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專利名稱：：結腸癌相關基因tom34的制作方法結腸癌相關基因roM34本申請要求2005年7月27日提交的美國臨時申請系列No.60/703,265的權益，在此將上述申請的全部內容引用并入本文。發明領域本發明涉及4企測和診斷結腸癌的方法以及治療和預防結腸癌的方法。發明背景結腸直腸癌是全世界癌癥死亡的最常見原因之一。盡管各種結腸直腸癌的診斷和治療取得了各種進步，但許多晚期結腸直腸癌患者的死亡率很高。為了改善他們的預后，有必要研制用于早期癌檢測的敏感而特異的診斷用生物標志以及更為有效且有害性更小的治療性藥物。為了達到這個目的，有必要更清楚地了解結腸直腸癌發生的分子機制。最近的分子研究披露了結腸直腸癌發生涉及遺傳改變的積累，包括在腫瘤抑制基因和/或癌基因包括APC、p53、beta-聯蛋白和K-ras的遺傳改變(NishishoI，etal.Science253:665-669,1991;BakerSJ，etal.，Science244:217-221，1989;MorinPJ,etal"Science275:1787-1790,1997;ForresterK,etal.，Nature327:298-303,1987)。除了這些類型的改變之外，表觀遺傳事件，例如改變的曱基化作用(JonesPA&LairdPW，NatGenet21:163-167，1999)和印記的丟失(CuiH,etal.,NatMed4:1276-1280,1998)和/或由于遺傳變化或其它未知的才幾制所致的失調節的轉錄控制，與結腸直腸腫瘤的發生相關。在涉及癌發生的基因中，我們預想對癌細胞的增殖和/或存活必需的基因產物的抑制將導致它們的生長抑制或細胞死亡。因此，產生致癌活性并特異性地在癌細胞中表達的分子，是用于研制新抗癌藥的有希望的靶標。人TOM34是從人EST和cDNA數據庫中發現的，并且被預測為線粒體蛋白輸入機構的組分，因為該被預測的蛋白質在一個62位殘基基序的區域中與已知的線粒體受體的酵母Tom70家族具有序列同源性(NuttallSD,etal.，DNACellBiol16:1067-1074,1997)。然而，最近的研究披露，在細胞和組織分級后，TOM34主要被包括在細胞質級分中，部分被包括在線粒體和膜級分中(ChewawiwatN,etal.，JBiochem(Tokyo)125:721-727,1999)。另一項研究通過免疫組織化學染色顯示了它在HeLa細胞的細胞質中的亞細胞定位(Chun-SongYandHenryY.,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002;AbhijitM,etal.，ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104,2002)。酵母雙雜交篩選系統已經顯示TOM34在體外與含纈酪肽蛋白(valosin-containingprotein,VCP)、一種AAA(與多種細胞活性相關的ATP酶)家族成員(Chun-SongY,etal"ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110,2002)、或90-kDa熱休克蛋白(YoungJC,etal"JBiolChem273:18007-18010，1998)相互作用。然而，TOM34的生物學作用尚不清楚。已經證明，CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)識別提呈到MHCI類分子上的來源于腫瘤相關抗原(TAA)的表位肽，并裂解腫瘤細胞。自MAGE家族作為TAA的第一個例子被發現以來，應用免疫方法已經發現了許多其它的TAA(BoonT.，IntJCancer.1993;54(2):177-80.，BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9.，vanderBmggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV,et.al.,JExpMed.1993;178(2):489-95"KawakamiY,et,al.,JExpMed,1994;180(l):347-52),目前其中一些在臨床研究過程中已被當作免疫治療的耙標。到目前為止發現的TAA包括MAGE(vanderBruggenP,et.al.,Science.1991;254(5038):1643-7)、gplOO(KawakamiY,et.al.，JExpMed.1994;180(l):347-52)、SART(ShichijoS,et.al.，JExpMed.1998;187(3):277-88)、NY-ESO-1(ChenYT,etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8)。同時已證明，腫瘤細胞以一定程度的特異性過高表達的基因產物為被識別為細胞免疫應答的靶標。這些包括p53(UmanoY，et.al.,BrJCancer.2001;84(8):1052-7)、HER2/歸(TanakaH，et.al"BrJCancer.2001;84(l):94-9)、CEA(NukayaI，et.al"IntJCancer.1999;80(l):92-7)以及其它產物。盡管這些是在基礎和臨床研究中已經取得顯著進展的例子(RosenbergSA，et.al.,NatMed.1998;4(3):321-7.，MukherjiB,et.al.，ProcNatlAcadSciUSA.1995;92(17):8078-82"HuX，et.al"CancerRes.1996;56(11):2479-83)，一般用于腺癌包括結腸癌治療的候選TAA數量非常有限。如果有僅僅在癌細胞中但不在正常細胞中大量表達的TAA,它們將是有希望的候選免疫治療靶標。發明概述為了驗證在結腸直腸癌發生中的分子作用并為結腸直腸癌(CRC)患者尋找新的治療靶標，我們應用由23040個基因構成的cDNA微陣列進行了表達模式分析(LinYM，etal.,Oncogene21:4120-4128，2002)。在結腸直腸腫瘤中顯示上調表達的基因中，我們著眼于TOM34(34kDa的線粒體外膜移位酶)，因為它的表達水平在受檢的20個CRC樣品中在其中16個中頻繁提高。多組織Northern印跡分析顯示該基因大量表達于睪丸和卵巢中，弱表達于前列腺、脾臟和結腸中，但在受檢的其它11個正常成人組織中均不表達。TOM34的免疫組織化學染色顯示，在CRC組織中與它們相應的非癌粘膜有顯著的蓄積。在本發明中，證實了人TOM34在CRC中頻繁上調，它在睪丸和卵巢中表達，但在被;險的其它15種正常成人組織中不表達。既然通過siRNA抑制該TOM34明顯降低了結腸癌細胞的生長，該基因產物可能是一種潛在的人腫瘤的治療靶標，也是一種有用的診斷標志。而且，考慮TOM34可能作為一種能誘發顯著的抗結腸癌細胞免疫反應的TAA(肺瘤相關抗原)。為了^r證這個^(叚設，我們用來源于TOM34的肽刺激了從健康志愿者收集的PBMC，并成功獲得了肽特異性CTL克隆，這些克隆也可以識別和殺傷表達該抗原的腫瘤細胞。具體地，以rOMM特異性小干擾RNA(siRNA)轉染結腸癌HCT116和RKO細胞有效地抑制了它的表達，并顯著地抑制了細胞生長。而且，對于具有來源于TOM34的序列的肽，我們考察了它們作為抗原表位肽的潛力，并探索了一種可以誘導顯著的抗結腸癌細胞免疫應答，用于癌癥免疫治療的新表位肽。用具有TOM34部分序列的肽刺激了健康供體的外周血單核細胞(PBMC)。選擇了那些被推測與HLA-A*2402結合的肽。我們成功地鑒定了一種其序列來源于TOM34的特異性抗原肽，其可誘導細胞毒性T淋巴細胞(CTL)細胞系，所述CTL細胞系針對以HLA-A24限制性的方式提呈該抗原的細胞顯示特異性細胞毒性。從這些CTL細胞系中建立了CTL克隆。進一步的CTL克隆分析顯示它們不但對負載肽的靶細胞，而且對內源性表達TOM34的細胞具有強的細胞毒活性。而且，非放射性靶抑制測定(coldtargetinhibitionassay)表明這些CTL克隆特異性識別了MHCI類分子復合物中的所述抗原肽。這些結果強烈地提示該肽為一種HLA-A24限制性的表位肽，其可誘導針對表達TOM34的結腸癌細胞的強力而特異的免疫應答。這些發現提示TOM34與癌細胞生長有關，并可能促進新的抗癌藥和/或CRC診斷的開發。本發明是基于TOM34的基因表達圖式的發現。TOM34的核苷酸序列和氨基酸序列分別列出在SEQIDNO:60和61中。這些序列也可從Genbank登錄AB085681獲得。相應地，本發明提供了一種通過確定來源于患者的生物樣品，例如組織樣品中的TOM34表達水平，來診斷或確定受試者對結腸癌的傾向性(predisposition)的方法。正常細胞是獲自結腸組織。基因表達水平與正常對照基因表達水平相比的變化，例如增加，表明該受試者患有或有風險發生結腸癌。應用于本發明背景下的術語對結腸癌的"傾向性"涵蓋受試者易感于結腸癌，具有結腸癌趨勢、發病性、傾向或敏感性的狀態。而且，該術語也涵蓋受試者有獲得結腸癌的風險。在本發明的背景下，詞組"對照水平"指的是在對照樣品中檢測到的蛋白質表達水平。對照水平可以是來源于單一參照群體的單一表達圖式，或是來源于多個表達圖式的單一表達圖式。例如，對照水平可以是來自于在先測試細胞的表達圖式的數據庫。"正常對照水平，，指的是在正常健康個體或已知未患有結腸癌個體的群體中所檢測的基因表達水平。正常個體是沒有結腸癌臨床癥狀的個體。與正常對照水平相比，在測試樣品中纟企測到TOM34表達水平的增加表明受試者(從其獲得樣品者)患有CRC或者有發生CRC的風險。才艮據本發明，若基因表達與對照水平相比增加了10%、25%、50%,則認為基因表達水平是"改變的，，。或者，若基因表達與對照水平相比增加了至少0.1倍、至少0.2倍、至少1倍、至少2倍、至少5倍、至少10倍或更多倍，則基因表達水平被認定為"增加的，，。通過;f企測雜交，例如TOM34探針對來源于患者的組織樣品的基因轉錄物的雜交而確定表達。在本發明的背景下，來源于患者的組織樣品是來自測試受試者的任何組織，例如已知患有或懷疑有結腸癌的患者。例如，該組織可能含有上皮細胞。更特別地，該組織可能是來自結腸直腸癌的上皮細胞。本發明進一步提供了通過將表達TOM34的測試細胞與測試化合物接觸，并確定TOM34的表達水平或其基因產物的活性，來鑒定抑制TOM34表達或活性的物質的方法。該測試細胞可以是上皮細胞，例如獲自結腸直腸癌的上皮細胞。與基因或基因產物的對照水平或活性相比，TOM34表達水平或其基因產物的活性下降，表明該測試化合物為TOM34抑制劑并可用于減輕結腸癌癥狀。本發明也提供了包含與TOM34核酸或多肽結合的檢測試劑的試劑盒。本發明的治療方法包括治療或預防受試者中結腸癌的方法，包括給受試者施用TOM34拮抗劑或抑制劑例如反義組合物或抗體組合物的步驟。該拮抗劑或抑制劑可作用于核酸或蛋白質水平從而降低或抑制TOM34表達或活性。在本發明的背景下，反義組合物降低特異性靶基因的表達。例如，反義組合物可含有與TOM34序列互補的核苷酸。或者，本方法可包括給受試者施用小干擾RNA(siRNA)組合物的步驟。在本發明的背景下，siRNA組合物降低TOM34的表達。在另外一種方法中，受試者中結腸癌的治療或預防可以通過給受試者施用核酶組合物而實施。在本發明的背景下，核酸特異性核酶組合物降〗氐TOM34的表達。實際上，siRNA對TOM34的抑制效應得到了證實。例如，在樣品切片中已經清楚地顯示出TOM34的siRNA抑制結腸癌細胞的細胞增殖。因此，在本發明中，TOM34是優選的結腸癌治療l巴標。本發明也包括疫苗和接種方法。例如，治療或預防受試者中的結腸癌的方法可包含對受試者施用含有TOM34核酸編碼的多肽或該多肽的免疫活性片段的疫苗。在本發明的背景下，免疫活性片段是長度短于全長天然存在的蛋白，但誘導與全長蛋白誘導的免疫應答類似的免疫應答的多肽。例如，免疫活性片段應該是長度至少為8個殘基，并且能夠刺激免疫細胞例如T細胞或B細胞。可通過檢測細胞增殖、細胞因子(例如IL-2)的生成(elaboration)或抗體的產生而測量免疫細胞刺激。除非另有定義，本發明中所有的技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員所通常理解的相同的含義。盡管與本文所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發明的實施和檢驗，下文中對合適的方法和材料進行了描述。本申請引證本文中提及的所有的出版物、專利申請、專利和其它參考數據的全部內容。本文中的任何內容均不應被解釋一旦出現矛盾，將以包括定義在內的本說明書為準。此外，材料、方法和實施例僅僅是說明性的，并不意圖起限制作用。本文描述的方法的一個優點是在檢測到明顯的結腸癌臨床癥狀之前鑒定疾病。根據以下詳細的說明和權利要求，本發明的其它特征和優點將是自明的。附圖簡述圖1描述rOM54基因在各種組織中的表達水平。(A)結腸癌組織和它們相應的非癌粘膜中的rOM34的半定量RT-PCR分析。T，腫瘤組織；N,正常組織。的表達作為內部對照。(B)TOM34的多組織northern印跡分析。r07lf34的轉錄物的大小大約為2.0-kb。圖2描述TOM3V基因編碼的蛋白質在各種組織中的表達水平。(A)結腸癌組織和它們相應的非癌粘膜中TOM34的Western印跡分析。T,腫瘤組織；N,正常組織。(B)TOM34在結腸癌細胞系中的表達。beta-肌動蛋白的表達用作內部對照。圖3描述在結腸癌組織中的TOM34的免疫組織化學染色結果。(A和B)癌性和非癌性細胞中的代表性染色圖像。放大倍數X40,(C和D)正常粘膜和癌性組織的圖像(C正常，D;肺瘤)。放大倍數X200。圖4描述TOM34siRNA對TOM34基因表達或CRC細胞系的細胞生長的抑制效應。(A)siRNA對HCT116細胞中表達的影響。通過western印跡分析分析了TOM34的表達。(3-肌動蛋白的表達用作內部對照。制備了EGFP特異性siRNA(s正GFP)為陰性對照。(B)TOMM-siRNA對HCT116細胞生長的影響。通過一式三份的MTT測定法測量了響應于EGFP-siRNA或TOM34-siRNA的HCT116細胞生長能力。誤差條形，SD;星號表示通過ScheffF檢驗(ScheffsFtest)確定的顯著性差異(PO.OOOl)。圖5描述10聚體肽TOM34-299誘導的CTL系的細胞毒性效應。10聚體肽TOM34-299激發產生的CTL系顯示出肽特異性細胞毒性。CTL系顯示了對負載有TOM34-299的靶細胞(TISI)的高細胞毒活性，而它們對沒有負載肽的同樣的靶細胞(TISI)未顯示顯著的細胞毒活性。這證明CTL系具有肽特異性細胞毒性。圖6描述TOM34-299激發的CTL系肽特異性強細胞毒性。CTL系在低達1.2的E/T比(E/Tratio)顯示出可;f全測的抗原特異性強細胞毒性。圖7描述CTL克隆的強細胞毒性。可以建立具有極強的TOM34-299特異性細胞毒性的CTL克隆。從抗TOM34-299的CTL系建立的CTL克隆顯示了不同的殺傷活性，其中一些具有極強的活性。圖8描述TOM34-299激發產生的CTL克隆的HLA特異性。被TOM34-299激發產生的CTL克隆識別并以HLA限制性的方式裂解內源性表達TOM34的肺瘤細胞。使用由TOM34-299激發產生的CTL克隆作為效應細胞，測試了針對內源性表達TOM34的DLD-1和HT29結腸癌細胞系的細胞毒活性。用內源性表達TOM34但不表達HLA-A24的SNU-C2A細胞作為靶標。CTL克隆對既表達TOM34也表達HLA-A24的DLD-1和HT29細胞均顯示了高的細胞毒活性。另一方面，它們對表達TOM34但不表達HLA-A24的SNU-C2A細胞沒有顯示出顯著的細胞毒活性。.圖9描述TOM34-299激發產生的CTL克隆的HLA特異性。TOM34-299激發產生的CTL克隆以HLA-A24限制性的方式特異性地識別TOM34。如"材料與方法"描述的那樣進行非放射性靶抑制測定。制備了被Na^Cr04標記的HT29細胞作為放射性耙，而用具有或沒有TOM34-299肽負載的無"Cr標記TISI細胞作為非放射性靶。E/T比固定于20。僅當負載肽時，添加TISI細胞才抑制CTL克隆對HT29細胞的細胞毒活性。圖10描述TOM34-299激發產生的CTL克隆的細胞毒活性的特異性。