專利名稱：檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜及方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測青海血蜱體內是否帶有牛羊梨形蟲，并可區分出患病 動物寄生有何種梨形蟲的檢測膜、這種檢測膜的制備方法和使用方法。
技術背景梨形蟲病是由頂復門、梨形蟲綱中、梨形蟲目的巴貝斯科和泰勒科的原蟲 引起的血液原蟲病的總稱。梨形蟲病又名"焦蟲病"或"血孢子蟲病"。是由 媒介蜱傳播的巴貝斯科的巴貝斯屬和泰勒科的泰勒屬的多種梨形蟲寄生于紅細 胞內所引起的血液原蟲病，臨床以高熱、貧血、黃疸和血紅蛋白尿為主要特征， 嚴重時可造成死亡。由于全世界各地分布有各種各樣的蜱類，所以該病的分布也很廣，1914年最先發現于埃及，隨后在非洲、歐洲、亞洲的許多國家都發現 該病原。比如原蘇聯、印度、斯里蘭卡、日本，南美洲，非洲，亞洲，以及 南歐等地都有此病發生的報道。我國的養牛、羊區主要分布于北部地區。相關 調查表明，在這些地區梨形蟲病甚為流行。青海血蜱隸屬于硬蜱科，是鄧國藩 1978年命名的一個新種。它分布于我國的青海，甘肅，寧夏，四川，云南等海 拔高度在1600-4200米的區域，國外尚無記錄，該蜱生活與山區草地或灌木叢， 屬三宿主蜱，在自然界3年完成1個世代[2]，近年來的研究表明，青海血蜱是羊泰 勒蟲，包括尤氏泰勒蟲和呂氏泰勒蟲，中華泰勒蟲和羊莫氏巴貝斯蟲四種梨形 蟲病的傳播媒介。現有技術中對梨形蟲病的診斷方法主要包括三種方法(l)通過血涂片的方 法和臨床癥狀，參見Leemans I, Hooshmand-Rad P， Uggla A. The indirect fluorescent antibody test based on schizont antigen for study of the sheep parasite T72ez7en.a ksfc^waraf/[J]. Veterinary Parasitology, 1997， 69(1-2): 9 18. 。 (2)應用一 些血清學方法，如:補體結合試驗(CFT)和間接熒光抗體試驗(IFAT)檢測，但 這些方法很難排除不同種之間的交叉反應，而且常會出現假陽性和漏檢，參見 Bruning A. Equine piroplasmosis an update on diagnosis[J]. Br Vet J, 1996， 152: 139 151禾口Papadopoulos B， Brossard M, Perie NM (1996) Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece. Piroplasms of small ruminants. Vet Parasitol 63:67-74.。 (3) PCR技術，是目前檢測泰勒蟲最常用的分子診斷方法， 與常規的方法相比具有敏感性高、特異性強、檢出率高等優點。但PCR方法通常 不能同時檢測出混合感染的發生，參見Alhassan A, Pumidonming W, OkamuraM, Hirita H， Battsetseg B， Fujisaki F， Yokoyama N, Igarashi I (2005) Development of asingle-round and multiplex PCR method for the simultaneous detection of Babesia caballi and Babesia equi in horse blood. Vet Parasitol 129:43~49,。提供一種能同時檢測出被檢牛羊是否患有梨形蟲病，特別是能檢測出混合 感染，并區分出患病動物所患為何種梨形蟲病，對牛羊的飼養、疾病防治有著 積極的意義。 發明內容本發明提供一種能同時檢測出被檢牛羊是否患有梨形蟲病，特別是能檢測 出混合感染，并可以區分出患病動物所患為何種梨形蟲病的檢測膜，以及這種 檢測膜的制備方法和使用方法。