血漿中4種蒽醌的分析方法及其在藥代動力學中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了同時測定血漿中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的分析方法，包括步驟(1)樣品的制備和步驟(2)檢測，以及在藥代動力學中的應用。該分析方法具有良好的專屬性、精密度和準確度較高，線性范圍較寬，可用于中藥組合物的體內藥代動力學測定。
【專利說明】血漿中4種蒽醌的分析方法及其在藥代動力學中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于現代中藥應用領域，特別涉及血漿中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的LC-MS/MS檢測方法，以及在藥代動力學中的應用。
【背景技術】
[0002]質譜是以分子量測定為基礎的分析方法，近年來，其與高效液相色譜法(HPLC)或毛細管電泳法(CE)等分離機制的聯用不僅提高了其抗雜質干擾的能力和節省了分析時間，而且大大提高了測定的靈敏度。軟電離技術，如電噴霧離子化技術(ESI)的發展，則擴大了分子量檢測的范圍。此外，電噴霧離子化技術可在大氣壓下進行，方便與液相色譜儀連結，使液相色譜質譜聯用技術(LC/MS)成為了一種高靈敏度、高選擇性且快速分析的技術，其能在短時間之內，同時實現分析物的分離與結構鑒定。通過液相色譜質譜聯用技術(LC/MS/MS)能更清楚地了解藥物在動物活體內的藥物動力學規律，從而讓研究人員能夠更好地掌握藥物的藥理作用。另外還可以省去復雜、繁瑣且耗時的樣本前處理工作。
[0003]糖敏靈丸是在臨床驗證的有效方開郁清胃顆粒基礎上加減變化與劑型改革而成。糖敏靈丸由黃連、大黃、黃芩、白芍、柴胡、枳實、山楂、烏梅、半夏、天花粉共十味常用中藥組成，具有開郁清胃、滋陰降火、通腑瀉濁之功效。臨床觀察證實其對II型糖尿病的血糖有明顯的改善作用，尤其是對體型偏胖的早中期II型糖尿病患者效果更加顯著。同時，藥理實驗揭示糖敏靈能顯著增強高熱量飼料誘導的胰島素抵抗模型糖尿病大鼠和自發性II型糖尿病大鼠的胰島素敏感性。
[0004]大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚是糖敏靈中的4種有效成份，但是目前還沒有可以同時檢測血漿樣本中這4種成份的方法。
【發明內容】
[0005]糖敏靈制劑作為藥物，需要進行必要的藥代動力學實驗，由于上述藥物活性成分在血中含量極低，需要精密儀器和精密方法進行操作，本發明經過研究，找到了適合測定這些物質的方法。
[0006]本發明提供一種液相色譜串聯質譜法定量檢測血漿樣本中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的方法，以及在藥代動力學中的應用。
[0007]根據本發明，分析方法包括步驟(I)樣品的制備和步驟(2)檢測，步驟(I)樣品制備采用包括以下步驟的方法:
[0008]a.向待測樣品中依次加入有機溶劑、內標溶液，并混勻；
[0009]b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻；
[0010]c.離心，收集上清液，并蒸干；
[0011]d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液。
[0012]分別考察了不加酸、加酸以及不同酸化條件后進行液液萃取，結果表明，酸化后大黃酚和大黃素甲醚提取率明顯降低，而不加酸時各待測物提取回收率最高，因此，樣品不進行酸化，直接采用乙醚液液萃取。
[0013]根據本發明實施方式之一，步驟a中所述內標為1，8-二羥基蒽醌。
[0014]對多種化合物進行篩選,其中1，8-二羥基蒽醌與大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚均屬大黃素型蒽醌類化合物，質譜響應強度相當。為提高方法的重復性和準確性，選擇1，8-二羥基蒽醌為內標。
[0015]根據本發明實施方式之一，步驟a中所述有機溶劑為甲醇。
[0016]根據本發明實施方式之一，步驟b中所述提取溶劑為乙醚。
[0017]分別考察了甲醇沉淀蛋白法、乙酸乙酯、氯仿和乙醚液液萃取法，結果表明甲醇沉淀蛋白法和乙醚液液萃取法提取率較高。但甲醇沉淀蛋白法中，大黃素的提取回收率略低于乙醚液液萃取法，大黃酚和內標的提取回收率略高于乙醚液液萃取法。由于大黃素在所有待測物中提取回收率最低，為保證所有待測物的準確度，選擇乙醚液液萃取法。
[0018]根據本發明實施方式之一，步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
[0019]根據本發明實施方式之一，步驟(2)采用的液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱，流動相為乙臆_0.01-0.1%氨水溶液，體積比為10:90-90:10。
[0020]優選的，流動相為乙腈-0.05%氨水溶液體積比為70:30。
[0021]為獲得高分離度和離子強度，對色譜條件進行了優化。乙腈為有機相時待測物響應提高，背景噪音降低。分別考察了乙腈-水、乙腈_5mM甲酸銨水溶液、乙腈-0.5mM甲酸銨水溶液和乙腈-0.05%氨水溶液等流動相系統，結果表明在水相中加入少量氨水，可以提高待測物在負離子模式下的質譜響應，同時可以改善峰形，因此選擇乙腈-0.05%氨水溶液(70:30, v/v)為流動相。
[0022]根據本發明實施方式之一，步驟(2)檢測所用質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為負離子選擇反應監測。
[0023]各待測物在ESI源負離子模式下響應強度較高，而在正離子模式下基本無響應。