TOM34-299激發產生的CTL克隆的細胞毒活性，被識別T細胞表面抗原I類HLA或CD8的抗體特異性地阻斷。在識別T細胞表面抗原的抗體存在下，確定了CTL克隆對HT29細胞的細胞毒活性。加入識別I類HLA或CD8的抗體明顯地阻斷了CTL活性，且加入II類HLA或CD4的抗體輕微地影響了該活性，而它根本不被同種型匹商己只于照抗體(isotype國matchedcontrolantibody)的力口入戶斤才中制。發明詳述除非有其它特別說明，文中所用的詞語"一個(種)"("a","an")和"所述"("the")意味著至少一個(種)。除非上下文另有要求，該說明書的通篇和之后的權利要求中，詞語"包括"、"包含"、"含有"("comprise")及其變型例如"comprises"和"comprising"，當理解為意口木著包含所述的整體(integer)或步驟或者整體或步驟的組，但不排除任何其它整體或步驟或者整體或步驟的組。本發明是部分基于下述發現，即在來自CRC患者結腸組織的細胞中TOM34的表達提高。應用綜合cDNA孩i陣列系統(comprehensivecDNAmicroarraysystem)鑒定了才是高的基因表達。先前應用含有23,040個基因的cDNA微陣列構建了20位患者的綜合基因表達模式。TOM34在CRC患者中高水平表達。本文鑒定的TOM34作為CRC標記用于診斷目的，或者作為基因靶標，對其表達進行改變以治療或減輕CRC癥狀。通過測量TOM34在細胞樣品中的表達而診斷CRC。類似地，通過測量響應于各種物質的TOM34的表達，可以鑒定治療CRC的物質。本發明涉及確定(例如測量)TOM34的表達。利用GeneBankTM數據庫條目提供的TOM34序列信息，應用本領域普通技術人員熟知的技術檢測和測量了TOM34。例如，使用相應于TOM34的序列數據庫條目內的序列來構建探針，用于在例如Northern印跡雜交分析中檢測TOM34RNA序列。另舉一例，該序列可用于構建引物，用于在例如基于擴增的檢測方法(例如基于逆轉錄的多聚酶鏈式反應)中特異性地擴增TOM34。然后將測試細胞群體如來源于患者的組織樣品中的TOM34表達水平與參照群中的TOM34表達水平進行比較。參照細胞群體包括一種或多種被比較參數已知的細胞，即CRC細胞或非CRC細胞。與參照細胞群體比較，測試細胞群體中的基因表達圖式是否指示CRC或其傾向性，取決于參照細胞群體的組成。例如，如果參照細胞群體由非CRC細胞組成，在測試細胞群體和參照細胞群體中基因表達模式相似則表明測試細胞群體為非CRC。相反地，如果參照細胞群體由CRC細胞組成，在測試細胞群體和參照細胞群體之間的基因表達模式相似則表明測試細胞群體包括CRC細胞。如果測試細胞群體中的TOM34的表達水平不同于參照細胞群體，相比于參照細胞群體中相應的TOM34變化了1.0倍、1.5倍、2.0倍、5.0倍、10.0倍或更多的倍數，則認為其表達水平發生了改變。可以將測試細胞群體和參照細胞群體之間差異的基因表達相對于對照核酸，例如持家基因進行標準化。例如，對照核酸是已知不依賴于細胞癌性或非癌性狀態而差異的核酸。可以使用對照核酸的表達水平來標準化測試細胞群體和參照細胞群體中的信號水平。對照基因的例子包括，但不限于，例如肌動蛋白、甘油醛3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白Pl。將測試細胞群體與多個參照細胞群體比較。所述已知參數在多個參照細胞群體的每一個中可以不同。因此，可以將測試細胞群體與已知含有例如CRC細胞的第二參照細胞群體相比較，以及與已知含有例如非CRC細胞(正常細胞)的第二參照細胞群體相比較。測試細胞群體可以包含在來自已知含有或懷疑含有CRC細胞的受試者的組織類型或細胞樣品中。測試細胞群體從身體組織或體液，例如生物流體(例如，血液，痰，唾液)中獲得。例如，測試細胞是從組織純化的。優選地，測試細胞群體包括上皮細胞。上皮細胞優選來自已知是或懷疑是CRC的組織。參照細胞群體中的細胞來源于與測試細胞相似的組織類型。可選地，參照細胞群體是細胞系，例如CRC細胞系(陽性對照)或正常非CRC細胞系(陰性對照)。或者，對照細胞群體來源于分子信息數據庫，所述數據庫來源于被測定參數或條件已知的細胞。受試者優選哺乳動物。哺乳動物可以是例如人、非人靈長類、小鼠、大鼠、狗、貓、馬或牛。本文公開的TOM34的表達使用本領域已知的方法在蛋白或者核酸水平上加以確定。例如，可以使用特異性識別該序列的探針進行Northern雜交分析來確定基因表達。或者，使用基于逆轉錄的PCR測定法來測量基因表達，例如，使用對于TOM34特異性的引物。也在蛋白水平上確定表達，即通過測量本文所述基因產物所編碼多肽的水平或其生物學活性。此類方法是本領域公知的，包括但不限于，例如，使用基于針對7UM^編碼蛋白的抗體的免疫測定。該基因編碼的蛋白質的生物活性也是已知的。診斷CRC:在本發明的背景下，通過測量來自測試細胞群體(即來源于患者的生物樣品)的TOM34表達水平而診斷CRC。優選地，測試細胞群體含有上皮細胞，例如，獲自結腸組織的細胞。也可從血或其它體液如尿測量基因表達。其它生物樣品可用于測量蛋白質水平。例如，可通過免疫測定或其它常規的生物測定來測量來源于待診斷受試者的血液或血清中的蛋白質水平。確定測試細胞或生物樣品中TOM34的表達，并與纟皮測TOM34的相關正常對照表達水平進行比較。正常對照水平是典型地在已知未患CRC群體中發現的TOM34表達模式。來源于患者的組織中TOM34表達水平的變化(例如增加)表明該受試者患有CRC或具有發生CRC的風險。例如，與于正常對照水平相比，測試群體中TOM34的表達的增加表明該受試者患有CRC或具有發生CRC的風險。與于正常對照水平相比，測試群體中TOM34的變化表明該受試者患有CRC或具有發生CRC的風險。可通過定量TOM34的相應mRNA或TOM34的編碼蛋白質來估計生物樣品中TOM34的表達水平。mRNA的定量方法是本領域熟知的。例如，可通過Northern印跡法或RT-PCR估計TOM34mRNA的水平。由于TOM34的核苷酸序列是已知的，任何本領域技術人員均可設計探針或引物的核苷酸序列以定量TOM34。例如，包含SEQIDNO:43和44所示核苷酸序列的TOM34特異性引物組是優選的引物。也可以基于TOM34蛋白的量或活性分析TOM34的表達水平。以下顯示了一種確定TOM34蛋白量的方法。例如，免疫測定方法對確定生物材料中的蛋白質是有用的。只要TOM34基因在結腸癌患者的樣品中表達，任何生物材料均可用作確定該蛋白質或其活性的生物樣品。例如，結腸組織可認為是這樣的生物樣品。然而，也可以分析體液例如血液和尿。另一方面，適于確定TOM34基因編碼蛋白質活性的方法，也可以根據待分析的蛋白質的活性加以選擇。估計生物樣品中的TOM34基因的表達水平并與正常樣品(例如來源于非患病受試者的樣品)中的表達水平進行比較。當這樣的比較顯示該基因的表達水平高于正常樣品的表達水平時，判斷該受試者為結腸癌受累。可以同時確定來自正常受試者和待診斷受試者的生物樣品中TOM34基因的表達水平。或者，可以通過統計方法確定表達水平的正常范圍，該方法基于對預先從對照組采集的樣品中的基因表達水平的分析結果。將通過比較受試者樣品獲得的結果與正常范圍相比；若該結果未落入該正常范圍，則判斷該受試者受累于結腸癌或具有發生結腸癌的風險。在本發明中還提供了用于診斷結腸癌的診斷試劑。本發明的診斷試劑包含與TOM34基因的多核香酸或多肽結合的化合物。優選地，與TOM34基因的多核苷酸雜交的寡核苷酸或與TOM34基因編碼的多肽結合的抗體可用作這樣的化合物。而且，適體，例如RNA、DNA或肽適體也可以用作這樣的化合物。優選地，該診斷劑包含可檢測標記，例如本領域公知的萸光、發光或生物發光標記。本文診斷結腸癌的方法可以用于評定受試者中結腸癌治療的效力。根據本方法，從正在經歷結腸癌治療的受試者獲取生物樣品例如測試細胞群體。該評定方法可根據診斷結腸癌的常規方法進行。如果需要，在治療前、治療中或治療后不同時間點從受試者獲取生物樣品。然后，確定該生物樣品中TOM34基因的表達水平，并與對照水平進行比較，其中對照水平來源于，例如，包括結腸癌狀態(即癌性細胞或非癌性細胞)已知的細胞的參照細胞群體。對照水平在未曾經受該治療的生物樣品中確定。如果對照水平是來源于不含癌性細胞的生物樣品，則來源于受試者的生物樣品中的表達水平與對照水平之間的相似性表明治療是有效的。來源于受試者的生物樣品中的TOM34基因的表達水平與對照水平之間的差異則表明不太令人滿意的臨床結果或預后。抑制TOM34表達的作用物質的鑒定通過將表達TOM34的測試細胞群體與測試物質接觸并確定TOM34的表達水平或其基因產物的活性，可以鑒定抑制TOM34表達或其基因產物活性的物質。相比于該測試物質不存在時的表達或活性水平，該物質存在時制劑并有用于抑制CRC。該測試細胞群體可以是任何表達TOM34的細胞。例如，該測試細胞群體可含有上皮細胞如來源于結腸組織的細胞。而且，測試細胞可以是來源于癌(carcinoma)細胞或結腸直腸癌的永生化細胞系。或者，測試細胞可以是轉染了TOM34的細胞，或者轉染了可操作地連接于報道基因的來自TOM34的調節序列(例如啟動子序列)的細胞。受試者中CRC治療的效力評估本文鑒定的差異表達TOM34還使得監測CRC的治療過程成為可能。在該方法中，從接受CRC治療的受試者提供測試細胞群體。如果希望的話，在治療前、治療中和治療后的不同時間點從受試者獲得測試細胞群體。然后確定細胞群體中TOM34的表達并與包括已知TOM34狀態的細胞的參照細胞群體相比較。在本發明的背景下，所述參照細胞應尚未暴露于感興趣的治療。如果參照細胞群體不含CRC細胞，則測試細胞群體中和參照細胞群體中TOM34表達相似表明該目標治療是有效的。然而，測試群體中與正常對照參照細胞群體中TOM34表達差異則表明不太令人滿意的臨床結果或預后。類似地，如果參照細胞群體含有CRC細胞，則測試細胞群體中和參照細胞群體中TOM34表達差異表明該目標治療是有效的，而在測試群體與癌癥對照參照細胞群體中TOM34表達相似則表明不太令人滿意的臨床結果或預后。另外，可以將治療后從受試者獲得的生物學樣品中確定的TOM34表達水平(即治療后水平)與治療前從受試者獲得的生物學樣品中確定的TOM3表達水平(即治療前水平)相比較。治療后樣品中TOM34表達水平的減少表明感興趣的治療是有效的，而治療后樣品中表達水平的增加或維持則指示較為不利的臨床結果或預后。本文中所用的術語"有效的，，表明該治療導致病理性上調基因表達下降，或導致受試者中CRC的大小、患病率(prevalence)或轉移潛力的減少。當目標治療是預防性地應用時，術語"有效的"意思是該治療延緩或預防CRC的形成，或延緩、預防或減輕臨床CRC的癥狀。結腸腫瘤的評定可應用標準臨床規程進行。此外，可結合任何有關已知的CRC診斷或治療方法確定有效性。CRC可通過例如鑒定異常癥狀，例如體重減輕、腹痛、背痛、食欲減退、惡心、嘔吐、全身不適、虛弱和黃痘，來加以-〖t斷。特定個體CRC治療的合適治療劑的選擇個體遺傳構成(geneticmakeup)的差異可導致他們代謝各種藥物的相對能力的差異。在受試者中被代謝并作為抗CRC劑起作用的物質，可通過誘導受試者細胞中的基因表達圖式從癌性狀態特征性基因表達圖式變成非癌性狀態特征性基因表達圖式的方式來顯示自身。因此，本文公開的TOM34使得人們有可能在來自選定受試者的測試細胞群體中測試假定的治療性或預防性CRC抑制劑，以確定物質在受試者中是否是合適的CRC抑制劑。為了鑒定適合于特定受試者的CRC抑制劑，將來自受試者的測試細胞群體暴露于治療劑處理，并確定TOM34的表達。在本發明的方法的背景下，測試細胞群體含有表達TOM34的CRC細胞。優選地，測試細胞為上皮細胞。例如，可以在候選物質存在下孵育測試細胞群體，可測量測試細胞群體的基因表達圖式，并與一個或多個參照模式，例如CRC參照表達模式或非CRC參照表達模式比較。相對于含有CRC的參照細胞群體，測試細胞群體中TOM34的表達下降表明該物質具有治療潛力。在本發明的背景下，測試物質可為任何化合物或組合物。示例性的測試物質包括但不限于免疫調節劑。用于鑒定治療物質的篩選測定應用rOM34基因、該基因編碼的蛋白質或該基因的轉錄調節區域，可以篩選改變該基因的表達或改變該基因編碼多肽的生物活性的化合物。這樣的化合物可以用作治療或預防CRC的藥物。因此，本發明提供了使用該n〕M34多肽篩選治療或預防CRC的化合物的方法。該篩選方法的一個實施方案中包含下列步驟a)使測試化合物與TOM34多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測該多肽和測試化合物之間的結合活性；和c)選擇與該多肽結合的測試化合物.用于篩選的rOK^多肽可以是重組多肽或源于自然的蛋白質或其部分肽。要與測試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶性蛋白、結合于載體的形式或與其它多肽融合的融合蛋白。就使用roMW多肽篩選蛋白質，例如與roM4多肽結合的蛋白質的方法而言，可使用許多本領域技術人員熟知的方法。可通過例如免疫沉淀方法，特別是如下方式進行這樣的篩選。將編碼roM^多肽的基因插入外源基因表達載體，例如pSV2neo、pcDNAI、pcDNA3.1、pCAGGS和pCD8，在宿主(例如動物)細胞等中表達該基因。用于表達的啟動子可以是任何可常用的啟動子，包括，例如，SV40早期啟動子(RigbyinWilliamson(ed.),GeneticEngineering,vol,3.AcademicPress,London,83-141(1981))、EF-a啟動子(KimDW,etal.,Gene91:217-23(1990))、CAG啟動子(Niwaetal.,Gene108:193-9(1991))、RSVLTR啟動子(Cullen,MethodsinEnzymology152:684-704(1987))、SRa啟動子(Takebeetal.,MolCellBiol8:466-72(1988))、CMV立即早期啟動子(SeedandAruffo,ProcNatlAcadSciUSA84:3365-9(1987》、SV40晚期啟動子(GheysenandFiers，JMolApplGenet1:385-94(1982))、腺病毒晚期啟動子(Kaufmanetal.,MolCellBiol9:946-58(1989))和HSVTK啟動子等等。可根據任何方法將基因導入宿主細胞以表達外源基因，例如，電穿孔法(Chuetal.,NucleicAcidsRes15:1311-26(1987》、磷酸釣法(ChenandOkayama，MolCellBiol7:2745-52(1987))、DEAE葡聚糖法(Lopataetal.,NucleicAcidsRes12:5707-17(1984);SussmanandMilman,MolCellBiol4:1641-3(1984》和脂質轉染試劑(Lipofectin)法(Derijard,BCell76:1025-37(1994);Lambetal.,NatureGenetics5:22-30(1993):Rabindranetal.，Science259:230-4(1993))等等。通過導入其特異性已明確的單克隆抗體的抗原表位至多肽的N或C末端，可將r<9MW基因編碼的多肽表達為含有單克隆抗體識別位點(抗原表位)的融合蛋白。可使用市售的抗原表位-抗體系統(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。可利用其多克隆位點表達具有例如半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶和綠色熒光蛋白(GFP)等等的融合蛋白的載體是可商購的。還報道了這樣制備的融合蛋白僅僅導入由數個至數十個個氨基酸構成的小表位以不改變多肽的特性。表位，例如多組氨酸(His-tag)、流感病毒聚集體(aggregate)HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-tag)、人單純皰滲病毒糖蛋白(HSV-tag)、E-tag(—種單克隆噬菌體上的抗原表位)等等以及識別它們的單克隆抗體，可用作表位-抗體系統以篩選結合于rOM34多肽的蛋白質(ExperimentalMedicine13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，通過將這些抗體加入至用合適的去污劑制備的細胞裂解產物而形成免疫復合物。免疫復合物由rOM^多肽、包括與該多肽結合能力的多肽、以及抗體。