本發明用于檢測牛羊體內呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和梨形蟲的檢測膜是在 Biodyne C薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，或者其上 還固定有巴貝斯蟲特異性寡核苷酸和泰勒蟲通用特異性寡核苷酸。本發明用于檢測牛羊體內呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和梨形蟲的檢測膜中， 在Biodyne C薄膜上固定的呂氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為 atcttctttttgatgagttg,固定的尤氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為tgcattttccgagtgttact， 固定的梨形蟲通用寡核苷酸序列為ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴貝斯蟲通用寡 核苷酸序列為ccttggtaatggttaataggaa，固定的中華泰勒蟲特異性寡核苷酸探針序 列為tcgcatetcttgctgagtg ，固定的莫氏巴貝斯蟲特異性寡核苷酸序列為 gaatgatgccgacttaaaccct 。本發明用于檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜的制備方法是分別人工 合成出梨形蟲通用寡核苷酸探針，泰勒蟲通用寡核苷酸探針，巴貝斯蟲通用寡 核苷酸探針，中華泰勒蟲特異性寡核苷酸，莫氏巴貝斯蟲特異性寡核苷酸，呂 氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，將所得到的各寡核苷酸5'端用氨基 團修飾，再將其分別共價結合到帶有負電荷的Biodyne C薄膜上。采用本發明的檢測膜檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的方法是以從待檢青海 血蜱體內提取的DNA作為模板，在泰勒蟲和巴貝斯蟲18S rRNA基因序列V4 高變區兩端的保守區域設計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的引物，其中 一條引物用生物素標記，然后進行PCR擴增，獲得生物素標記的PCR產物，生 物素標記的PCR產物和固定在Biodyne C膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡核苷酸 進行雜交，再經增強化學發光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲片夾內，在薄膜 上放X光膠片進行曝光，再對膠片進行顯影和定影處理，根據膠片上產生的強 度信號確定被檢動物是否有患有相應的疾病。綜上所述，本發明根據己報道的梨形蟲18SrRNA基因序列設計梨形蟲的通用性引物對和梨形蟲種特異性寡核苷酸探針固定于Biodyne C薄膜上，將PCR 方法和RLB方法相結合建立了一種特異，敏感的診斷方法，可以識別相應的梨 形蟲種或屬；其敏感性明顯高于槽式PCR方法。 本發明有如下優點采用本發明的檢測膜可以很方便地檢測出被檢青海血蜱體內是否帶有梨形 蟲，并可區分出青海血蜱體內所帶的為何種梨形蟲，例如攜帶的是中華泰勒蟲， 莫氏巴貝斯蟲還是呂氏泰勒蟲或尤氏泰勒蟲。由于本發明的檢測膜上還固定有 梨形蟲的通用寡核苷酸探針，因此本發明可以同時檢測多個蟲種的存在，這對 于牛羊群疾病的控制及預防治療有積極的意義。本發明的方法最大優點是可以同時檢測出青海血蜱體內同時攜帶有泰勒 蟲和巴貝斯蟲的情況，而且只需要作一次PCR，如果有擴增產物，說明該蜱肯定 是攜帶有巴貝斯蟲或泰勒蟲的某一種或幾個種。另外，PCR產物與探針雜交后， 還能說明被檢蜱所攜帶的蟲體的種類，這對于疾病的控制及預防有更為積極的 意義。第三，本發明的敏感性要高于PCR，且能同時區分病原的屬和種，這一特 性在流行病學調查上具有重要意義。由于與探針雜交的PCR產物可以除去，因此 雜交膜可以反復使用，據報道這種膜至少可以使用20次以上，另外，在一張膜 上，可以固化45個探針，同時檢測45個PCR產物，其成本相對低廉。采用本發明的檢測膜進行檢測的方法非常的簡單，而且檢測用時較少，其 檢測成本相對也比較低，而且漏檢率要遠遠小于現有技術。