[0024]優選的，大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導裂解電壓分別為30eV,25eV,23eV,26eVo
[0025]本發明所述方法可成功用于糖敏靈制劑藥代動力學的測定。
[0026]本發明所述糖敏靈丸由下列重量份的原料制成:
[0027]天花粉10-30份柴胡10-30份枳實3~15份大黃I~6份半夏I~12份黃芩3~15份黃連I~12份白芍3~15份烏梅5~20份山楂3~15份。
[0028]制備方法如下:所述的黃芩加水提取兩次，每次I小時，提取液加濃鹽酸調ph值至
1.5~2.0，80°C保溫I小時，抽濾，濾餅干燥，得黃芩提取物；所述的黃連加75%乙醇提取2次每次2小時，提取液減壓回收乙醇，加入濃鹽酸調ph值至1.0~2.0，抽濾，濾餅干燥，得黃連提取物；其余8味藥用水回流提取2次，每次I小時，提取液減壓濃縮至1: 1，加入95%乙醇至含醇量70%，濾過，濾液減壓濃縮至稠膏加入黃連提取物與黃芩提取物，即得糖敏靈制劑的藥物活性成分。藥物活性成分與微晶纖維素按適當比例混合，按照常規方法制備成濃縮丸。
[0029]本發明所述糖敏靈制劑包括:片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉針劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、滴劑、貼劑、滴丸。因為藥物活性成分相同，所以本發明提供的方法可以用于多種不同制劑的糖敏靈藥代動力學的檢測。
[0030]本申請相對現有技術而言所具有的優點和效果:
[0031]1、可以一次性檢測多種藥物活性成分的數據。
[0032]2、可用于多種藥物活性成分的藥代動力學測定。
[0033]3、檢測結果準確，靈敏度高。
[0034]本發明附加的方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1.空白血漿樣品中1，8- 二羥基蒽醌(IS)的SRM色譜圖。
[0036]圖2.空白血漿中加入1，8- 二羥基蒽醌(IS)對照品溶液后的SRM色譜圖。
[0037]圖3.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中1，8_ 二羥基蒽醌(IS)的SRM色譜圖。
[0038]圖4.空白血漿樣品中大黃酚的SRM色譜圖。
[0039]圖5.空白血漿中加入大黃 酚對照品溶液后的SRM色譜圖。
[0040]圖6.大鼠灌胃給予糖 敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃酚的SRM色譜圖。
[0041]圖7.空白血漿樣品中大黃素和蘆薈大黃素的SRM色譜圖。
[0042]圖8.空白血漿中加入大黃素和蘆薈大黃素對照品溶液后的SRM色譜圖。
[0043]圖9.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃素和蘆薈大黃素的SRM色譜圖。
[0044]圖10.空白血漿樣品中大黃素甲醚的SRM色譜圖。
[0045]圖11.空白血漿中加入大黃素甲醚對照品溶液后的SRM色譜圖。
[0046]圖12.大鼠灌胃給予糖敏靈后0.67h，血漿樣品中大黃素甲醚的SRM色譜圖。
[0047]圖13.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃素的藥-時曲線。
[0048]圖14.大鼠灌胃給予糖敏靈后，蘆薈大黃素的藥-時曲線。
[0049]圖15.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃酚的藥-時曲線。
[0050]圖16.大鼠灌胃給予糖敏靈后，大黃素甲醚的藥-時曲線。
[0051]圖17.大黃素[Μ-Η離子的產物離子質譜圖。
[0052]圖18.蘆薈大黃素[Μ-Η離子的產物離子質譜圖。
[0053]圖19.大黃酚[Μ-Η離子的產物離子質譜圖。
[0054]圖20.大黃素甲醚[Μ-Η離子的產物離子質譜圖。
[0055]圖21.1, 8- 二羥基蒽醌(IS) [M_H]_離子的產物離子質譜圖。
【具體實施方式】:
[0056]以下通過實施例進一步說明本發明，但不作為對本發明的限制。
[0057]本發明是經過篩選獲得的，篩選方法如下:
[0058]試驗例I血漿樣品中4種蒽醌分析方法的建立
[0059]LC-MS/MS 條件
[0060]色譜柱:HypersilGold-C18(150X 2.1mm, 5 μ m, Thermo)[0061]預柱-Security Guard-C18 (4.0mmX 3.0mm 1.d, 5 μ m, Phenomenex)
[0062]流動相:乙腈-0.05%氨水溶液(70:30)
[0063]柱溫:25°C
[0064]流速:250μ L.mirf1
[0065]離子源:電噴霧離子化源(ESI)
[0066]電離模式:負離子模式
[0067]MS/MS:選擇反應監測(SRM)。用于定量分析的離子反應分別為m/z239 — 211 (內標，1，8- 二羥基蒽醌)，m/z253 — 225 (大黃酚)，m/z269 — 225 (大黃素)，m/z269 — 240 (蘆薈大黃素)，m/z283 — 240 (大黃素甲醚)。
[0068]質譜參數:噴霧電壓:3500V;離子源電壓:10eV;毛細管溫度:350 °C ;鞘氣:N2(35psi)；
[0069]輔助氣=N2(IOpsi);碰撞氣體壓力:Arl.0mTorr (lTorr=133.3Pa) ;1，8_ 二羥基蒽醌、大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導裂解(CID)電壓分別為28eV，30eV,25eV,23eV,26eV ;掃描時間:0.5s。
[0070]溶液的制備