除了使用針對以上表位的抗體以外，也可以使用抗roM^多肽抗體進行免疫沉淀，這些抗體可如以上描述制備。當該抗體為小鼠IgG抗體時，可用例如蛋白Asepharose或蛋白Gsepharose沉淀免疫復合物。如果7DM^基因編碼的多肽被制備為帶有表位例如GST的融合蛋白，則可使用特異性結合這些表位的物質例如谷胱甘肽-sepharose4B,以與使用抗TOM34多肽抗體相同的方式形成免疫復合物。免疫沉淀可遵照或根據例如文獻(HarlowandLane，Antibodies,511-52,ColdSpringHarborLaboratorypublications,NewYork(1988))中的方法進行。SDS-PAGE通常用于免疫沉淀的蛋白質的分析，使用具有適合濃度的凝膠根據蛋白質的分子量分析結合的蛋白質。由于結合與rOM34多肽的蛋白質難于通過常規染色方法例如考馬斯染色(Coomassiestaining)和銀染色檢測，可通過如下步驟提高該蛋白質的檢測敏感性在含有放射性同位素"S-曱硫氨酸或"S-半胱氨酸的培養基中培養細胞，標記細胞中的蛋白質，并檢測該蛋白質。當一種蛋白質的分子量已經明確時，可直接從SDS聚丙烯酰胺凝膠純化出該靶蛋白并確定它的序列。作為使用rOM34多肽來篩選結合該多肽的蛋白質的方法，可使用例如West-Western印跡分析(Skolniketal.,Cell65:83-90(1991))。具體地，結合rOM54多肽的蛋白質可按如下步驟獲得使用噬菌體載體(例如ZAP)從期望表達結合7UM34多肽的蛋白質的細胞、組織、器官(例如，組織如睪丸或卵巢)或培養的細胞(例如CW2、DLD1、HCT116、HCT15、RKO、LS174T)制備cDNA文庫，在LB瓊脂糖上表達該蛋白質，將該蛋白質固定于濾膜(filter)上，使純化、標記的r(9MW多肽與上述濾膜反應，并根據標記檢測表達結合于TOM34多肽的蛋白的噬斑。本發明的多肽可利用生物素和抗生物素蛋白之間的結合，或者利用與rOM34多肽特異性結合的抗體或與7Y)M34多肽融合的肽或多肽(例如GST)而進行標記。也可采取使用放射性同位素或焚光等的方法。或者，本發明的篩選方法的另一實施方案中采用了利用細胞的雙雜交系統("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem","MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);參考文獻"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)，，，"FieldsandStemglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜交系統中，本發明的多肽與SRF結合區域或GAL4結合區域融合并表達于酵母細胞中。從期望表達結合本發明多肽的蛋白質的細胞制備cDNA文庫，使得這樣的文庫被表達時融合于VP16或GAL4轉錄激活區域。然后將該cDNA文庫導入以上酵母細胞，從檢測到的陽性克隆分離來源于該文庫的cDNA(當結合本發明多肽的蛋白質表達于酵母細胞中時，二者的結合激活報道基因，使得陽性克隆可檢測)。cDNA編碼的蛋白質可通過導入以上分離的cDNA至大腸桿菌中并表達而加以制備。除了HIS3基因之外，例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和螢光素酶基因可用作報道基因。也可用親合色i普法篩選與r(9M34基因編碼多肽結合的化合物。例如，可將本發明的多肽固定于親和柱載體上，將含有可結合本發明多肽之蛋白質的測試化合物加至該柱子上。本文中的測試化合物可以是，例如，細胞提取物、細胞裂解物等等。加載該測試化合物后，洗滌該柱子，然后可制備與本發明多肽結合的化合物。當測試化合物是蛋白質時，分析所獲蛋白質的氨基酸序列，基于所述序列合成寡聚DNA，并使用該寡聚DNA作為探針篩選cDNA文庫以獲得編碼該蛋白質的DNA。使用表面等離子共振現象的生物傳感器可以用作檢測或定量本發明中的結合化合物的手段。當使用這樣的生物傳感器(例如BIAcore，Pharmacia)時，僅僅使用微小量的多肽且不用標記，即可通過表面等離子共振信號實時觀察本發明多肽與測試化合物之間的相互作用。因此，使用生物傳感器例如BIAcore有可能評估本發明多肽與測試化合物之間的結合。當使固定化的rOM54多肽暴露于合成化合物或天然物質庫(naturalsubstancebanks)或隨機p藍菌體肽展示文庫(randomphagepeptidedisplaylibrary)時，篩選結合分子的方法，以及使用基于組合化學技術的高通量來分離與TOM34蛋白結合的蛋白質乃至化合物(包括激動劑和拮抗劑)的篩選方法(Wrightonetal.，Science273:458-64(1996);Verdine,Nature384:11-13(1996);Hogan，Nature384:17-9(1996)),是本領域技術人員公知的。或者，本發明提供一種使用rOM34基因編碼的多肽來篩選用于治療或預防CRC的化合物的方法，包含如下步驟a)使測試化合物與TOM34的多核普酸編碼的多肽接觸；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇這樣的測試化合物，與不存在測試化合物時檢測的所述多肽的生物活性相比，其抑制TOM34的多核香酸編碼之多肽的活性。由于rOMW蛋白具有促進CRC細胞之細胞增殖的活性，使用該活性作為指標可篩選抑制該蛋白這種活性的化合物。任何多肽只要它們包含蛋白的生物活性就可用于篩選。這樣的生物活性包括人roM^蛋白的細胞增殖活性。例如，可使用roM34蛋白，也可使用功能上等價于這些蛋白質的多肽。這樣的多肽可由細胞內源性或外源性地表達。通過如此篩選分離的化合物，是roM3^基因編碼多肽的激動劑或拮抗劑的候選物。術語"激動劑"指的是通過與多肽結合而活化其功能的分子。同樣地，術語"拮抗劑"指的是通過與多肽結合而抑制其功能的分子。而且，通過如此篩選分離的化合物，是抑制多肽與分子(包括DNA和蛋白質)體內相互作用的化合物的候選物。當本方法中待檢測的生物活性為細胞增殖時，其可以，例如，通過制備表達roM3^多肽的細胞，在測試化合物存在下培養該細胞，并確定細胞增殖的速度，測量細胞周期等等加以斥企測，以及如實施例所描述的那樣通過測量集落形成活性來加以檢測。在一個進一步的實施方案中，本發明提供篩選用于治療或預防CRC的化合物的方法。如以上詳細討論的，通過控制roM^的表達水平，可以控制CRC的發作和進展。因此，使用以rOM34的表達水平作為指標的篩選，能夠鑒定可用于治療或預防CRC的化合物。在本發明的背景下，這樣的篩選可包含例如下列步驟a)使候選化合物與表達TOM34的細胞接觸；和b)選擇這樣的候選化合物相比于不存在候選化合物時的對照水平，其降低TOM34的表達水平。表達7Y9M^的細胞包括例如從CRC建立的細胞系；這樣的細胞可用于上文本發明的篩選(例如CW2、DLD1、HCT116、RKO、LS174T)。可使用本領域技術人員熟知的方法估計表達水平。在篩選方法中，可選擇降低TOM34表達水平的化合物作為用于治療或預防CRC的候選物質。或者，本發明的篩選方法可包含如下步驟a)使候選化合物與已經導入載體的細胞接觸，該載體包含TOM34的轉錄調節區域和在該轉錄調節區域控制下表達的報道基因；b)測量所述報道基因的表達或活性；和c)選擇降低所述報道基因的表達或活性的候選化合物。適合的報道基因和宿主細胞是本領域熟知的。篩選所需的報道構建體(reporterconstruct)可使用標志基因的轉錄調節區域加以制備。若本領域技術人員已經得知標志基因的轉錄調節區域，則可使用先有的序列信息制備報道構建體。當標志基因的轉錄調節區域尚未鑒定時，可基于標志基因的核苷酸序列信息，從染色體文庫分離含有該轉錄調節區域的核苷酸節段(nucleotidesegment)。可以用于結合蛋白質的支持物的例子包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和葡聚糖；以及合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅(silicon);優選使用可市售的由以上材料制成的珠子(beads)和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠子時，它們可填充于柱子中。可根據常規方法例如化學鍵合和物理吸附將蛋白質結合于支持物。或者，可借助特異性識別該蛋白質的抗體將蛋白質結合于支持物。而且，也可藉由抗生物素蛋白和生物素將蛋白質結合于支持物。只要緩沖液不抑制蛋白質之間的結合，蛋白質之間的結合在緩沖液中，例如但不限于磷酸鹽緩沖液和三羥曱基氨基曱烷(Tris)緩沖液中進行。在本發明中，使用表面等離子共振現象的生物傳感器可用作檢測或定量結合蛋白質的手段。當使用這樣的生物傳感器時(例如BIAcore,Pharmacia)，僅僅使用微小量的多肽且不用標記，蛋白質之間的相互作用可作為表面等離子共振信號而得以實時觀察。或者，可以標記多肽，并且可利用結合蛋白質的標記物來檢測或測量該結合蛋白質。特別地，在預標記了這些蛋白質中的一個以后，在測試化合物存在下使被標記的蛋白質與另一蛋白質接觸，然后，經過洗滌，根據標記物檢測或測量結合蛋白質。標記物質，例如放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶類(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶)、熒光物質(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、羅丹明)和生物素/抗生物素蛋白，可用于在本方法中的蛋白質標記。當蛋白質標記有放射性同位素時，可通過液體閃爍進行檢測或測量。或者，以酶標記的蛋白質，可以通過加入酶的底物，用吸收光度計檢測底物的酶促變化例如顏色的發生，來檢測或測量。進一步地，在使用熒光物質作為標記物的情形下，可以使用熒光光度計檢測或測量結合蛋白質。在本篩選中使用抗體的情形下，優選用上面提及的標記物質之一標記該抗體，并基于該標記物質才企測或測量該抗體。或者，可使用抗TOM34多肽或肌動蛋白的抗體作為第一抗體，該第一抗體用標記有標記物質的第二抗體加以4企測。而且，可使用蛋白G或蛋白A柱子檢測或測量在本發明篩選中結合于蛋白質的抗體。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可使用利用細胞的雙雜交系統("MATCHMAKERTwo-Hybridsystem"，"MATCHMAKERMammalianTwo-HybridAssayKit","MATCHMAKERone-Hybridsystem"(Clontech);"HybriZAPTwo-HybridVectorSystem"(Stratagene);參考文獻"DaltonandTreisman,Cell68:597-612(1992)","FieldsandSternglanz,TrendsGenet10:286-92(1994)")。在雙雜交系統中，本發明的rOM34多肽融合至SRF結合區域或GAL4結合區域，并在酵母細胞中表達。作為報道基因，除了HIS3基因之外，可使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因和螢光素酶基因。任何測試化合物，例如，細胞提取物、細胞培養上清、發酵樣i生物產物、海洋生物提取物、植物提取物、純化或粗蛋白質、肽、非肽化合物、中，也可使用本領域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來獲得測試化合物，包括(l)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatiallyaddressableparallelsolidphaseorsolutionphaselibraries),(3)需要解巻積(deconvolution)的合成文庫法，(4)"一珠一化合物"("one-beadone-compound")文庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam(1997)AnticancerDrugDes.12:145-67)。合成分子文庫方法的例子可在本領域中找到(DeWittetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6909-13;Erbetal.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:11422-6;Zuckermannetal.(1994)J.Med.Chem.37:2678-85;Choetal.(1993)Science261:1303-5;Carelletal,(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carelletal.(1994)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Gallopetal.(1994)J.Med.Chem.37:1233-51)。化合物文庫可提供于溶液中(參見Houghten(1992)Bio/Techniques13:412陽21)或珠子上(Lam(1991)Nature354:82-4)、芯片上(Fodor(1993)Nature364:555-6)、細菌上(USPat.No.5,223,409)、孢子上(USPat.No,5,571,698;5,403,484，and5,223,409),質粒上(Culletal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1865畫9)或噬菌體上(ScottandSmith(1990)Science249:386-90;Devlin(1990)Science249:404-6;Cwirlaetal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:6378-82;Fdici(1991)J.Mol.Biol.222:301-10;美國專利申請2002103360)。通過本發明的篩選方法分離的化合物是抑制TOM34多肽活性、為治療或預防例如屬于細胞增殖性疾病的疾病如CRC的藥物的候選物。通過本發明的篩選方法獲得的化合物包括通過本發明的本篩選方法獲得的化合物的部分結構通過添加、缺失和/或取代而轉換的化合物。用于治療或預防CRC的藥物組合物當本發明的方法分離的化合物作為藥物施用于人和其它哺乳動物例如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、貓、狗、綿羊、豬、牛、猴、狒狒和猩猩時，該分離的化合物可直接施用或可使用已知的藥物制劑方法按方制造成劑型。例如，根據需要，該藥物可以作為糖包衣片、膠嚢、酏劑和微膠嚢劑而口服，或以無菌溶液注射劑或含水懸浮劑或任何其它藥學可接受的液體的形式非口服施用。例如，該化合物可與藥學可接受的載體或介質特別是滅菌水、生理鹽水、植物油、乳化劑、懸浮劑、表面活性劑、穩定劑、調味劑、賦形劑、溶媒、防腐劑、粘合劑等混合成適于公知藥物實施(drugimplementation)所需的單位劑型。這些制劑中活性成份構成可得的標稱范圍內的合適劑量。可以摻混到片劑和膠嚢劑中的添加劑的例子包括但不限于粘合劑如明膠、玉米淀粉、西黃蓍膠和阿拉伯膠；賦形劑如結晶纖維素；膨脹劑如玉米淀粉、明膠和海藻酸；潤滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；和增味劑如薄荷、a&"of/^x油和櫻桃。當單位劑型是膠嚢劑時，上述成分中還可以進一步包括液體載體如油類液體。可以根據常規藥物實施方法使用注射用蒸餾水等溶^某配制注射用無菌組合物。生理鹽水、葡萄糖和其它含有輔料的等滲液可以用作注射用水溶液，所述的輔料包括D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化鈉。它們可以與合適的增溶劑結合使用，增溶劑有例如醇(如乙醇)、多元醇如丙二醇和聚乙二醇；及非離子表面活性劑如Polysorbate80(TM)和HCO-50。