圖1為青海血蜱體內四種牛羊梨形蟲RLB標準陽性特異性試驗圖。
具體實施方式
一、引物和探針的設計與合成泰勒蟲和巴貝斯蟲的特異性寡核苷酸序列根據每個蟲種的18S rRNA基因 序列設計。在泰勒蟲和巴貝斯蟲18SrRNA基因序列V4高變區兩端的保守區域 設計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的引物，其中上游引物RLB-F (5-gaggtagtgacaagaaataacaata-3),下游弓l物RLB-R (biotin-5- tcttcgatcccctaactttc -3)，根據已確定的18SrRNA基因序列的V4高變區域設計針對莫氏巴貝斯蟲、 中華泰勒蟲、呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲不同蟲種的四個特異性寡核苷酸探針(這 里的問題是僅以現在的記載，是否本領域技術人員也可設計出這四個特異性寡 核苷酸探針，如不行則需要給出設計探針的技術及相關要求)，即B.m， T.s， T. l和T. u，另外，針對所有梨形蟲的通用探針catch-all和泰勒蟲通用探針，巴 貝斯蟲通用探針Tall, Ball也分別被設計合成。所有的寡核苷酸探針N-(trifluoroacetamidohexyl-cyanoethyl, N, N-diisopropyl phosphoramidite[TFA])-C6氨基團連接修飾，將合成的探針0-800pmol/150ul 500mM NaHC03(pH8.4)，尋找最佳濃度用于雜交。本發明所用的核酸探針序列和其最佳濃度見表.1，所涉及的梨形蟲和它們對應的寡核苷酸探針識別模式見表2。二、含有泰勒蟲和巴貝斯蟲特異寡核苷酸Biodyne C膜的制備 所有的寡核苷酸5'端被氨基團修飾后合成。它們能夠共價結合到帶有負電荷的Biodyne C薄膜上。按照Gubbels等1999描述的方法改進后進行操作，基本過程如下(1) 用149ul 500 mM NaHC03. pH 8,4(每次都要精確校對pH值)稀釋泰勒 蟲和巴貝斯蟲的特異性寡核苷酸到己經確定的最佳濃度。(2) 將BiodyneC膜剪成14.5cmX14.5cm大小，用記號筆標記薄膜以便能 在以后的操作中辨別方向。用去離子水配制新鮮的16% (w/v) l-ethyl-3-(3陽dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDAC)，力口 10ml孵育10分鐘活 化BiodyneC膜，室溫下旋轉培養瓶。(3) 將薄膜放在塑料容器中用去離子水搖洗兩分鐘，然后放入潔凈的印跡 儀中。旋緊手柄。(4) 通過抽吸除去孔里殘留的液體。將150ul稀釋的寡核苷酸溶液加入印 跡儀的孔槽，第一個和最后一個孔不加寡核苷酸。(5) 將墨水用2xSSPE緩沖液按1: 100的比例稀釋，加入第一個孔和最 后一個孔。(6) 所有的樣品都加入以后，室溫下孵育2分鐘。(7) 通過抽吸除去每個孔槽內的寡核苷酸溶液及第一和最后一個孔槽的墨 水稀釋液。(8) 用鑷子從印跡儀中除去膜,然后用250ml新鮮配制的100mMNaOH(最 大量)在塑料容器中孵育10分鐘，不斷搖動容器使膜鈍化。(9) 用去離子水漂洗薄膜。(10) 在塑料容器中用250 ml 2x SSPE /0.1% SDS 60。C漂洗5分鐘，漂洗 期間輕微搖動溶液瓶。(11) 用100ml20mMEDTApH8，0在塑料容器中漂洗薄膜，室溫下輕輕 搖動15分鐘。(12) 4°C保存薄膜直到使用(用塑料制品密封或者用包裝膜包裝避免薄膜 脫水)。三、 蜱體內蟲體基因組DNA的提純
1、 從待檢測區域捕捉蜱。
