記抗原*0八065，采用高度純化的125I-GAD65，分別與標準品中的GAD65單克隆抗體及血清樣品中的GAD65自身抗體結合形成免疫復合體(GAD65-Ab)-*GAD65;在包被于納米磁性顆粒表面的蛋白A的參與作用下，形成三明治式復合體系，原因是蛋白A會被(GAD65-Ab)^GAD65免疫復合體的Fc部分結合；其中蛋白A部分包被于納米磁性顆粒表面上，從而形成一個固相，以磁板進行固液相分離，吸去包含未結合標記物的上清液并洗珠后，直接用Y-計數器檢測放射強度CPM，根據標準品的CPM值建立標準曲線，可從標準曲線上查出病人GAD65自身抗體的濃度值；本方法包括以下步驟(一)試劑盒組成成分GAD65-Ab放射免疫配體定量分析診斷試劑盒主要組分為標記物——125I-GAD65，標準品~~GAD65單抗，配體試劑——SPA-納米磁顆粒，洗滌液；(二)試劑盒各組分的制備1)、標記抗原的制備采用乳過氧化物酶法標記技術制備l25I-GAD65，使其放化純度達到95%以上；2)、特異性單克隆抗體的制備用人GAD65抗原免疫小鼠，通過細胞融合雜交瘤技術制備GAD65單克隆抗體一一GAD65-Ab，作為配制標準品的主要原料；3)、葡萄球菌蛋白A(SPA)—納米磁顆粒的制備將SPA通過碳二亞胺包被于有機硅烷化磁性納米粒子表面，作為進行固液分離的配體試劑；GAD65-Ab放射配體——納米磁顆粒——定量分析方法及臨床檢測標準的建立；1)、建立人血清中GAD65-Ab的放射配體一一納米磁顆粒^^定量分析方法，并制定試劑盒的實驗操作方法及質量控制標準；2)、經大量臨床試驗結果顯示，用本項目完成的試劑盒測定受檢者血清中GAD65-Ab的含量，用以判斷糖尿病的診斷及分型，其臨床符合率》95%;因此，本試劑盒的GAD65-Ab臨床測定值，可為糖尿病早期診斷及其正確分型，早期干預治療、正確用藥及療效評價提供可靠依據。全文摘要一種人體外自身抗體的定量檢測方法，屬于生物醫學
技術領域：
。巧妙利用葡萄球菌蛋白A(SPA)能與人和小鼠體內IgG的Fc位點發生反應的共性，利用高親和力、高特異性的單克隆抗體配制標準品以建立標準曲線，使單克隆抗體和樣品中的自身抗體分別與標記抗原反應，用SPA包被的納米磁顆粒作為配體進行固液分離，通過<sup>125</sup>I的放射性檢測，建立自身抗體的放射配體免疫定量分析方法。本發明適用于所有自身抗體的定量檢測，解決了大多數自身抗體無法準確定量檢測的難題，同時避免了交叉反應，也不會出現假陰性或假陽性現象。文檔編號G01N33/577GK101256189SQ200710056850公開日2008年9月3日申請日期2007年2月28日優先權日2007年2月28日發明者潘學繼申請人:天津市協和醫藥科技有限公司
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