芝麻油或大豆油可以用作油狀液體，可以與苯曱酸苯曱醇酯或苯曱醇結合使用作為增溶劑，并且可以與下列物質一起配制緩沖劑，例如磷酸鹽緩沖劑和乙酸鈉緩沖劑；止痛劑，如鹽酸普魯卡因；穩定劑，如苯曱醇和苯酚；和/或抗氧化劑。制成的注射劑可以充入合適的安瓿中。可以使用本領域技術人員知道的方法對患者施用本發明的藥物組合物，例如作為動脈內、靜脈內或經皮注射，或作為鼻內、經支氣管、肌肉內或口服施用。施用方法和劑量根據患者的體重和年齡和施用方法而變化，但本領域的技術人員可常規地選擇合適的施用方法。此外，若所述的化合物是可被DNA編碼的，則可將該DNA插入基因治療用載體，然后將該載體施用于患者進行治療。施用劑量和方法根據患者的體重、年齡和癥狀而變化，但本領域的技術人員能夠合適地選擇它們。例如，盡管與本發明的蛋白質結合并調節其活性的化合物的取決于癥狀，當口服地施用于正常成人(體重60kg)時，通常的劑量為每天約0.1至約100mg，優選每天約1.0至約50mg，更優選每天約1.0至約20mg。當通過非消化道途徑以注射劑形式施用化合物于正常成人(體重60kg)時，盡管根據患者、靶器官、癥狀和施用方法而有一些不同，但方便的是靜脈內注射每天約0.01至約30mg，優選每天約0.1至約20mg,更優選每天約0.1至約10mg的劑量。在其它動物的情形下，可通過換算為60kg體重常規地求出適合的劑量。患有CRC的受試者的預后評定本發明還提供評估患有CRC的受試者之預后的方法，包括將測試細胞群體中TOM34的表達與參照細胞群體中TOM34的表達相比較的步驟，其中參照細胞群體來源于處于一系列疾病階段的患者。通過比較TOM34在測試細胞群體中和參照細胞群體中的基因表達，或者通過經時地比較來自受試者的測試細胞群體中的基因表達圖式，可以評價受試者的預后。例如，TOM34表達相比于正常對照樣品的增加指示較為不利的預后。相反，TOM34表達與正常對照樣品的相似性，指示受試者較為有利的預后。試劑盒本發明還包括CRC檢測試劑，例如，特異性結合或鑒定TOM34核酸的核酸，例如與TOM34核酸的一部分互補的寡核香酸序列，或者與TOM34核酸編碼的蛋白結合的抗體，或者適體。可以以試劑盒的形式將檢測試劑包裝在一起。例如，檢測試劑可以包裝在不同的容器中，例如核酸或抗體(或者結合于固體基質，或者與用于將它們結合于基質的試劑分別包裝)、對照試劑(陽性/陰性)、和/或可檢測標簽。該試劑盒中還可以包括關于實施測定的說明書(例如書面(written)、磁帶(tape)、VCR、CD-ROM等)。試劑盒的測定樣式可以是Northern雜交或夾心ELISA,二者都是本領域已知的。例如，CRC檢測試劑可以固定在固體基質，例如多孔片條(porousstrip)上，形成至少一個CRC檢測位點。多孔片條的測量或檢測區域可包括多個位點，每個均含有核酸。測試片條(teststrip)也可以含有用于陰性和/或陽性對照的位點。或者，對照位點可以位于不同于所述測試片條的片條上。任選地，不同的檢測位點可含有不同量的固定核酸，即第一4企測位點中的量較高，隨后的位點中的量較低。添加測試樣品時，顯示可檢測信號的位點的數目提供樣品中存在的CRC的定量指標。檢測位點可以構成為任何可合適檢測的形狀，典型地是跨越測試片條寬度的條形或點形。抑制CRC的方法本發明進一步提供一種通過減少TOM34的表達(或者其基因產物的活性)來治療或緩解受試者中CRC癥狀的方法。可以對患有或有風險發生(或易感)CRC的受試者預防性或治療性地施用合適的治療化合物。這樣的受試者可以通過標準臨床方法來鑒定，或者通過4全測TOM34的異常表達水平或者其基因產物的異常活性來鑒定。在本發明的背景下，合適的治療劑包括，例如，細胞周期調節和細胞增殖的抑制劑。或者，本發明的治療方法可包括減少TOM34基因產物的表達、功能，或其二者的步驟，其中TOM34的表達在結腸癌細胞中異常增加("上調"或"過高表達"的基因)。可以通過本領域已知的多種方法中的任何方法來抑制表達。例如，可以對受試者施用抑制或拮抗過高表達基因之表達的核酸，例如破壞過高表達基因之表達的反義寡核苷酸或小干擾RNA。當然，本文中描述的治療或緩解方法，經過必要的修改后，可適用于本文所述之減少TOM34表達(或其基因產物之活性)的化合物在制備用于治療或緩解受試者中結腸癌的藥物組合物中的用途。這樣的化合物可以是，例如，反義、siRNA、抗體、適體或核酶組合物。反義核酸及siRNA:如上所述，可以使用相應于TOM34核苷酸序列的反義核酸來降低該基因的表達水平。相應于CRC中上調的TOM34的反義核酸對CRC治療是有用的。具體地說，本發明的反義核酸可以如下起作用結合TOM34的核苷酸序列，或其相應的mRNA,從而抑制所述基因的轉錄或翻i,，促進mRNA降解，和/或抑制TOM34所編碼的蛋白質的表達，由此抑制這些蛋白的功能。本文所使用的術語"反義核酸"涵蓋與靶序列完全互補的核苷酸，和具有一個或多個核苷酸錯配的核苷酸，只要這些反義核酸能夠特異性地與靶序列雜交。例如，本發明的反義核酸包括在至少15個連續核苷酸的范圍內具有至少70%或更高、優選80%或更高、更優選90%或更高、甚至更優選95%或更高的同源性的多核苦酸。可以使用本領域已知的算法確定同源性。本發明的反義核酸通過下述方式作用于產生TOM34編碼蛋白的細胞結合編碼所述蛋白的DNA或mRNA,抑制它們的轉錄或翻譯，促進mRNA降解，抑制蛋白質的表達，從而導致蛋白功能的抑制。混，制成外用制劑，例如搽劑或罨劑。并且，根據需要，通過添加賦形劑、等滲劑(isotonicagents)、增溶劑、穩定劑、防腐劑、鎮痛劑等，可以將本發明的反義核酸配制成片劑、粉末、顆粒、膠嚢、脂質體膠嚢、注射劑、溶液、滴鼻劑和凍干劑。這些劑型可通過下文的7>知方法制備。本發明的反義核酸可以通過直接施于患處上，或者通過注射入血管以使其到達患處，來施用于患者。也可以使用反義封固介質(antisense-mountingmedium)以提高持久性和膜通透性。例子包括但不限于脂質體、聚-L-賴氨酸、脂質、膽固醇、脂質轉染試劑(lipofectine)或它們的衍生物。本發明的反義核酸衍生物的劑量，可以根據患者的狀況適當調整，并以所需的量使用。例如，可以施用0.1至100mg/kg，優選O.l至50mg/kg的劑量范圍。本發明的反義核酸抑制本發明蛋白質的表達，因而可以用于抑制本發明蛋白質的生物活性。此外，含有本發明的反義核酸的表達抑制劑也是有用的，因為它們可以抑制本發明的蛋白質的生物活性。在靶細胞中siRNA與對應于TOM34的轉錄物結合導致細胞的蛋白質產生減少。寡核苷酸的長度為至少IO個核苷酸，可以與天然存在的轉錄物等長。優選寡核苷酸的長度為少于75、50、25個核苷酸。最優選寡核苷酸的長度為19-25個核苷酸。本發明的反義核酸包括經修飾的寡核苷酸。例如，可以使用硫羰酸化(thioated)寡核苷酸以賦予針對寡核苷酸核酸酶的抗性。而且，可以使用針對TOM34的siRNA以降低TOM34的表達水平。本說明書中，術語"siRNA"指阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。可以采用將siRNA導入細胞的標準技術，這其中包括以DNA為RNA轉錄之才莫板的技術。在本發明的背景下，siRNA含有有義核酸序列和針對上調標志物基因例如TOM34的反義核Si序列。構建siRNA以使單一轉錄物具有來自靶基因的互補的反義序列和有義序列，例如發夾結構。TOM34的siRNA與耙mRNA雜交，通過與通常為單鏈的mRNA轉錄本相結合，從而干擾翻譯，進而干擾蛋白質的表達，藉此減少或抑制TOM34編碼之多肽的產生。因此，本發明的siRNA分子可通過其在嚴緊條件下與TOM34的mRNA特異性雜交的能力來定義。為了本發明的目的，術語"雜交"或"特異性雜交"用于表示兩個核酸分子在"嚴緊雜交條件下"雜交的能力。短語"嚴緊雜交條件"是指這樣的條件，在該條件下，典型地在檢測的雜交。嚴緊條件是序列依賴性的，在不同的環境下會不同。越長的序列在越高的溫度發生特異性雜交。在下列文獻中可找到核酸雜交的詳細才旨導Tijssen，rec/zw々M&y/"5z'oc/zew^^vAfo/ecw/arWo/ogy—外Z)W6fe加'oww"/zWwc/e/c尸raZ&y,"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidassays"(1993)。一4殳i也，嚴:緊條件選擇比限定的離子強度pH下特定序列的熱解鏈溫度(TJ低大約5-10°C。Tm是這樣的溫度(在限定的離子強度，pH和核濃度)，在該溫度平衡狀態時時，50%的探針被占據)。嚴緊條件還可以通過添加去穩定劑如曱酰胺實現。對于選擇性或特異性雜交而言，陽性信號至少是背景的2倍，優選地是背景雜交的10倍。嚴緊雜交條件的實例可如下50%曱酰胺、5xSSC和l。/cSDS,42。C溫育，或者5xSSC、1%SDS，65。C溫育，在50°C0.2xSSC、和0.1。/。SDS中清洗。在本發明的背景下，siRNA的長度優選小于500、200、100、50、或者25個核苦酸。更優選地，siRNA的長度為19-25個核芬酸。示例性的用于產生TOM34siRNA的核S吏序列包含SEQIDNO:48或52的核芬酸的序列作為靶序列。在RNA或其衍生物中，核苷酸序列中的堿基"t"應當替換為"u"。因此，例如，本發明提供包含核香酸序列5'-gaaaguguucucuacucca-3，(SEQIDNO:48)或5'隱ggauggaaacugcagagac-3，(SEQIDNO:52)的雙鏈RNA分子。為了提高siRNA的抑制活性，在靶序列反義鏈的3，端可以添加核苷酸"u"。所添加的"u"的數目為至少2個，一般2-10個，優選地2-5個。添加的"u"在siRNA反義鏈的3'端形成單鏈。可以將TOM34的siRNA以能與mRNA轉錄物結合的形式直接導入細胞。在這些實施方案中，典型地如上文對反義分子的描述對本發明的siRNA分子進行修飾。其他修飾也是可能的，例如膽固醇偶聯的siRNA顯示藥理學性質改善(Songetal.NatureMed.9:347-51(2003))。或者，可以在載體中攜帶編碼siRNA的DNA。載體可以例如這樣制備將TOM34靶序列克隆到表達載體中，其中所述表達載體具有可操作連接的調控序列，所述調控序列以這樣的方式位于所述靶序列的側翼，使得兩條鏈均有可能得以表達(通過DNA分子的轉錄)(Lee,N.S.,etal"(2002)NatureBiotechnology20:500-5.)。與TOM34mRNA反義的RNA分子由第一啟動子(例如位于所克隆DNA3'側的啟動子序列)轉錄，而作為TOM34mRNA之有義鏈的RNA分子則由第二啟動子(例如位于所克隆DNA5，側的啟動子序列)轉錄。所述有義鏈和反義鏈在體內雜交，從而產生用于沉默所述TOM34的siRNA構建體。或者，可以利用兩個構建體生成siRNA構建體的有義鏈和反義鏈。克隆的TOM34可編碼具有二級結構例如發夾的構建體，其中單一轉錄物具有來自靶基因的互補反義序列和有義序列。為了形成發夾環結構，可在有義序列和反義序列之間放置由任意核苷酸序列組成的環序列(loopsequence)。因此，本發明還提供具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，的siRNA，其中[A]為對應于與TOM34的mRNA或cDNA特異性雜交之序列的核糖核苷酸序列，[B]為由3-23個核苷酸組成的核糖核苷酸序列，和[A，]是由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。[A]區與[A，]區雜交，然后形成由[B]區組成的環(loop)。所述環序列的長度可以為3-23個核苷酸。所述環序列例如可以選自下列序列(http://ambionxom/tecMb/tb/tb_50dhtml)。此外，由23個核香酸組成的環序列也提供活性siRNA(Jacque,J,M.,etal.,(2002)Nature418:435-8.)。CCC,CCACC或CCACACC:Jacque,J.M,etal.,(2002)Nature,Vol.418:435-8。UUCG:Lee，N.S.，etal.，(2002)NatureBiotechnology20:500-5.;Fruscoloni,P.，etal.，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100(4):1639-44。UUCAAGAGA:Dykxhoorn,D.M.，etal.,(2003)NatureReviewsCellBiology4:457-67。因此，環序列可以選自下組CCC、UUCG、CCACC、CCACACC和UUCAAGAGA。優選的環序列是UUCAAGAGA(DNA中為"ttcaagaga")。在本發明的背景下適于使用的示例性發夾siRNA包括對TOM34-siRNA-D(siD，針對靶序列SEQIDNO:48)5'-gaaaguguucucuacucca-[B]畫uggaguagagaacacuuuc-3'(SEQIDNO:49)and對TOM34-siRNA-E(s正，針對靶序列SEQIDNO:52)5'-ggauggaaacugcagagac-[B]-gucucugcaguuuccaucc-3'(SEQIDNO:53)適當的siRNA的核苷酸序列可使用可從Ambion網站(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder,html)得到的siRNA設計計算機程序來設計。所述計算機程序基于如下規程選擇核苷酸序列用于siRNA合成。選擇siRNA靶位點1.從目標轉錄物的AUG起始密碼子開始向下游掃描尋找AA二核苷酸序列。記錄每個AA的出現及其3'側鄰近的19個核苷酸作為siRNA靶位點。根據Tuschl等在(1999)GenesDev13(24):3191-7，不推薦針對5'和3'非翻譯區(UTRs)和鄰近起始密碼子的區域(75個堿基之內)設計siRNA，因為上述區域可能富含調控蛋白結合位點。UTR結合蛋白和/或翻"％起始復合物可干擾與siRNA內切核酸酶復合物的結合。2.將所述潛在靶位點與人基因組數據庫進行比較，從考慮范圍中排除與其它編碼序列具有顯著的序列同一性的任何靶序列。可采用BLAST2.0進行序列同一性搜索，它可以在NCBI服務器ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到。3.選擇合格的靶序列用于合成。在Ambion，優選可沿著待評價的基因的長度選擇數個靶序列。側翼鄰接于TOM34基因序列的調節序列可以相同，也可以不同，使得它們的表達可以獨立地、或者以時間性或空間性方式得到調控。通過將TOM34模板分別克隆到載體中來胞內轉錄siRNA,其中所述載體含有例如來自小核RNA(snRNA)U6的RNA聚合酶III轉錄單位或人HIRNA啟動子。為了將載體導入細胞，可以使用轉染增強劑(transfection-enhancingagent)。FuGENE(Rochediagnostices)，Lipofectamine2000(Invitrogen),Oligofectamine(Invitrogen)和Nucleofactor(WakopureChemical)可以用作轉染增強劑。本發明的反義寡核苷酸或siRNA抑制本發明多肽的表達，因而可以用于抑制本發明多肽的生物學活性。并且，含有本發明的反義寡核苷酸或siRNA的表達抑制劑是有用的，因為它們可以抑制本發明多肽的生物學活性。因此，包含本發明的反義寡核苷酸或siRNA的組合物對于治療CRC是有用的。抗體或者，可以通過施用與基因產物結合或以其它方式抑制基因產物功能的化合物，來抑制在CRC中過高表達的TOM34的基因產物的功能。例如，所述化合物是與TOM34的基因產物結合的抗體。本發明涉及抗體特別是針對TOM34編碼蛋白的抗體、或所述抗體的片段的用途。如本說明書中使用的，術語"抗體"指具有特定結構的免疫球蛋白分子，其僅與用于合成該抗體的抗原(即上調標志的基因產物)或與其緊密相關的抗原相互作用(即結合)。另外，抗體可以是抗體片段或修飾抗體，只要它結合TOM34編碼的蛋白。例如，抗體片段可以是Fab,F(ab，)2,Fv,或單鏈Fv(scFv)，在scFv中來自重鏈和輕鏈的Fv片^殳通過合適的接頭連接(HustonJ.S.etal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5879-83(1988))。更具體地說，可以用酶，包括木瓜蛋白酶或胃蛋白酶處理抗體來生成抗體片段。