2、 將蜱進行清洗，并用70%的酒精洗蜱三次，置于干凈紙巾上，確定蜱的 雌雄。
3、 取出蜱，置于Ependorf管的蓋子內，用兩只12針頭將蜱中間切開，再 切成4塊，然后放入加有100ul cell lysis solution的Ependorf管內，顛倒數次， 使所有的組織進入cell lysis solution ，蓋住管，在管子上標記好樣品的性別及來 源。
4、 在加熱振蕩器上65"C、 800rpm條件下加熱2小時。
5、 加入腦Ase0.5ul，顛倒25次，65°C， 15分鐘。
6、 力口入40ul Protein Preciptation solution
7、 Vertex 20second,使溶液完全混合。
8、 13000g離心3分鐘
9、 將上清移置一標記好的Ependorf管中，加入lOOul異丙醇，顛倒50次。
10、 13000g離心10分鐘
11、 傾去上清，置于干凈的吸水紙上，吸干剩余液體。
12、 加入100ul70。/。的乙醇
13、 13000g離心3分鐘，小心除去乙醇，在吸水紙上吸干剩余液體。
14、 在DNA干燥儀上干燥。
15、 加入20ulDNA Hydration solution,將其加熱至65。C后保溫1小時，再 冷卻至將4'C或者-2(TC保存。
本發明的實施例中采用GENTRA的DNA提取試劑盒提取蜱的DNA。
四、 PCR擴增
基因片段PCR擴增的反應體系及程序
H20 56.0(il
10x buffer* 7.2|il
10mMdNTP 1.6^1
lOOuM上游引物(RLBF) 3.6(il
lOOuM下游引物(RLBR) 3.6|^1
Genomic DNA lul
Taq酶 0.36|il
*(200 mM Tris-HCl (pH 8.55), 160mM (NH4)2S04禾B 20mM MgC12)> 40個循環
所有的樣品混合后12000rpm離心10秒，置于PCR擴增儀中按照如下循環
進行擴增
94 °C 3min
94 。C lmin30sec
55。C lmin30sec
72 。C lmin30sec
72 。C 3min
4°C 保存 取PCR產物1.5ul在1.0。/。的瓊脂糖凝膠(含0.5。/。ug/ml溴化乙錠)，在75伏的電壓
下進行電泳分析，觀察擴增結果。
五、檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲RLB方法的建立
生物素標記的PCR產物和固定在Biodyne C膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡 核苷酸進行雜交。如果存在泰勒蟲或巴貝斯蟲，則和寡核苷酸特異性作用后用 streptavidin-peroxidase和ECL-detection (增強化學發光)孵育后在黑色的方格里 面的膠片上可以看到顯影，操作步驟如下
(1) 準備下面的緩沖液，用無離子水稀釋，所有的緩沖液使用前要預熱。 (按一張膜的量)
250 ml 2xSSPE/0.1% SDS, 60。C, 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS, 60oC， 500 ml 2xSSPE/0.5% SDS, 42。C. 500ml2xSSPE,室溫.
(2) 加20 nl的PCR產物至ij 130 pi 2xSSPE/0.1 % SDS中。
(3) 稀釋后的PCR產物99°C熱激10分鐘然后立即在冰中冷卻。
(4) 用250 ml2xSSPE/0.1% SDS 60°C漂洗膜5分鐘。
(5) 在印跡儀中按照與寡核苷酸成垂直的方向放入薄膜和支持氣墊。
(6) 通過抽吸的方法除去印跡儀中殘留的液體。
(7) 用稀釋后的PCR產物填充孔槽，在水平面上60。C雜交10分鐘。
(8) 通過抽吸除掉印跡儀中的樣品，然后用鑷子將膜取出。
(9) 用250ml2xSSPE/0.5。/。SDS60。C， IO分鐘，漂洗膜兩次。
(10) 放置膜在旋轉瓶中使其冷卻，以免下一步因過氧化物酶作用而失活。