[0071](I)標準系列溶液的配制取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚適量，精密稱定，分別置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，獲得濃度分別為0.154mg-mL-1,
0.152mg.mL'0.212mg.πι?Λ·θ.122mg.mL—1的對照品溶液。分別精密量取大黃素、蘆薈大黃素、大黃酹和大黃素甲醚對照品溶液5.0,4.0,2.5,5.0mL,置于同一 IOOmL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度分另Ij為7.70 μ g.mL—U.08 μ g.mL—1，5.30 μ g.mL—1，6.10 μ g.ml/1的混合對照品儲備液。
[0072]分別精密量取適量混合對照品儲備液，甲醇稀釋制成混合對照品溶液，其中大黃素濃度為 3.850，11.55，38.50,96.2，192.5，385.0, 770.0ng.πι?Λ 蘆薈大黃素濃度為 3.040,9.12，30.40,76.00，152.0,304.0,608.0ng.πι?Λ 大黃酚濃度為 2.650,7.950，26.50,66.25，132.5,265.0,530.0ng.πι?Λ 大黃素甲醚濃度為 3.050,9.15,30.50,76.25，152.5, 305.0,610.0ng.mL 1
[0073](2)內標溶液的配制取1，8-二羥基蒽醌對照品適量，精密稱定，置于IOmL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，獲得濃度為0.502mg.mL—1的儲備液。精密量取儲備液0.05mL,置于IOOmL量瓶中，甲醇稀釋并定容至刻度，獲得濃度為251.0ng.mL—1的內標溶液。
[0074]各儲備液及標準系列溶液置4°C冰箱保存備用。
[0075]血漿樣品預處理
[0076]取肝素抗凝血漿200 μ L，置2mL塑料EP管中，依次加入內標溶液50 yL(l, 8_ 二羥基蒽醌溶液，251.0ng.mL-1)和甲醇100 μ L。潤旋混合IOs,加入無水乙醚1.2mL,潤旋混合5min, 8000r.mirT1離心5min,分取上層乙醚溶液于45°C下氮氣吹干,殘洛用100 μ L乙腈-水(7:3)溶解，12000r.mirT1離心5min,取上清液20μ L進樣,記錄色譜圖。
[0077]分析方法的確證
[0078](I)方法的專屬性大鼠空白血漿200 μ L，除用100 μ L流動相代替內標溶液外，其余按“血漿樣品預處理”項下方法操作，獲得空白樣品的色譜圖(圖1、4、7和10);將一定濃度的大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的混合對照品溶液和內標溶液(結構見下圖)加入空白血漿中，依法操作，獲得相應的色譜圖(圖2、5、8和11)，取大鼠灌胃糖敏靈后的血漿樣品，同法操作，得色譜圖(圖3、6、9和12)。其中1，8-二羥基蒽醌(IS)、大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的保留時間分別為2.0，2.3，2.5，2.8，4.1,8.3min ;結果
表明,血漿中內源性物質不干擾測定。
[0079]
【權利要求】
1.一種液相色譜串聯質譜法定量檢測血漿樣本中大黃素、蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的方法，包括步驟(I)樣品的制備和步驟(2)檢測，其特征在于步驟(I)樣品制備采用包括以下步驟的方法: a.向待測樣品中依次加入有機溶劑、內標溶液，并混勾; b.加入一倍以上體積提取溶劑，混勻； c.離心，收集上清液，并蒸干； d.步驟c的干燥物重新溶解，離心，取上清液。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述內標為1，8_二羥基蒽醌。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中所述有機溶劑為甲醇。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中所述提取溶劑為乙醚。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d重新溶解所用溶劑為乙腈-水。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱，流動相為乙臆-0.01-0.1 %氛水溶液,體積比為10: 90-90: 10。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所述流動相為乙腈-0.05%氨水溶液體積比為 70: 30
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于質譜采用電噴霧離子化源，電離模式為負離子選擇反應監測。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于大黃酚、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚的碰撞誘導裂解電壓分別為30eV，25eV，23eV，26eV。
10.如權利要求1至9任意一項在測定糖敏靈制劑藥代動力學中的應用。
【文檔編號】G01N30/02GK103575830SQ201210272432
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月1日 優先權日:2012年8月1日
【發明者】佟玲, 周水平, 朱永宏, 馬曉慧, 靳元鵬, 鄂秀輝 申請人:天士力制藥集團股份有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