或者，可以構建編碼抗體片段的基因，將其插入表達載體，然后在合適的組主細胞中表達(參見例如，CoM.S.etal.J.Immunol.152:2968-76(1994);BetterM.andHorwitzA.H.MethodsEnzymol.178:476-96(1989);PluckthunA.andSkerraA.MethodsEnzymol.178:497-515(1989);LamoyiE.MethodsEnzymol.121:652-63(1986);RousseauxJ.etal.MethodsEnzymol.121:663-9(1986);BirdR,E.andWalkerB.W.TrendsBiotechnol.9:132-7(1991))。抗體可以通過與各種分子如聚乙二醇(PEG)偶聯進行修飾。本發明提供這樣的修飾抗體。可通過將抗體進行化學修飾來獲得修飾抗體。這些修飾方法是本領域常規的。或者，抗體可包括嵌合抗體，其具有來自非人抗體的可變區及來自人抗體的恒定區，或者人源化抗體，其包括來自非人抗體的互補決定區(CDR)、和來自人抗體的框架區(FR)及恒定區。所述抗體可利用已知技術制備。人源化可通過用嚙齒類的CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列的方式進行(見例如Verhoeyenetal.,Science239:1534-1536(1988))。因而，這樣的人源化抗體是嵌合抗體，其中實質上少于整個人源可變域的區域已被來自非人物種的相應序列取代。這樣的抗體可利用本領域已知的各種技術制備。例如，體外方法包括使用在噬菌體上展示的人抗體片段的重組文庫(例如，Hoogenboom&Winter,(1992)J.Mol.Biol.227:381-8)。類似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基因動物，例如內源性免疫球蛋白基因部分或完全失活的小鼠，來制備人源抗體。該方法描述于例如美國專利Nos.6,150,584;5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5，633，425;5,661,016。指向癌細胞中發生的特異性分子變化的癌癥療法的有效性，已經通過下述抗癌藥的臨床開發和管理機構的批準得以證實用于治療晚期乳腺癌的曲妥單抗(trastuzumab)(Herceptin)，用于治療慢性髓性白血病的曱磺酸伊馬替尼(imatinibmethylate)(Gleevec),用于治療非小細胞肺癌(NSCLC)的gefitinib(Iressa)和用于B細胞淋巴瘤和外膜細胞(mantlecell)淋巴瘤的rituximab(抗CD20單克隆抗體)(CiardielloF.etal.，ClinCancerRes.2001Oct;7(10):2958-70.SlamonDJ.etal"NEnglJMed.2001Mar15;344(ll):783-92.;RehwaldU.etal"Blood.2003Jan15;101(2):420-424.;FangG.etal.,(2000).Blood，96,2246-2253)。這些藥物臨床上是有效的，并且比傳統抗癌劑具有更好的耐受性，因為它們僅僅耙向轉化的細胞。因此，這些藥物不僅改善了癌癥患者的存活率和生活質量，而且證明了分子靶向癌癥療法的理念。另外，當靶向藥物與標準化療組合使用時，可以增強標準化療的效力(GianniL.(2002).Oncology,63Suppl1,47-56.;KlejmanA.etal.，(2002).Oncogene,21，5868-5876.)。因此，未來的癌癥治療將很可能涉及將常規藥物與針對腫瘤細胞不同特性如血管生成(angiogenesis)和浸潤性(invasiveness)的輩巴特異性作用物質相結合。這些調節方法可以離體(exvivo)、體外(例如通過在作用物質的存在下培養細胞)或體內(例如通過給受試者施用作用物質)進行。所述方法包括施用蛋白質或蛋白質的組合、或者核酸分子或核酸分子的組合作為抵抗(counteract)差異表達基因的異常表達或其基因產物的異常活性的療法。可以用拮抗(即降低或抑制)一種或多種過高表達基因之活性的治療劑來治療以基因和基因產物的表達水平或生物活性(相對于未患有疾病或病癥的受試者)增加為特征的疾病和病癥。可以治療性或預防性地施用拮抗活性的治療劑。因此，可以用于本發明背景下的治療劑包括例如(i)過高表達基因的多肽或其類似物、衍生物、片段或同源物；(ii)抗過高表達基因或基因產物的抗體；(iii)編碼過高表達基因的核酸；(iv)反義核酸或"功能障礙性(dysfunctional)"核酸(即，由于過高表達基因的核酸內的異源插入所致)；(v)小干擾RNA(siRNA);或(vi)調節劑(即，改變過高表達或過低表達多肽與其結合配對物(bindingpartner)之間的相互作用的抑制劑、激動劑和拮抗劑)。將功能障礙性反義分子用于通過同源重組來"敲除"多肽的內源性功能(參見例如Capecchi,(1989)Science244:128892)。通過獲取患者組織樣品(例如從活;險組織)，并在體外測定其RNA或肽水平、表達的肽(或表達改變的基因的mRNA)的結構和/或活性，來定量肽和/或RNA，可以容易地檢測出水平的上升或下降。本領域公知的方法包括但不限于免疫測定(例如在Western印跡分析、免疫沉淀后隨十二烷基磺酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳、免疫細胞化學等)和/或4企測mRNA表達的雜交測定(例如Northern測定、點印跡、原位雜交等)。預防性施用在出現疾病的明顯臨床癥狀之前進行，以阻止疾病或病癥的出現或者延遲其進程。調節差異表達基因的基因產物的一種或多種活性。蛋白質活性調節劑的例子包括但不限于核酸、蛋白質、這些蛋白質的天然存在的關連配體(naturallyoccurringcognateligands)、肽、肽才莫扣乂4勿及其它'J、分子。針對CRC的接種在本發明中，TOM34來源的肽被證明是HLA-24限制性的TAA表位，HLA-24是日本人和白種人群中普遍的HLA等位基因。利用候選的TOM34來源HLA-A24結合肽對HLA-A24的結合親和力的信息鑒定了它們。用這些負載這些肽的樹突狀細胞(DC)體外刺激T細胞后，使用TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7))成功地建立了CTL。這些CTL表現針對結腸直腸癌細胞的強細胞毒活性。此外，來源于這些細胞的CTL克隆和系也針對內源過高表達TOM34的HLA-A24陽性結腸直腸癌細胞顯示了特異性細胞毒性。這些CTL克隆和CTL系的細胞毒活性針對缺少HLA-A24或靶TAA表達的細胞系則沒有得到顯示。這些CTL克隆和CTL系的特異性細胞毒活性被非放射性靶(coldtarget)顯著地抑制。這些結果證明，TOM34可用作CRC的TAA，且TOM34是HLA-A24限制性TAA的表位肽。由于TOM34抗原在大多數CRC中過高表達且與腫瘤細胞增殖相關，它們是用于抗CRC免疫療法的良好靶標。因此，本發明進一步提供治療或預防CRC的方法，所述方法包括施用包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的、少于約40個氨基酸，往往少于約20個氨基酸，通常少于約15個氨基酸的免疫原性肽的步驟。或者，所述免疫原性肽可包括SEQIDNO:7所示序列的衍生物，其中1個、2個、3個或者數個氨基酸被修飾、取代或添加。在優選的實施方案中，免疫原性肽是九肽或十肽。或者，本發明提供一種誘導針對CRC的抗腫瘤免疫的方法，所述方法包含施用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列之本發明免疫原性肽或其如上所述的衍生物的步驟。在本發明中，肽或其衍生物可通過體內或離體施用于受試者。另外，本發明還提供包含SEQIDNO:7所示序列的十肽TOM34的同源性分析顯示，它們與來源于任何已知人基因產物的肽均沒有顯著的同源性。這樣就降低了針對這些分子的免疫療法帶來未知或不希望的免疫反應的可能性。關于HLA抗原，使用在日本人中高度表達的A-24型有利于獲得有效結果，使用A-2402等亞型更為優選。典型地，在臨床上，事先考察需要治療的患者的HLA抗原型，這樣就能夠合適地選擇針對該抗原具有高水平結合親和力，或者具有通過抗原呈遞誘導細胞毒T細胞(CTL)能力的肽，另夕卜，為了獲得顯示高結合親和力和CTL誘導能力的肽，可以在天然存在的TOM34部分肽的氨基酸序列的基礎上取代或添加1、2、3、4或數個氨基酸。本文中，術語"數個"意思是5個或更少，或優選3個或更少。此外，除了天然被展示的肽之外，由于通過結合HLA抗原而一M示的肽的序列規則性是已^口的(Kubo，etal.，J.Immunol"152，3913，1994;Rammensee,etal.，Immunogenetics.41:178-228,1995;Kondo,etal"J.Immunol.155:4307-12，1995)，可以基于這種規則性對本發明的免疫原性肽進行修飾。例如，對于顯示高HLA-24結合親和力的肽，將它們從N末端起的第二個氨基酸取代為苯丙氨酸、酪氨酸、曱硫氨酸或色氨酸，而且C末端取代為苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸的肽也可有利地使用。但是，若肽序列與具有不同功能的內源或外源蛋白質的氨基酸序列的一部分相同，則可能會誘發副作用，例如針對特定物質的自身免疫障礙或變應性癥狀；因此，優選的是利用現有數據庫進行同源性搜索，以避免出現序列與另一蛋白質的氨基酸序列一致的情況。另外，如果根據同源性搜索得知即使1或2個氨基酸不同的肽亦不存在，則為了增加針對HLA抗原的結合親和性和/或增加CTL誘導能力而對上述氨基酸序列所作的修飾沒有造成此類問題的危險。雖然上述對HLA抗原具有高結合親和力的肽有望成為高度有效的癌癥疫苗，對于以高結合親和力的存在作為指標選出的候選肽，必須考察它們是否真實存在CTL誘導能力。CTL誘導能力的驗證如下進行誘導帶有人MHC抗原的抗原呈遞細胞(例如B淋巴細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞)，或更具體地說，來自人外周血單核白細胞的樹突狀細胞，用肽刺激后，與CD8陽性細胞混合，然后測定針對革巴細胞的細胞毒活性。作為反應系統，可以使用制備為表達人HLA抗原的轉基因動物(例如BenMohamedL.，etal.,Hum.Immunol.2000Aug.;61(8):764-79中描述的那些)。例如，可以用51Cr等放射性標記耙細胞，并根據耙細胞釋放的放射性計算細胞毒活性。或者，可以通過測定在攜帶有固定化肽的抗原呈遞細胞的存在下CTL產生并釋放的IFN-y,并利用抗IFN-y單克隆抗體使培養基上的抑制區域可見，來進行考察。如上所述考察肽CTL誘導能力的結果發現，具有針對HLA抗原的高結合親和力的肽不一定具有高的誘導能力。另外，包含KLRQEVKQNL(SEQIDNo.7)所示氨基酸序列的十肽顯示了特別高的CTL誘導能力。如上文提到的，本發明提供具有細胞毒T細胞誘導能力，并且包含其中取代或添加了1、2、3、4或數個氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列的肽。包含SEQIDNO:7中所示9個或10個氨基酸且其中取代或添加了1、2、3、4或數個氨基酸的氨基酸序列，優選不與其它蛋白質的氨基酸序列一致。尤其是，從N末端起第二個氨基酸取代為苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、曱硫氨酸(M)或色氨酸(W)的氨基酸取代，以及C末端氨基酸取代為苯丙氨酸(F)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、色氨酸(W)或曱硫氨酸(M)的氨基酸取代，以及N末端和/或C末端添加1到2個氨基酸的氨基酸添加是優選的例子。具體地，本發明提供一種十肽，其包含氨基酸序列KLRQEVKQNL(SEQIDNO:7),或K-[L,F,Y，M或W]-RQEVKQN-[L,F,L,I,W或M]。本發明的肽可以利用7>知的技術制備。例如，可以利用重組DNA^支術或化學合成來合成地制備所述肽。本發明的肽可以個別地合成，或者作為包含兩個或多個肽的較長多肽合成。所述肽優選是分離的，即，基本上不含其它天然存在的宿主細胞蛋白或其片段。肽可包含修飾諸如糖基化、側鏈氧化或磷酸化，只要這些修飾不破壞本文所述的這些肽的生物活性。其它修飾包括納入D-氨基酸或其它能夠使用的氨基酸才莫擬物，例如，以增加這些肽的血清半壽期。本發明的肽可以制備為包含2種或更多種本發明肽的組合，用作可以在體內誘導CTL的癌癥疫苗。所述肽可以作為合劑(cocktail)，或者使用標準技術相互偶聯。例如，所述肽可以作為單一多肽序列表達。組合中的肽可以是相同或不同的。通過施用本發明的肽，這些肽被以高密度呈遞于抗原呈遞細胞的HLA抗原，然后誘導出與被展示肽和HLA抗原所成的復合物特異性反應的CTL。或者，通過除去受試者中的樹突狀細胞，獲得了將本發明的肽固定化在其細胞表面上的抗原呈遞細胞，用本發明的肽刺激它們，將這些細胞再次施用給受試者以誘導受試者中的CTL，結果，可以增加針對耙細胞的攻擊性。更具體地，本發明提供治療腫瘤或預防肺瘤的增殖、轉移等等的藥物，其包括1種或更多種本發明的肽。本發明的肽可用于治療CRC。本發明的肽可以作為通過常規制劑方法配制的藥物組合物直接施用。在此情況下，除了本發明的肽以外，可以包括通常用于藥物的載體、賦形劑等等，視情況而定沒有具體限制。本發明的免疫原性組合物可用于治療和預防CRC。包含本發明的肽作為活性成分，用于治療和/或預防CRC的免疫原性組合物，可以包含佐劑以使細胞免疫得以有效地建立，或者它們可以與其它活性成分例如抗腫瘤劑一起施用，而且它們可通過配制為顆粒劑施用。可以使用的佐劑包括文獻中描述的那些(Johnson，Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289，1994)。示例性的佐劑包括，磷酸鋁、氫氧化鋁或明礬。另外，可以方便地使用脂質體制劑、其中藥物結合于數iim直徑小珠的顆粒制劑、和其中脂質結合于肽的制劑。施用方法可以是口服、皮內、皮下、靜脈內注射等等，全身施用或局部施用于靶腫瘤附近是可能的。本發明肽的劑量可以根據待治療的疾病、患者年齡、體重、施用方法等合適地調整，通常是0.001mg至)j1000mg,4尤選0.01mgf)100mg，更^t選0.1mg至))10mg,^f尤選數天到數月施用一次。本領域技術人員可以合適地選擇合適的劑量。或者，本發明提供名為外來體(exosome)的細胞內小泡，它們將本發明的肽和HLA抗原之間形成的復合物呈現在它們的表面上。外來體可以例如使用日本專利特表平11-510507號公報和特表2000-512160號公報中詳細記載的方法來制備，并且優選使用從作為治療和/或預防目標的受試者獲取的抗原呈遞細胞來制備。本發明的外來體可以與本發明的肽類似地作為癌癥疫苗接種。所用的HLA抗原類型必須與需要治療和/或預防的受試者的類型一致。例如，對于日本人，HLA-A24,尤其是HLA-A2402往往是合適的。在一些實施方案中，本發明的疫苗組合物包括刺激(prime)T淋巴細胞的組分。脂質已經被鑒定為能夠體外針對病毒抗原刺激CTL的作用物質。例如，可以將棕櫚酸殘基附接于賴氨酸殘基的s-和a-氨基上，然后與本發明的免疫原性肽連接。然后，脂質化的肽可以通過直接在膠束或顆粒中施用，摻入脂質體施用，或者在佐劑中乳化來施用。作為CTL應答的脂質刺激的另一個例子，大腸桿菌脂蛋白，諸如三棕櫚酰基-S-甘油半胱氨基絲氨基絲氨酸(tripalmitoyl-S-glycerylcysteinlyseryl-serine)(P3CSS),當共i"介附才矣于合適的肽時，可以用于刺激CTL(參見例如Deres,etal.,Nature342:561-4，1989)。酸。參見，例如，Wolffet.al.(1990)Science247:1465-1468;美國專利5,580,859;5,589,466;5,804,566;5,739,118;5,736,524;5,679,647;和WO98/04720。基于DNA的遞送技術的例子包括"棵(naked)DNA"，協助(布比卡因(bupivicaine;聚合物，肽介導的)遞送，陽離子脂質復合物，和顆粒介導的("基因槍")或壓力介導的遞送(參見，例如美國專利5，922,687)。本發明的免疫原性肽也可以由病毒或細菌載體來表達。