(11) 加入2.5ul鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶(500U/ml)結合到10ml 2xSSPE/0.5°/。 SDS中，將此溶液加入旋轉瓶中42°C孵化薄膜45-60分鐘。
(12) 用250 ml的2xSSPE/0.5% SDS溶液42°C 10分鐘漂洗兩次。(13) 用250 ml的2xSSPE在室溫下5分鐘漂洗膜兩次。
(14) 力口 lml免疫印跡發光氨試劑A于一個5ml試管中，隨后加入lml的 試劑B，混合均勻。
(15) 將薄膜放置在塑料布或者包裝膜內，滴加A、 B混合液在膜上含有 寡核苷酸和PCR產物雜交的區域，用塑料層覆蓋膜，塑料薄膜封閉器封閉薄膜。
(16) 放置封閉好的薄膜于曝光儲片夾內，放一張X光膠片在薄膜上(在 膠片的左側角打折為了以后辨認方向)，曝光30分鐘。
(17) 取出X光膠片放入顯影液中顯影5分鐘，然后用無離子水漂洗2分 鐘，隨后轉入定影液中定影5分鐘，再用無離子水漂洗，充分洗去定影液后觀 察結果。
(18) 如果膠片上的信號太弱或太強，可延長或縮短曝光時間將薄膜直接 曝光于另一張膠片。雜交過的PCR產物可以從膜上除去。 一張膜可以重復利用 大約15次。
結果判定通過PCR擴增表1中列出的所有蟲株的18SrRNA基因V4高變 區域，產生的DNA片段和固定在薄膜上的寡核苷酸探針進行核酸雜交，寡核苷 酸探針經光學發光作用，在膠片上產生一定強度的信號，所有的探針僅與它們 各自的靶序列進行結合，不同的種、屬和株之間沒有交叉反應，很清楚的與相 應的蟲種或者株產生雜交信號。每個泰勒蟲種可以被四個核苷酸探針識別梨 形蟲通用探針(ca841-859)，泰勒蟲通用探針(T-all 811-832),和呂氏泰勒蟲探針 (T-l 628-647)或尤氏泰勒蟲探針(T-u 678-697)或中華泰勒蟲(T. s 627-645)。 巴 貝斯蟲可被三個探針識別梨形蟲通用探針(ca841-859)、巴貝斯通用探針(B-all 745-766)，和莫氏巴貝斯蟲探針(B.m466487)。附結果見圖1。
通過對甘肅省甘南自治州臨潭縣的99份青海血蜱樣品進行實際檢測，并與 特異性引物擴增的槽式PCR方法進行比較，RLB的檢出率明顯高于槽式PCR 方法，該方法可以檢測出梨形蟲的種類和混合感染的情況，為梨形蟲病的檢測、 蟲種鑒定和流行病學調査提供了工具。附表:
表.1，泰勒蟲和巴貝斯蟲寡核苷酸探針序列和最佳濃度
寡核苷酸 (Oligonucleotides)
序列
(Sequence5'-3')
最佳濃度 (Optimised concentrations)
梨形蟲通用探針
(Cat-all) (ca 841-859) 巴貝斯蟲通用探針
(￡-all) (B-all 745-766) 泰勒蟲通用探針
(r-all) (T-all 811-832) 莫氏巴貝斯蟲探針
(￡. motaw.) (B. m 466^487) 中華泰勒蟲探針 (7". sinensis) (T. s 627-645) 呂氏泰勒蟲探針
(71. /脂e/ts/ ,' ) (丁.l 628-647)
CTGTCAGAGGTGAAATTCT
CCTTGGTAATGGTTAATAGGA
A
TACCAAAGTAATGGTTAATAG
G
GAATGATGCCGACTTAAACCC
TCGCATCTCTTGCTGAGTG
ATCTTCTTTTTGATGAGTTG
J00 200pmo1
100 200pmol
10 50pmol
100 200pmol
600 800pmol
300 400pmol
尤氏泰勒蟲探針 (r. !^7ew6e/^ ) 678-697)
(T.u
TGCATTTTCCGAGTGTTACT
600 800pmol
表2本發明所涉及的梨形蟲和它們對應的寡核苷酸探針識別模式
種群
Isolates
呂氏泰勒蟲(麻當株) 7 /證e似tew' (Madang)
中華泰勒蟲(渭源株)
尤氏泰勒蟲(隆德株) T (Longde)
莫氏巴貝斯蟲(寧縣株)
種 Species
7!
