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專利名稱：二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒及二氧化碳濃度的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定二氧化碳濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
血液內(nèi)二氧化碳的含量對(duì)人體內(nèi)酸堿平衡的調(diào)節(jié)起著重要的作用。血液pH的恒定是維持生命活動(dòng)必不可少的條件，血漿中的多種緩沖系統(tǒng)中以碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)最為重要，直接影響血液的pH。
血液內(nèi)二氧化碳的含量變化主要反映代謝性酸堿平衡紊亂。單純代謝性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根[HCO3-]下降或升高，總二氧化碳也隨之下降或升高。而單純呼吸性酸或堿中毒時(shí)，血液碳酸氫根升高或下降。
總二氧化碳和碳酸氫根的測(cè)定方法較可分為直接測(cè)定和間接推算兩類。直接測(cè)定主要有量氣法、量壓法、滴定法、比色法、Conway微量擴(kuò)散法、流動(dòng)注射氣體擴(kuò)散法等。間接推算是利用血?dú)夥治鰞x測(cè)得的PH與PCO2，根據(jù)H-H方程的變換形式 HCO3-(m mol/L)＝0.03×PCO2(mm Hg)×antilog(PH-p ka)或 HCO3-(m mol/L)＝0.225×PCO2(k Pa)×antilog(PH-p Ka) 計(jì)算獲得。
式中PH為37℃時(shí)測(cè)得值，p ka在37℃為6.10。
目前，以間接推算法應(yīng)用較普遍，由血液分析儀的微處理計(jì)算機(jī)并與血?dú)夥治鼋Y(jié)果一起報(bào)告，準(zhǔn)確性基本可以符合臨床要求。
直接測(cè)定法以滴定法應(yīng)用最廣泛，但由于受多種因素影響，測(cè)定誤差較大。
酶法測(cè)定適合自動(dòng)化分析，結(jié)果可靠，應(yīng)當(dāng)是很有前途的測(cè)定方法，但目前尚有待深入研究。
檢索中國(guó)專利發(fā)現(xiàn)，申請(qǐng)?zhí)枮?6190276.0、申請(qǐng)日為1996.02.06的發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種用來(lái)導(dǎo)出病人血液中氣體含量的非侵入性的系統(tǒng)和方法。該系統(tǒng)相應(yīng)于體積測(cè)量呼氣中的二氧化碳濃度。然后處理該數(shù)據(jù)導(dǎo)出動(dòng)脈血中二氧化碳?xì)怏w水平。若數(shù)據(jù)為時(shí)間域，處理可將時(shí)間域數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成體積域。該方法也經(jīng)迭代評(píng)估了多個(gè)變量的顯著性，所得的關(guān)系可供快速和準(zhǔn)確地對(duì)健康人和患肺病病人進(jìn)行血中氣體含量的測(cè)定。近年來(lái)，申請(qǐng)?zhí)枮?2282386.7、申請(qǐng)日為2002.10.29的實(shí)用新型專利公開了一種醫(yī)用的血液碳酸氫根測(cè)定儀，主要由操作面板、進(jìn)樣檢測(cè)機(jī)構(gòu)、定滴加液機(jī)構(gòu)、攪拌機(jī)構(gòu)和以單片機(jī)為主控元件的電器控制部分組成。其操作面板包括有手動(dòng)按鍵、輸入鍵盤和顯示屏；進(jìn)樣檢測(cè)機(jī)構(gòu)由沿圓周均布樣本孔且在孔內(nèi)放置樣本瓶的樣本轉(zhuǎn)盤和豎直裝配在轉(zhuǎn)盤下面的驅(qū)動(dòng)電機(jī)及對(duì)應(yīng)于檢測(cè)位樣本孔設(shè)置的光電檢測(cè)器組成；定滴加液機(jī)構(gòu)由配置電機(jī)的微量泵和設(shè)置于樣本孔上方的定滴頭及配置在定滴頭滴液口處的計(jì)滴器組成；攪拌機(jī)構(gòu)由設(shè)置在樣本轉(zhuǎn)盤下方相應(yīng)位置的攪拌電機(jī)和裝配在攪拌電機(jī)軸上的磁盤及放置于樣本瓶?jī)?nèi)的攪拌棒組成。
以上專利均與酶法測(cè)定無(wú)關(guān)，這從一個(gè)側(cè)面說(shuō)明，國(guó)內(nèi)此方面的實(shí)驗(yàn)研究十分缺乏。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法(Enzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic ColorimetricMethod)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得以測(cè)定二氧化碳濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行二氧化碳濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明二氧化碳濃度測(cè)定方法原理如下 二氧化碳+乙酸+亞鐵細(xì)胞色素b1 丙酮酸脫氫酶 丙酮酸+高鐵細(xì)胞色素b1+水 丙酮酸+輔酶A+輔酶 丙酮酸脫氫酶 二氧化碳+ 乙酰輔酶A+還原型輔酶 這種方法應(yīng)用細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶(cytochrome-dependent pyruvate dehydrogenase；EC 1.2.2.2)酶(偶)聯(lián)輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶(NAD(P)+-dependent pyruvate dehydrogenase；EC1.2.1.51)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶作為作用酶，功能為將二氧化碳酶解產(chǎn)生丙酮酸。輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶作為循環(huán)酶輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶的酶促作用使丙酮酸再次變回二氧化碳，使二氧化碳不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶也同時(shí)作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度上升的速度，可以測(cè)算出二氧化碳的濃度。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A6mmol/L 乙酸 20mmol/L 亞鐵細(xì)胞色素b1 9mmol/L 細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 本發(fā)明的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A。
試劑2 緩沖液、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶。
輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定二氧化碳濃度的方法，其輔酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一種。

具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A6mmol/L 乙酸 20mmol/L 亞鐵細(xì)胞色素b1 9mmol/L 細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧化碳樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出二氧化碳的濃度大小。
實(shí)施例二 本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶 3mmol/L 輔酶A 8mmol/L 乙酸 30mmol/L 亞鐵細(xì)胞色素b1 12mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶12000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶12000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧化碳樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出二氧化碳的濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑1 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 輔酶3mmol/L 輔酶A 12mmol/L 試劑2 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 乙酸10mmol/L 亞鐵細(xì)胞色素b1 6mmol/L 試劑3 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50mmol/L 細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶8000U/L 輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測(cè)定二氧化碳濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度≤0.1，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)二氧化碳樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出二氧化碳的濃度大小。
申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
1.一種酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法的二氧化碳的濃度測(cè)定方法，其方法原理如下
將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度上升的速度，測(cè)算出二氧化碳的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2.一種二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括
緩沖液 20——500mmol/L
穩(wěn)定劑 1——50mmol/L
輔酶 1——6mmol/L
輔酶A1——12mmol/L
乙酸 1——50mmol/L
亞鐵細(xì)胞色素b1 1——20mmol/L
細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶 1000——80000U/L
輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶 1000——80000U/L
其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；
也可以配制成液體試劑，直接使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成單劑試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于
由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、輔酶A組成；試劑2，由緩沖液、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶組成。輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包括穩(wěn)定劑1-4000mmol/L或0.1％-100％體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(PropyleneGlycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴(kuò)增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的二氧化碳診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定二氧化碳濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、乙酸、亞鐵細(xì)胞色素b1、輔酶A、細(xì)胞色素依賴性的丙酮酸脫氫酶、輔酶依賴性的丙酮酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測(cè)算出二氧化碳的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過(guò)紫外/可見光分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果。
文檔編號(hào)G01N33/84GK101169421SQ200610096879
公開日2008年4月30日 申請(qǐng)日期2006年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月24日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司