表達載體的例子包括「減毒病毒宿主，-渚如痘苗病毒(vaccine)或禽痘病毒(fowlpox)。該途徑包括使用痘苗病毒，例如作為載體，來表達編碼肽的核苷酸序列。一旦導入宿主中，重組痘苗病毒表達該免疫原性肽，從而引發免疫應答。在免疫規程中有用的痘苗病毒載體和方法記載于，例如，美國專利4,722,848。另一種載體是BCG(卡介苗)。BCG載體記載于Stover,etal.(1991)Nature351:456-460。多種其它可用于治療性施用或免疫的載體，例如腺病毒和腺相關病毒載體，逆轉錄病毒載體，傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphi)載體，脫毒的炭疽毒素載體等等，是顯而易見的。參見例如Shata,etal.(2000)Mol.Med.Today6:66-71;Shedlock，etal.(2000)J.Leukoc,Biol.68:793-806;andHipp,etal.(2000)InVivo14:571-85。本發明還提供使用本發明的肽誘導抗原呈遞細胞的方法。抗原呈遞細胞可以如下誘導從外周血單核細胞誘導樹突狀細胞，然后使它們以體外、離體或體內方式接觸本發明的肽(刺激)。當將本發明的肽施用于受試者時，在受試者體內誘導出抗原呈遞細胞，本發明的肽固定于這些細胞。或者，將本發明的肽固定于抗原呈遞細胞后，可將這些細胞作為疫苗施用給受試者。例如，離體施用可包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細胞；和b:將步驟a的抗原呈遞細胞與肽接觸。步驟b獲得的抗原呈遞細胞可以作為疫苗施用給受試者。本發明還提供一種誘導具有高水平的細胞毒T細胞誘導能力的抗原呈遞細胞的方法，其中所述方法包括將包含編碼本發明肽的多核苷酸的基因體外轉移到抗原呈遞細胞的步驟。導入的基因可以是DNA或RNA的形式。關于導入方法，沒有特別限制，可以使用本領域常規使用的各種方法，例如脂質體轉染(lipofection)、電穿孔和磷酸鈣方法。更具體地，可以如Reeves,etal"CancerRes.，56:5672,1996;Butterfield,etal.，J.Immunol"161:5607，1998;Boczkowski，etal"J.Exp.Med"184:465,1996;日本專利特表2000-509281號公報所述的來進行。通過將基因轉入抗原呈遞細胞，基因在細胞中經過轉錄、翻譯等等，然后獲得的細胞被I類或II類MHC加工，并經過呈遞途徑而呈遞出部分肽。此外，本發明提供使用本發明的肽誘導CTL的方法。當對受試者使用本發明的肽時，在受試者體內誘導CTL，從而免疫系統針對腫瘤組織中CRC細胞的威力增強。或者，它們可以用于離體治療方法，其中使來源于受試者的抗原呈遞細胞、CD8陽性細胞或外周血單核白細胞在體外與本發明的肽接觸(刺激)，誘導CTL后，將細胞返回受試者。例如，所述方法可包括下列步驟a:從受試者收集抗原呈遞細胞；b:使步驟a的抗原呈遞細胞與肽接觸；c:使步驟b的抗原呈遞細胞與CD8+T細胞混合，并共培養以誘導細胞毒T細I包；和d:從步驟c的共培養物收集CD8+T細胞。步驟d所獲得的具有細胞毒活性的CD8+T細胞可以作為疫苗施用給受試者。相應地，本發明涉及這樣的CD8+T細胞，它們能夠識別由MHC分子例如HLA-24呈遞的本文所述的肽。此外，本發明還涉及呈遞本文所述的肽、包含HLA-24型I類MHC分子的細胞，例如APC。此外，本發明提供使用本發明的肽誘導的、分離的細胞毒T細胞。這些細胞毒T細胞是通過呈遞本發明的肽的抗原呈遞細胞刺激而誘導的，優選來源于作為治療和/或預防目標的受試者，并且可以單獨施用，或者與其它藥物，包括本發明的肽或外來體聯合施用，用于抗腫瘤目的。所得的細胞毒T細胞特異性作用于呈遞本發明的肽，或者優選地，與誘導所用相同的肽的靶細胞。靶細胞可以是內源表達TOM34的細胞，或者是轉染了TOM34基因的細胞，而且，由于被本發明的肽刺激而在細胞表面上呈現這些肽的細胞，也可以成為攻擊目標。本發明還提供包括HLA抗原和本發明肽之間所形成的復合物的呈遞的抗原呈遞細胞。通過使本發明的肽或者編碼本發明的肽的核苷酸接觸而獲得的抗原呈遞細胞，優選來源于作為治療和/或預防目標的受試者，并且可以作為疫苗單獨或者與包括本發明的肽、外來體或細胞毒T細胞在內的其它藥物組合施用。在本發明中，短語"疫苗"(又稱免疫原性組合物)是指這樣的物質，當它接種到動物中時，具有誘導抗腫瘤免疫或抑制CRC的免疫的功能。根據本發明我們提出，包括SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽可能是HLA-A24限制性表位肽，可能誘導產生針對表達TOM34的CRC細胞的特異性強免疫應答。因此，本發明還涵蓋一種誘導抗肺瘤免疫的方法，該方法使用包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的多肽。通常，抗腫瘤免疫包括例如下述免疫應答隱針對包含TOM34表達細胞的腫瘤的細胞毒淋巴細胞之誘導，-識別包含TOM34表達細胞之腫瘤的抗體之誘導，-抗胂瘤細胞因子產生之誘導。因此，若某一蛋白質在接種于動物中時誘導上述任何免疫應答，則判定該蛋白質具有誘導抗腫瘤免疫的效果。蛋白質對抗腫瘤免疫的誘導，可以通過體內或體外觀察宿主中免疫系統針對該蛋白質的應答來加以;險測。例如，細胞毒T淋巴細胞誘導的檢測方法是公知的。進入活體的外來物質通過抗原呈遞細胞(APC)的作用被呈遞給T細胞和B細胞。以抗原特異性方式對APC呈遞抗原起響應的T細胞由于抗原刺激而分化成細胞毒T細胞(或細胞毒T淋巴細胞；CTLs)，然后增殖(這稱為T細胞的活化)。因此，對于特定肽所致的CTL誘導，可以通過將所述肽經由APC呈遞于T細胞，然后檢測CTL的誘導來加以評估。另外，APC具有活化CD"T細胞、CD8+T細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞和天然殺傷細胞的作用。由于CD4+T細胞在抗腫瘤免疫中也是重要的，可以利用這些細胞的活化效果為指標來評估所述肽的抗腫瘤免疫誘導作用。使用樹突狀細胞(DC)作為APC以評價CTL誘導作用的方法是本領域公知的。DC是一種代表性的APC，在APC中具有最強的CTL誘導作用。在該方法中，首先使測試多肽接觸DC，然后使該DC與T細胞接觸。與DC接觸后^r測到具有針對感興趣細胞的細胞毒作用的T細胞，證明測試多肽具有誘導細胞毒T細胞的能力。CTL針對腫瘤的活性可以，例如，利用"Cr標記肺瘤細胞的裂解作為指標進行檢測。或者，使用&胸苷攝取活性或LDH(乳糖脫氫酶)-釋放作為指標，評估腫瘤細胞損傷程度的方法，也是公知的。除了DC，外周血單核細胞(PBMC)也可以用作APC。據報道，在GM-CSF和IL-4存在的條件下培養PBMC可增強CTL的誘導。類似地，已經證明，通過在鑰孔血藍蛋白(KLH)和IL-7存在下培養PBMC可誘導CTL。通過這些方法確認為具有CTL誘導活性的測試多肽，是具有DC活化效應及隨后的CTL誘導活性的多肽。因此，誘導針對腫瘤細胞的CTL的多肽可用作抗CRC的疫苗。而且，通過接觸這些多肽而獲得誘導抗CRC性CTL的能力的APC可用作抗CRC的疫苗。進一步，由于APC呈遞所述多肽抗原而獲得細胞毒性的CTL也可用作抗CRC疫苗。利用APC和CTL所致抗腫瘤免疫的此類CRC治療方法稱為細胞免疫療法。通常，當細胞免疫療法使用多肽時，已知通過組合多種具有不同結構的多肽，并使它們與DC接觸，CTL誘導的效率會增加。因此，當用蛋白片段刺激DC時，使用多種類型的片段的混合物是有利的。或者，多肽對抗腫瘤免疫的誘導可以通過觀察針對腫瘤的抗體產生的誘導來確認。例如，當用多肽免疫的實驗動物中誘導產生抗該多肽的抗體,并且這些抗體抑制胂瘤細胞生長、增殖或轉移時，所述多肽可確定為具有誘導抗腫瘤免疫的能力。施用本發明的疫苗誘導抗腫瘤免疫，而該抗腫瘤免疫的誘導使治療和預防CRC成為可能。針對CRC的治療或預防可以包括任何下述步驟諸如CRC細胞生長的抑制，CRC細胞的退縮(involution)以及CRC細胞發生的抑制。CRC的治療或預防的效果還包括患CRC個體的死亡率降低、血液中CRC標志減少、CRC伴發的可檢測癥狀的緩解等。所述治療性和預防性效果優選是統計學上顯著的。例如，在觀察中顯著性水平為5%或更低，在行比較。例如，可將Student'st-檢驗，Mann-WhitneyU-檢驗或ANOVA用于統計學分析。上述有免疫活性的蛋白或編碼該蛋白的多核苷酸或載體可與佐劑組合。佐劑是指當與具有免疫活性的蛋白共同(或相繼)施用時增強針對該蛋白的免疫應答的化合物。例示性的佐劑包括但不限于霍亂毒素(choleratoxin)、沙門氏菌毒素(salmonellatoxin)、明鞏(alum)等。此外，本發明的疫苗可適宜地與藥物可接受的載體組合。這樣的載體的例子有無菌水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、培養液等。此外，疫苗可根據需要包含穩定劑，懸浮劑(suspensions),防腐劑，表面活性劑等。疫苗全身或局部地進行施用。疫苗施用可以通過單次給藥進行，或者通過多次給藥來強化(boost)。當使用APC或CTL作為本發明的疫苗時，可以例如通過離體(exvivo)方法治療或預防CRC。更具體地，收集接受治療或預防療法的受試者的PBMC，使細胞與多肽在離體條件下接觸，誘導APC或CTL，然后可將該細胞施用于受試者。也可通過將編碼多肽的載體在離體條件下導入PBMC中來誘導APC。體外誘導的APC或CTL可以在施用前進行克隆。通過克隆和培養具有高靶細胞破壞活性的細胞，可以更有效地實施細胞免疫治療。此外，以該方式分離的APC和CTL不僅可以用于針對提供細胞的受試者進行細胞免疫治療，還可以用于針對來自其它個體的相似類型的腫瘤進行細胞免疫治療。用于抑制CRC的藥物組合物在本發明的背景下，適宜的藥物制劑包括適于口服、直腸、鼻、局部(包括口腔或舌下)、陰道或非消化道(包括肌內、皮下和靜脈內)施用的制劑，或用于通過吸入或吹入(insufflation)施用的制劑。優選靜脈內施用。制劑可以任選包裝在離散的劑量單位(dosageunit)中。適于口服施用的藥物制劑包括膠嚢劑、扁嚢劑(cachet)或片劑，它們各自含有一定量的活性成分。適合的制劑還包括粉末、顆粒、溶液、懸浮液和乳液。活性成分任選以大丸藥糖劑(boluselectuary)或糊劑(paste)的形式施用。用于口服給藥的片劑和膠嚢劑可含有常規賦形劑諸如粘合劑、填充劑、潤滑劑、崩解劑或濕潤劑。片劑可通過壓縮或成型來制備，任選與一種或多種配方成分壓縮或成型。壓縮片劑可通過如下方法制備將自由流動形式的活性成分，如粉末或顆粒，任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、潤滑劑、表面活性劑和/或分散劑混合，在適當的機器中進行壓縮。成型片劑可通過如下方法制備在適當的機器中對利用惰性液體稀釋劑濕潤的粉末化合物的混合物進行成型。所述片劑可根據本領域公知的方法進行包衣(coated)。口服液體制備物可以是例如水性或油性的懸濁液、溶液、乳液、糖漿或酏劑的形式；或者也可以作為干燥產物提供，在使用前用水或其它適宜溶媒來構成。所述液體制備物可含有常規添加劑諸如懸浮劑，乳化劑，非水性溶媒(可包括食用油)和/或防腐劑。片劑可任選地配制以提供其中活性成分的緩釋或控釋。片劑的包裝中可以包含每月服用的一片藥物。適于非消化道施用的制劑包括水性和非水性的無菌注射溶液，其中任選地含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑(bacteriostat)和使得制劑與預期接受者的血液等張(isotonic)的溶質；以及水性和非水性的無菌懸浮液，其中含有懸浮劑和/或增稠劑。所述制劑可以提供為單位劑量或多次劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶；還可以在冷凍-干燥(凍干的)條件下保存，僅需要在即將使用前添加無菌液體載體例如鹽水、注射用水。或者，可提供所述制劑用于連續輸注(continuousinfusion)。可以/人前述的無菌4分末、顆粒及片劑的類型制備即配即用的注射溶液和懸浮液。適于直腸給藥的制劑包括含有標準載體如可可脂或聚乙二醇的栓劑(suppository)。適于口內局部給藥，例如口腔或舌下給藥的制劑包括錠劑(lozenge)和軟錠劑(pastille),其中錠劑在調味基質，如蔗糖和阿拉伯膠(acacia)或黃蓍膠中包含活性成分，而軟錠劑在基質，如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含活性成分。鼻內給藥時，本發明的化合物可以用作液體噴霧劑、可分散粉末，或以滴鼻劑(drops)的形式。滴鼻劑可用水性或非水性基質配制，該基質中也含有一種或多種分散劑、增溶劑和/或懸浮劑。吸入給藥時，可以由吹入器、霧化器、加壓包裝(pressurizedpack)或其它便利的氣溶膠噴霧遞送裝置方便地遞送化合物。氣溶膠包裝可含有適宜的噴射劑，如二氯二氟曱烷、三氯氟曱烷，二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它適宜氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供輸送計量量(meteredamount)的閥門來確定劑量單位。或者，通過吸入或吹入給藥時，化合物可以采取干粉組合物的形式，例如該化合物與適宜粉末基質(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以提供為單位劑型，例如作為膠嚢、藥筒(cartridge)、凝膠(gelatin)或發泡包(blisterpack)，借助吸入器或吹入器，可由上述劑型施用所述粉末。其它的制劑包含可釋放治療劑的可植入裝置及粘性貼片(adhesivepatches)。需要時，可以采用適于活性成分緩釋的上述制劑。藥物組合物中還可以含有其它活性成分，諸如抗微生物劑，免疫抑制劑和/或防腐劑。應當理解，除了上面具體提到的成分外，本發明的制劑可包括對于所討論的制劑類型而言其它本領域常規的藥劑。例如，適用于口服施用的制劑可包括調味劑。優選的單位劑量制劑含有如下所述有效劑量的活性成分，或有效劑量的適當部分的活性成分。對于前述的各種情況，所述組合物，例如肽和有機化合物，可以在每天約0.1-約250mg/kg的劑量范圍內口服或通過注射施用。成人的劑量范圍通常為約5mg-約17.5g/天，優選為約5mg-約10g/天，更優選為約100mg-約3g/天。片劑或其它以分散單元提供的單位劑型可適宜地含有這樣的量，該量在該劑量條件下為有效量，或者在多個該劑量條件下為有效量；例如，單位劑型含有約5mg-約500mg,通常為約100mg-約500mg的單位。所用劑量將依賴于多種因素，包括受試者的年齡和性別，治療的確切疾患及其嚴重程度。此外，給藥途徑也依賴于病癥及其嚴重程度而變化。然而無論怎樣，本領域技術人員都能在考慮上述因素的基礎上常規地計算出合適的最佳劑量。下面的實施例描述了本發明的方面，它們并不意在限制權利要求所述的本發明的范圍。下面的實施例例示了在CRC細胞中差異表達的基因的鑒定和表4i。實施例細胞系和臨床材料人結腸癌細胞系HCT116和RKO獲自美國典型培養物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville,MD)。所有這些細胞均在合適的培養基中單層培養，即McCoys5A(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于HCT116;RPMI1640(Sigma-AldrichCorporation,St.Louis，MO)用于RKO,培養基i勻添力口了100/o月臺牛血;青(CanseraInternationalInc.,Ontario,Canada)和1。/o抗生素/抗真菌劑溶液(Sigma-Rich)。將細胞維持在37。C、5%<^02的加濕氣氛下。癌性組織和相應的非癌性粘膜是從12名患者獲得知情同意后于手術中切除的。人B-類淋巴母細胞系TISI細胞(HLA-A24/24)和EHM(HLA-A3/3)由TakaraShuzoCo,Ltd.(Otsu，Japan)惠贈。將TISI細胞用于肽介導的細胞毒性測定。結腸直腸癌細胞系DLD-1(HLA-A24/02)、HT29(HLA-A24/01)和SNU-C2A(HLA-A31/26)購自ATCC。