7
寡核苷酸
Oligonucleotide
種特異性 Species-specific
T. 1
屬特異性 Group-specific
T. s
T. i
B. m
T-all
B-all
(Cat-All)
權利要求
1、一種用于檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜，其特征是在Biodyne C薄膜上固定有牛羊梨形蟲的特異性寡核苷酸探針。
2、 根據權利要求l所述的用于檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜，其 特征是牛羊梨形蟲的通用特異性寡核苷酸探針序列為ctgtcagaggtgaaattct。
3、 根據權利要求2所述的用于檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜，其 特征是在Biodyne C薄膜.卜.還固定有巴貝斯蟲通用寡核苷酸探針和泰勒蟲通用 寡核苷酸探針。
4、 根據權利要求3所述的用于檢測青海血蜱體內牛羊梨形蟲的檢測膜，其 特征在于在Biodyne C薄膜上固定的巴貝斯蟲通用特異性寡核苷酸探針序列為 ccttggtaatggttaataggaa ，固定的泰勒蟲通用寡核苷酸探針序列為 taccaaagtaatggttaatagg ，固定的呂氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為 atc加tttttgatgagttg，固定的尤氏泰勒蟲特異性寡核苷酸序列為tgcattttccgagtgttact， 固定的梨形蟲特異性寡核苷酸序列為ctgteagaggtgaaattct，固定的中華泰勒蟲特 異性寡核苷酸探針序列為tcgcatctcttgctgagtg,固定的莫氏巴貝斯蟲特異性寡核苷 酸序列為gaatgatgccgacttaaaccct 。
5、 權利要求1或2所述的用于檢測青海血蜱體內梨形蟲的檢測膜的制備方 法，其特征是人工合成出牛羊梨形蟲的特異性寡核苷酸探針，將所得到的寡核 苷酸5'端用氨基團修飾，再將其共價結合到帶有負電荷的Biodyne C薄膜上。
6、 權利要求3或4所述的用于檢測青海血蜱體內梨形蟲的檢測膜的制備方 法，其特征是人工分別合成出牛羊梨形蟲的特異性寡核苷酸探針、巴貝斯蟲通 用寡核苷酸探針、泰勒蟲通用寡核苷酸探針及中華泰勒蟲、莫氏巴貝斯蟲特異 性寡核苷酸探針、呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸探針，將所得到 的各寡核苷酸5'端用氨基團修飾，再將其分別共價結合到帶有負電荷的Biodyne C薄膜上。
7、 采用權利要求1至4所述的任'檢測膜檢測青海血蜱體內梨形蟲的方法， 其特征是以從青海血蜱體內提取的DNA作為模板，在牛羊梨形蟲18S rRNA基 因序列V4高變區兩端的保守區域設計一對擴增出的片段大小為480bp-491bp的 引物，其中一條引物用生物素標記，然后進行PCR擴增，獲得生物素標記的PCR 產物，生物素標記的PCR產物和固定在Biodyne C膜上的泰勒蟲和巴貝斯蟲的 寡核苷酸進行雜交，再經增強化學發光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲片夾內， 在薄膜上放X光膠片進行曝光，再對膠片進行顯影和定影處理，根據膠片上產 生的強度信號確定被檢蜱是否帶有相應的梨形蟲。
全文摘要
本發明涉及檢測青海血蜱體內有無牛羊梨形蟲，并可區分是何種梨形蟲的檢測膜。本發明用于檢測牛羊體內呂氏泰勒蟲、尤氏泰勒蟲和梨形蟲的檢測膜是在Biodyne C薄膜上固定有呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的特異性寡核苷酸，或者其上還固定有巴貝斯蟲特異性寡核苷酸和泰勒蟲通用特異性寡核苷酸。本發明的檢測方法是待檢血蜱體內提取的DNA作為模板，以特定的引物進行PCR擴增，其產物與檢測的泰勒蟲和巴貝斯蟲的寡核苷酸進行雜交，再經增強化學發光孵育后將雜交后的膜放置曝光儲片夾內，在薄膜上放X光膠片進行曝光、顯影等處理，根據膠片上產生的強度信號確定被檢動物是否有患有相應的疾病。
文檔編號G01N21/76GK101597650SQ200910147069
公開日2009年12月9日 申請日期2009年6月1日 優先權日2009年6月1日
發明者任巧云, 黨志勝, 關貴全, 劉軍龍, 劉志杰, 劉愛紅, 李有全, 宏 殷, 牛慶麗, 羅建勛, 馬米玲, 高金亮 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所
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