慢性髓性白血病細胞系K562購自ATCC。半定量RT-PCR使用TRIZOL試劑(Invitrogen)根據制造商的規程從培養細胞或臨床組織中提取總RNA。用DNA酶I(RocheDiagnostics,Mannheim,Germany)處理提取的RNA，然后利用oligo(dT)12_18引物和SuperscriptII逆轉錄酶(Invitrogen)逆轉錄成單鏈cDNA。我們通過監測<^4戶￡>//基因作為定量對照，序列為5，-ACAACAGCCTCAAGATCATCAG-3，(SEQIDNO;41)和5，-GGTCCACCACTGACACGTTG-3，(SEQIDNO;42)用于04尸D7/;5，-TGGTATAAACCTAAGGCCCTGAT-3，(SEQIDNO;43)和5，-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)用于TOM34。在所有擴增反應前先用94"預先熱變性2min，然后再進行18個(對于GL4尸D^)或29個(對7PM3力如下的擴增循環94°C30秒，6(TC30秒，和72。C30秒；反應在GeneAmpPCR系統9700(PEAppliedBiosystems，Foster,CA)上進行。Northern印跡將人多組織印跡(BDBioscience,PaloAlto，CA)與32P標記的PCR產物雜交。探針是使用引物組5，-GAACGTGAAGGCATTCTACAGA-3，(SEQIDNO;45)和5'-TAAACAGCTTAGGTGCCTCTCTG-3，(SEQIDNO;44)進4亍RT-PCR，然后用Mega標記試劑盒(AmershamBiosciences,Buckinghamshire,UnitedKingdom)用32P-dCTP進行隨機寡核苦酸標記而制備的。預雜交、雜交和清洗根據供應商的建議進行。用增感屏將印跡在-80。C放射自顯影10天。抗TOM34多克隆抗體的制備使用下列引物組5，-CATAAGCTTGCATGGCCCCCAAATTCCCA-3，(SEQIDNO;58)和5，-GTTAAGCTTTTAGTGTAGGTTCT-3，，(SEQIDNO;59)擴增TOM34的整個編碼區域，然后將其克隆到pET28載體(Novagen,Madison,WI)的合適克隆位點中以生成表達His-標簽TOM34蛋白的質粒。在大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21-CodonPlus(DE3)-RIL菌抹(Stratagene，LaJolla,CA)中表達重組蛋白，并使用TALONSuperflowMetalAffinityResin(BDBioscience)根據制造商的規程加以純化。將蛋白接種到兔中，然后根據標準方法在親和柱上純化免疫血清。使用含有50mMTris-HCl(pH7.5)、250mMNaCl、0.1%SDS和0,5%NP40，以及蛋白酶抑制劑合劑組III(ProteaseInhibitorCocktailSetIII)(CALBIOCHEM,LaJolla,CA)的0.1%RIPA樣緩沖液(RIPAlikebuffer)從細胞提取蛋白質，使用該蛋白質進行Western印跡分析。免疫組織化學使用親和純化的抗人TOM34多克隆抗體進行免疫組織化學染色。通過將載玻片在0.01M檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中108。C高壓蒸汽預處理10分鐘從脫石蠟并復水的組織中修復(retrieve)抗原，然后將石蠟包埋的組織切片用于SAB-PO過氧化物酶免疫染色系統(Nichirei，Tokyo,Japan)構建表達針對TOM34的siRNA的psiU6BX根據先前的記載(W02004/076623)，將雙鏈寡核苷酸克隆到psiU6BX3.0載體的SfoI位點中來制備siRNA表達載體。配對的寡核苷酸的序列為5,-CACCGAAAGTGTTCTCTACTCCATTCAAGAGATGGAGTAGAGAACACTTTC-3，(SEQIDNO;46)和5'誦AAAAGAAAGTGTTCTCTACTCCATCTCTTGAATGGAGTAGAGAACACTTTC陽3，(SEQIDNO;47)用于siD;5，-CACCGGATGGAAACTGCAGAGACTTCAAGAGAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;50)和5,-AAAAGGATGGAAACTGCAGAGACTCTCTTGAAGTCTCTGCAGTTTCCATCC-3，(SEQIDNO;51)用于siE。用T4多核香酸激酶磷酸化后，將配對的寡核苷酸煮沸5min,然后通過緩慢冷卻退火產生雙鏈寡核苷酸。使用由下述序列組成的寡核苷酸制備對照質粒psiU6BX-EGFP。各核苷酸序列、siRNA靶序列和SEQIDNO均示于表l。5'畫CACCGAAGCAGCACGACTTCTTCTTCAAGAGAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;54)和5，-AAAAGAAGCAGCACGACTTCTTCTCTCTTGAAGAAGAAGTCGTGCTGCTTC-3，(SEQIDNO;55)。為了考察TOM34-siRNA的效果，轉染質粒5天后使用抗TOM34抗體進行Western印跡分析。表1插入siRNA表達載體的特異性雙鏈寡核苷酸的序列及各個siRNA的靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>集落形成測定使用FuGENE6試劑(RocheDiagnostics),用表達TOM34-si認A的質粒瞬間轉染鋪在10-cm培養亞(4x105個細胞/皿)上的HCT116細胞，并將細胞維持在含10%胎牛血清和800[ig/ml遺傳霉素的培養基中兩周。將生存下來的細胞用100%曱醇固定并用Giemsa溶液染色。在另一個實-驗中，用細胞計數試劑盒(DOJINDO，kumamoto，Japan)測量活細胞數。統計分析使用可商購的軟件(Statview;SASInstitute,Caiy，NC),通過ScheffesF檢驗的ANOVA分析統計顯著性。TOM34由來的肽通過結合子貞測軟件(http://bimas.dcrLnih.gov/cgi-biri/molbio/ken_paiker—combofoim)(ParkerKC,et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75),對可結合HLA-A24分子的、TOM34肽序列由來的9聚體和10聚體肽進行預測(ParkerKC，et.al.,JImmunol.1994;152(l):163-75)。這些肽由Mimotopes,SanDiego，CA根據標準固相合成方法合成，并通過反相HPLC純化。肽的純度(>90%)和同一性分別通過分析型HPLC和質譜分析來確定。將肽以20mg/ml溶解在二甲亞砜(DMSO)中并保存在-80。C。體外CTL誘導導針對呈遞于HLA上的肽的CTL。如他處所述體外生成DC(NukayaI，etal.,IntJCancer.1999;80(l):92-7;TsaiV，改aL，JImmunol.1997;158(4):1796"802)。簡單地說，從正常志愿者(HLA-A24)中用Ficoll-Paque(Pharmacia)溶液分離出外周血單核細胞(PMBCs)，并通過附著于塑料組織培養瓶(BectonDickinson)力口以分離，以富集它們的單核細胞級分。將富集了單核細胞的群體在含2%的熱滅活自身血清(AS)的AIM畫V(Invitrogen)中、在l，OOOU/ml的GM畫CSF(KirinBreweryCompany提供)和1,000U/mlIL-4(Genzyme)存在下培養。培養7天后，在AIM-V中，20°C，以4小時時間，于3嗎/ml(32-微球蛋白存在的條件下，使產生細胞因子的DC負載20pg/ml的HLA-A24-結合肽。然后照射這些負載了肽的DC(5，500rad),并以l:20的比例與自身CD8+T細胞混合，其中CD8+T細胞是用DynabeadsM-450CD8(Dynal)和Detachabead(Dynal)陽性選擇獲得的。進一步將該混合物分份，將等份在48孔平板(Corning)中溫育；每個孔在0.5ml含10ng/mlIL-7(Genzyme)的AIM-V/2%AS中含有1.5xl04個負載了肽的DC和3xl()5個CD8+T細胞。3天后，向這些培養物補充IL-2(CHIRON)到終濃度為20IU/ml。在第7天和第14天，進一步用負載了自身肽的DC來再刺激T細胞。每次用上述相同的方法制備DC。在21天的第3輪肽刺激后，測試了針對負載肽的TISI細胞的細胞毒性。CTL擴大培養程序使用與Riddell，etal.(Walteretal，NEnglJMed333:1038-1044,(1995)，Riddeletal,NatureMed.2:216-223，(1996))所述的方法類似的方法，在培養物中擴大培養CTL。在40ng/ml抗CD3單克隆抗體(Pharmingen)的存在下，將總數5x104個CTL重懸在25ml含有25x106個被照射(3，300rad)的PBMC和5x106個被照射(8,000rad)的EHM細胞的AIM-V/5%AS中。在培養開始后l天，向培養物中加入120IU/ml的IL-2。在第5、8和11天向培養物中添加含30IU/mlIL-2的新鮮AIM-V/5%AS。CTL克隆的建立將擴大培養后的CTL培養物稀釋，并將細胞分配到96孔圓底微量滴定板(NalgeNuncInternational)的孔中，將細胞數調節為0.3、1和3個CTL/孔。然后將CTL與7xl()4個細胞/孔的同種異型PBMC、1x1C)4個細胞/孔的EHM、30ng/ml的抗CD3抗體及125U/ml的IL-2在總共150pl/孔的含5%AS的AIM-V中培養。10天后向培養基中加入50pl/孔的IL-2,使得IL-2的終濃度成為125U/ml。在第14天測試CTL的細胞毒活性，并使用與上述相同的方法擴大培養CTL克隆。細胞毒性測定在C02培養箱中37。C條件下、用100pCi的Na^Cr04(PerkinElmerLifeSciences)標記靶細胞1小時。在標記前，通過將細胞與20嗎/ml的肽在37。C共溫育16小時來制備負載肽的耙細胞。漂洗標記的靶細胞，并在圓底微量滴定板中以0.2ml的終體積與效應細胞混合。將平板離心(800xg，4分鐘)以增加細胞對細胞的接觸，并放置在37。C的C02培養箱中。溫育4小時后，從每個孔收集0.1ml上清液，使用y計數器(gammacounter)確定放射性。在評價針對內源表達TOM34的靶細胞的細胞毒性的場合，在30倍過量的未標記K562細胞存在下測定細胞溶解活性，其排除任何由NK類效應物所致的非特異性裂解。通過非放射性靶抑制測定(coldtargetinhibitionassay)確證抗原特異性，該測定使用負載有抗原肽(37。C、20(ig/ml,16小時)的未標記TISI細胞來竟爭"Cr-標記HT29腫瘤細胞的識別。特異性細胞毒性的百分比是通過下式計算特異性51Cr釋放的百分比而求出的{(測試樣品釋放的cpm-自發釋放的cpm)/(最大釋放的cpm-自發釋放的cpm)}x100。自發釋^L通過在沒有效應細胞存在下單獨溫育靶細胞來確定，最大釋放通過將靶與1NHC1共溫育而獲得。所有的測量均一式二份進行，其平均的標準偏差一直低于平均值的10%。結果CRC中roM^的表達上升在我們更早的研究中，我們使用由23040種基因構成的cDNA微陣列對11例CRC和9例結腸腺癌進行了全基因組表達模式分析，從而鑒定了多種在結腸肺瘤中表達水平頻繁變化的基因。在表達水平在11例癌(carcinoma)中頻繁上調的基因中，我們在本發明中著眼于一種內部標識號為D3124的基因，它對應于rOM34(GeneBanck登錄號AB085681,SEQIDNO;60,61)(線粒體外膜的34kDa移位酶)。隨后的半定量RT-PCR分析揭示，它在所檢查的20個CRC臨床樣品里的16個中表達增強(圖1A)。另外，在我們的cDNA微陣列數據中，r(9M34在所有8例肝細胞癌、19例肺癌中的5例、9例膀胱癌中的3例、27例急性髓性白血病中的7例、以及49例軟組織肉瘤中的9例中也有顯著上調。為了考察它在人類正常組織中的表達，我們使用r(9M54cDNA作為探針進行了多組織Northern印跡分析。結果，分析顯示了一種大小約2.0kb的轉錄物，它在睪丸和卵巢中大量表達，在前列腺、脾和結腸中弱表達，而在其它11個被一企組織中則均不表達(圖1B)。結腸直腸癌細胞系和CRC組織中TOM34蛋白質的積累我們制備了抗TOM34多克隆抗體，并通過免疫組織化學染色考察了TOM34蛋白在8個CRC細胞系和12個CRC組織中的表達。免疫印跡分析檢測到了在全部被檢CRC細胞系中均大量表達的34kDaTOM34條帶。另一方面，在兩種非癌性細胞系MH3T3和COS7中，顯示較低的表達水平(圖2B)。使用16例CRC及相應的非癌性粘膜組織進行Western印跡分析，證實了它在16個腫瘤的15個中相比于正常粘膜表達增強(圖2A)。為了考察TOM34的亞細胞定位，我們用HCT116和RKO細胞以抗TOM34抗體進行了免疫細胞化學染色，結果顯示該蛋白的細胞質定位。此外，我們使用12個石蠟包埋的結腸癌組織進行了免疫組織化學染色。在這12例腫瘤中的11例中，TOM34在癌性細胞的細胞質中被強染色，而其在非癌性粘膜中幾乎不S皮染色(圖3)。TOM34-siRNA對結腸癌細胞生長的影響為了闡明TOM34在癌細胞中的作用，我們制備了表達針對TOM34的siRNA的質粒，并考察了它們對癌細胞生長的影響。我們制備了兩種形式的表達設計為抑制TOM34的siRNA的質粒(psiU6BX-TOM34-siD和-s正)，以及一種對照質粒(psiU6BX-s正GFP)。我們用psiU6BX-TOM34-siD、psiU6BX-TOM34-siE或psiU6BX-siEGFP轉染了HCT116細胞。針對被轉染細胞之提取物的Western印跡分析顯示，與psiU6BX-s正GFP相比，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX-TOM34-s正顯著地抑制了被轉染細胞中TOM34的表達(圖4A)。我們將共表達新霉素抗性基因的質粒轉染到HCT116細胞中，并用合適濃度的遺傳霉素培養它們13天。與TOM34的表達下降相一致，psiU6BX-TOM34-siD和psiU6BX畫TOM34陽siE相比于psiU6BX-s氾GFP均明顯地延遲了被轉染細胞的生長(圖4B)。這些數據表明，TOM34的表達是與癌細胞的生長相關的。TOM34由來的HLA-A24結合肽的預測表2和3按高結合親和力的順序顯示了預測為抗原的肽。選擇了20個10聚體肽(表2)和20個9聚體肽(表3)作為抗原，并如下文所述進行了考察。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>使用預測的肽刺激T細胞按照"材料與方法"中描述的方式產生了識別TOM34由來的肽的細胞毒T細胞。將所得具有可檢測的細胞毒活性的CTL擴大培養，并且建立了CTL系(CTLlines),這些CTL系針對負載肽的靶比針對沒有用肽短暫刺激(pulse)的靶顯示更高的細胞毒活性。用10聚體肽TOM34-299(KLRQEVKQNL(SEQIDNO;7))刺激過的CTL系針對負載肽的靶顯示很強的細胞毒活性，而對未負載肽的靶則不顯示任何顯著的細胞毒活性(圖5)。這些CTL系顯示強力且抗原特異性的細胞毒性，在低達1.2的E/T比仍可檢測到(圖6)。CTL克隆的建立如"材料和方法"中所述，對CTL系培養物進行有限稀釋，然后擴大培養，建立了CTL的克隆。這樣得到的TOM34-299特異性CTL克隆包括具有極高細胞裂解活性的克隆，克隆全體的活性在1.2的E/T比為20%到70%的裂解，在10的E/T比為40%到>90%的裂解(圖7)。以內源表達TOM34的結腸癌細胞系為耙的細胞毒活性對于TOM34-299肽激發產生的CTL克隆，考察了它們識別并殺死內源表達TOM34的腫瘤細胞的能力。圖8顯示了TOM34-299肽激發產生的兩種CTL克隆所得的結果。這兩種CTL克隆對于表達TOM34及HLA-A24的結腸癌細胞系DLD-1和HT29均顯示強的細胞毒活性。另一方面，這兩種CTL克隆對表達TOM34而不表達HLA-A24的SNU-C2A結腸癌細胞系均不顯示任何相關的細胞毒活性(圖8)。非放射性乾抑制測定進行了非放射性靶抑制測定來確證CTL系的特異性。使用"Cr標記的HT29細胞作為放射性靶(hottarget),將不進行51Cr標記的負載或不負載肽的TISI細胞作為非放射性靶(coldtarget)。當以不同比例向測定中加入負載肽的非放射性靶細胞時，針對靶HT29細胞的特異性細胞裂解被顯著抑制，但加入未負載肽的非放射性耙細胞時，針對靶HT29細胞的特異性細胞裂解則完全不被抑制。該結果作為效應物/放射性靶比為20時特異性裂解的百分比顯示(圖9)。抗原肽的同源性分析針對TOM34-299建立的CTL克隆顯示了非常強的細胞毒活性。這可能說明該肽的序列與來源于已知可致敏(sensitize)人免疫系統的其它分子的那些肽具有同源性。為了排除這種可能性，以肽序列作為查詢項，使用BLAST算^r(http:〃www.ncbi.nlm,nih.gov/blast/blast.cgi)(AltschulSF,etal.，NucleicAcidsRes,1997;25(17):3389-402.;AltschulSF，etal"JMolBiol.1990;215(3):403-10)進行同源性分析，結果未顯示具有顯著同源性的序列。這說明TOM34-299的序列是獨特的，而且就我們所知，激發針對任何無關分子的非期望免疫反應的可能性極低。結合T細胞表面抗原的抗體所致的CTL活性阻斷為了確認觀察到的殺傷活性是否由細胞毒T細胞所介導，使用中和CTL活性相關T細胞表面抗原的功能的抗體考察了抗體對該殺傷活性的作用。添加識別I類HLA或CD8的抗體明顯阻斷了CTL活性，而添加針對II類HLA或CD4的抗體也以較前者為低的程度阻斷了CTL活性，如圖10所示。該結果證明，針對HT29結腸直腸癌細胞觀察到的T細胞克隆的細胞毒活性，是HLA限制性的CD8陽性T細胞殺傷活性。討論在本發明中我們證明，TOM34在CRC中頻繁上調；它在正常睪丸及卵巢中大量表達，在前列腺、脾和結腸中微量表達，但在所檢查的其它正常成人組織中幾乎未檢測到。有希望的治療手段之一是癌癥免疫療法，其包括T細胞介導的抗肺瘤免疫接種。通過識別由主要組織相容性復合物(MHC)分子呈遞的肽抗原，CD"細胞毒T淋巴細胞以展示抗原的細胞為靶標。由于腫瘤組織源于非癌性自身細胞，大多數腫瘤細胞逃脫免疫監視。為了應用癌癥免疫治療，鑒定在癌細胞中特異表達的抗原是非常重要的。抗原不在睪丸中表達，因為缺少I類MHC分子(JassimA,etal.,EurJImmunol19:1215-1220,1989)。所以，在癌癥和睪丸中特異性表達的基因應是免疫治療的靶標。由于TOM34在除睪丸和卵巢之外的正常器官中不大量表達，并且在大多數結腸癌中上調，因此TOM34可能作為新的癌-睪丸抗原起到CRC治療靶標的作用。最初認為TOM34作為將蛋白質輸入線粒體的移位酶的組分起作用，因為該蛋白與酵母Tom蛋白顯示序列同源性(NuttallSD，etal.,DNACellBiol16:1067-1074,1997)。盡管曾預測TOM34定位于線粒體外膜中，新近一項研究揭示其包含在Hela細胞的胞漿中(Chun-SongY&HenryW,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:105-110，2002;AbhijitM，etal,,ArchivesofBiochemistryandBiophysics400:97-104，2002)。與該數據一致的是，我們使用抗TOM34多克隆抗體進行免疫組織化學染色發現，TOM34在CRC細胞中的亞細胞定位是細胞質。在另一項報道中，使用酵母雙雜交系統的篩選將含纈酪肽蛋白(VCP)和hsp90鑒定為TOM34相互作用蛋白。VCP是一種AAA(與多種細胞活性相關的ATP酶)家族成員，又稱p97;它與遍在蛋白化的IkB(x和26S蛋白酶體的亞基形成復合物，提示VCP可能通過降解IkBoi而參與轉錄因子NFicB向細胞核的移位(DaiRM，etal.,JBiolChem273:3562-3573,1998)。HSP90是一種分子伴侶，許多分子的穩定性和功能都需要它的相互作用。因此，TOM34可能通過與HSP90結合而穩定化。由于HSP90與致癌性分子例如Rafl、AKT和SMYD3結合，已經開發了若干種HSP90抑制劑來治療人類癌癥。人們估計這些抑制劑會阻礙正常的功能性HSP90，從而造成嚴重的不良作用，因為HSP90在大多數正常組織中是普遍表達的。總之，TOM34在CRC中上調，但在除睪丸和卵巢之外的正常器官中幾乎不表達。因此，抑制TOM34很可能不會對正常細胞帶來不良影響。另夕卜，抑制TOM34導致癌細胞的細胞生長被抑制，這提示TOM34在它們的生長中起關鍵作用。這些數據暗示，TOM34是人結腸直腸癌的免疫療法及抗癌藥開發的有希望的靶標。另外，誘導強力和特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定，保證了各種癌癥類型中肽疫苗接種策略的臨床應用的進一步發展(BoonT&vanderBruggenP,JExpMed.1996;183(3):725-9，vanderBruggenP，etal"Science.1991;254(5038):1643-7.,BrichardV，etal.,JExpMed.1993;178(2):489-95.,KawakamiY,etal.,JExpMed.1994;180(l):347-52.，ShichijoS，etal"JExpMed.1998;187(3):277畫88,ChenYT，etal"ProcNatlAcadSciUSA.1997;94(5):1914-8.，HarrisCC.,JNatlCancerInst.1996;88(20):1442-55"ButterfieldLH，etal.，CancerRes.1999;59(13):3134畫42.,VissersJL,etal.,CancerRes.1999;59(21):5554隱9.,vanderBurgSH,etal.,JImmunol.1996;156(9):3308-14.，TanakaF，etal.,CancerRes.1997;57(20):4465-8.,FujieT,etal.,IntJCancer.1999;80(2):169-72.,KikuchiM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):459-66.，OisoM,etal.，IntJCancer.1999;81(3):387-94.)。我們分析了作為HLA-A24限制性TAA表位的、來源于TOM34的肽，其中HLA-A24是日本人以及白人人群中常見的HLA等位基因之一(DateY，etal"TissueAntigens,1996;47:93-101.,KondoA,etal"JImmunol,1995;155:4307-12，KuboRT,etal.，JImmunol,1994;152:3913-24)。在本發明中，我們利用來自TOM34的HLA-A24限制性表位肽的候選物與HLA-A24的預測的結合親和力，對它們進行了選擇。用負載有這些候選肽的DC體外刺激T細胞之后，使用TOM34-299肽(KLRQEVKQNL)(SEQIDNO;"成功地建立了針對負載肽的TISI細胞顯示強細胞毒活性的CTL。另外，來源于這些CTL的CTL克隆也顯示了針對內源過高表達TOM34的HLA-A24陽性結腸直腸癌細胞系的特異性細胞毒性。這些CTL克隆的細胞毒活性對于缺少HLA-24或耙TAA表達的細胞系不顯示，而且被非放射性靶顯著地抑制。這些結果強烈地提示TOM34是一種新的結腸癌TAA,而且TOM34-299是這種TAA的HLA-A24限制性特異表位肽。由于這種抗原在大多數結腸癌病例中過高表達并且與腫瘤細胞增殖相關，它似乎是一種可用于結腸癌免疫療法的極好靶標。TOM34-299的同源性分析顯示它與來自任何已知人基因產物的肽均無顯著的同源性。工業應用性本文描述了通過激光捕獲解剖和全基因組cDNA^f效陣列的組合獲得的結腸癌基因表達分析，該分析鑒定了用于癌癥預防和治療的靶標的特異性基因。根據這些差異表達的基因中的一部分的表達，本發明提供了用于鑒定和檢測CRC的分子診斷標志物。本文所描述的方法還可用于鑒定其它分子靶標，用于CRC的預防、診斷和治療。本文報道的數據增加了人們對CRC的全面理解，方便了新診斷策略的開發，并且為鑒定治療劑和預防物質的分子靶標提供了線索。這些信息為深化對于結腸腫瘤發生的認識作出了貢獻，并為診斷、治療及最終預防CRC的新策略的開發提供了指標。例如，阻斷TOM34表達或者阻止起活性的作用物質具有作為抗癌劑，尤其是用于治療CRC的抗癌劑的治療效用。這樣的作用物質的例子包括針對rOMW基因的反義寡核苷酸、小干擾RNA和核酶，以及識別TOM34的抗體。或者，誘導強力和特異性的抗腫瘤免疫應答的新TAA的鑒定，為各種癌癥類型中肽疫苗接種策略的臨床應用的進一步發展提供了保證。另外，盡管已經詳細地并且參考本發明的具體實施方案描述了本發明，但可理解的是上述說明書實際上是例示性和解釋性的，意欲闡明本發明及其優選實施方案。通過常規的實驗，本領域技術人員將容易地認識到，可對本發明進行各種變化和修飾而不背離本發明的精神和范圍。因此，本發明并不意欲受到上述說明的限定，而由如下權利要求及其等同物限定。權利要求1.一種診斷受試者中結腸癌或發生結腸癌的傾向性的方法，包括確定來源于患者的生物樣品中TOM34的表達水平，其中與該基因正常對照水平相比，所述樣品中表達水平的增加表明該受試者患有結腸癌或具有發生結腸癌的風險。2.權利要求1的方法，其中所述樣品表達水平比所述正常對照水平高至少10%。3.權利要求1的方法，其中基因表達水平通過選自下組的方法確定a)才企測TOM34的mRNA,b)檢測TOM34編碼的蛋白質，和c)檢測TOM34的生物活性。4.權利要求1的方法，其中所述來源于患者的生物樣品包括上皮細胞。5.權利要求1的方法，其中所述來源于患者的生物樣品包括結腸癌細胞。6.權利要求1的方法，其中所述來源于患者的生物樣品包括來自結腸癌細力包的上皮細月包。7.篩選用于治療或預防結腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使測試化合物與TOM34的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測該多肽和測試化合物之間的結合活性；和c)選擇與該多肽結合的測試化合物。8.篩選用于治療或預防結腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使候選化合物與表達TOM34的細胞接觸；和b)選擇與不存在該候選化合物時4企測的TOM34表達水平相比，降低TOM34表達水平的候選化合物。9.權利要求8的方法，其中所述細胞包括結腸癌細胞。10.篩選用于治療或預防結腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使測試化合物與TOM34的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇這樣的測試化合物與不存在該測試化合物時檢測的所述多肽的生物活性相比，該化合物抑制TOM34的多核普酸編碼的多肽的活性。11.篩選用于治療或預防結腸癌的化合物的方法，該方法包括下列步驟a)使候選化合物與其中導入了載體的細胞接觸，該載體包含TOM34的轉錄調節區域和在該轉錄調節區域控制下表達的報道基因；b)測量所述報道基因的表達或活性；和c)選擇降低所述報道基因的表達或活性的候選化合物。12.—種試劑盒，其包含與(a)TOM34或與(b)TOM34編碼的多肽結合的檢測試劑。13.治療或預防受試者中的結腸癌的方法，包括給所述受試者施用反義組合物，所述反義組合物包含與TOM34編碼序列互補的核香酸序列。14.治療或預防受試者中的結腸癌的方法，包括給所述受試者施用siRNA組合物，其中siRNA組合物降低TOM34的表達。15.權利要求14的方法，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有義鏈。16.權利要求15的方法，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，,其中[A]為與SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示序列對應的核糖核苷酸序列，[B]為由3到23個核苷酸組成的核糖核苷酸環序列，[A，]為由[A]的互補序列組成的核;瞎核苷酸序列。17.治療或預防受試者中的結腸癌的方法，包括給所述受試者施用藥學有效量的與TOM34蛋白結合的抗體或其免疫活性片段的步驟。18.—種治療或預防受試者中的結腸癌的方法，包括給所述受試者施用疫苗，該疫苗包含(a)由TOM34的核酸編碼的多肽，(b)所述多肽的免疫活性片段，或(c)編碼該多肽或(b)所述的免疫活性片段的多核苷酸。19.權利要求18的方法，其中所述免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基S吏序列的十肽；(ii)具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，其中該肽包含其中取代或添加了1或2或數個氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。20.—種誘導抗腫瘤免疫的方法，所述方法包括使多肽、編碼該多肽的多核苷酸或包含該多核苷酸的載體與抗原呈遞細胞接觸的步驟，其中所述多肽是由TOM34編碼的或者是該多肽的免疫活性片段。21.權利要求20的方法，其中免疫活性片段是以下二者或二者之一(i)包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽；(ii)具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，其中該肽包含其中取代或添加了1或2或數個氨基酸的SEQIDNO:7所示氨基酸序列。22.權利要求20的方法，其中該方法進一步包括給受試者施用抗原呈遞細胞的步驟。23.—種治療或預防受試者中的結腸癌的方法，所述方法包括施用根據權利要求7至11任一項的方法獲得的化合物的步驟。24.—種用于治療或預防結腸癌的組合物，所述組合物包含藥學有效量的針對TOM34的多核苷酸的反義多核苷酸或siRNA。25.權利要求24的組合物，其中所述siRNA包括含有SEQIDNO:48或SEQIDNO:52所示核苷酸序列的有義鏈。26.權利要求25的組合物，其中所述siRNA具有通式5，-[A]-[B]-[A，]-3，，其中[A]為與SEQIDNO:48或SEQIDNO:56所示序列對應的核糖核苷酸序列，[B]為由3到23個核苷酸組成的核糖核苷酸環序列，[A，]為由[A]的互補序列組成的核糖核苷酸序列。27.—種用于治療或預防結腸癌的組合物，所述組合物包含藥學有效量的與TOM34編碼的蛋白結合的抗體或其片段。28.—種用于治療或預防結腸癌的組合物，所述組合物包含藥學有效量的根據權利要求7至11任一項的方法選擇的化合物作為活性成分，以及藥學可接受的載體。29.包含SEQIDNO:7所示氨基酸序列的十肽。30.—種具有細胞毒T細胞誘導能力的肽，其中該肽包含SEQIDNO:7所示的氨基酸序列，其中取代或添加了1或2或數個氨基酸。31.權利要求30的肽，其中從N末端起第二個氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、曱碌u氨酸或色氨酸。32.權利要求30的肽，其中C末端氨基酸是苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、色氨酸或曱硫氨酸。33.—種用于治療或預防結腸癌的組合物，所述組合物包含藥學有效量的權利要求29或30的肽作為活性成分。全文摘要本文描述了檢測和診斷結腸癌的客觀方法。在一個實施方案中，診斷方法涉及確定在結腸癌細胞和正常細胞之間有區別的TOM34的表達水平。最后，本發明提供了篩選結腸癌中有用的治療劑的方法，治療結腸癌的方法以及接種受試者抗結腸癌的方法。文檔編號G01N33/574GK101278196SQ20068003538公開日2008年10月1日申請日期2006年7月21日優先權日2005年7月27日發明者中村佑輔,古川洋一,松島敏志,田原秀晃,角田卓也申請人:腫瘤療法科學股份有限公司