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專利名稱：：一種eb病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及對(duì)鼻咽癌及其他EB病毒相關(guān)疾病進(jìn)行血清學(xué)診斷的試劑盒及其制備方法，特別是采用特定的EB病毒蛋白作為靶抗原檢測(cè)血清中抗體水平的試劑盒以及EB病毒重組多肽制備酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法。在我國(guó)，幾乎100%四歲以上的人群均已感染了EB病毒，80%以上的健康成人是EB病毒攜帶者。EB病毒攜帶者血清中可以存在一種或2至3種(不是多種，即不是3種以上)低水平的(不是高水平的)抗EB病毒抗體。我國(guó)南方，特別是珠江三角洲及香港地區(qū)，是世界上鼻咽癌的高發(fā)區(qū)，而鼻咽癌的發(fā)生與EB病毒感染密切相關(guān)。我國(guó)南方及香港地區(qū)也是其他EB病毒相關(guān)疾病，例如鼻腔、鼻竇的NK/T細(xì)胞淋巴瘤、肺的淋巴上皮瘤樣癌和傳染性單核細(xì)胞增多癥等的高發(fā)區(qū)。前兩者患者血清EB病毒抗體譜與鼻咽癌患者的類同，而傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清EB病毒抗體的出現(xiàn)有一定的先后規(guī)律性。目前常規(guī)地在臨床上應(yīng)用的血清EB病毒抗體的檢測(cè)(免疫熒光法或免疫酶標(biāo)法)在一定程度上欠客觀性(憑個(gè)人在顯微鏡下計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的百分率)、指標(biāo)較粗(采用幾何級(jí)數(shù)的滴度，例如1:20，1:40，1:80等，尚未采用目前數(shù)碼時(shí)代的十分具體的數(shù)字表示)，且對(duì)EB病毒感染的特征針對(duì)性不強(qiáng)。例如鼻咽癌主要是潛伏感染伴少量溶解性感染，鼻咽癌患者血清中大多具有廣譜的高水平的抗EB病毒抗體，特別是IgA抗體。又例如不能確切地顯示傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清中具特征性的抗體水平(包括p18VCAIgM、低親和性p18VCAIgG、pl8VCAIgG和EBNAlIgG)。酶聯(lián)免疫吸附法可用亍鑒別EB病毒的各種感染狀態(tài)，在血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病時(shí)，具有十分潛在的優(yōu)勢(shì)。目前雖已有采用酶聯(lián)吸附試制盒血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病的研究報(bào)告，但缺乏處理EB病毒抗體水平的一套新方法。如何區(qū)分高、低水平，尚無比較客觀的標(biāo)準(zhǔn)。此外，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法時(shí)，如何克服各批號(hào)之間的差異和采用同一批號(hào)試劑盒每次檢測(cè)之間的差異，目前尚無良方。[
發(fā)明內(nèi)容]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，其優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有客觀性和EB病毒抗原的特異性，它提供了定量檢測(cè)針對(duì)個(gè)體EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗體的亞型。這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)法做不到的，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)法并不能明確抗原的特異性。而且，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用了參考血清，可以糾正每批檢測(cè)間的差異，保證了診斷的可靠性。本發(fā)明選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)最具臨床診斷價(jià)值的EB病毒蛋白(相關(guān)氨基酸序列95%的同源性)為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截，艮P:PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDG腦DEGGDG腦EEGQE以及Zta(BZLF1)蛋白和VCA-pl8蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。采用這三種EB病毒蛋白作為靶抗原，用以檢測(cè)血清中的抗體水平，并通過在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中對(duì)EB病毒蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，創(chuàng)制出診斷試劑盒，從而使重組EB病毒抗原在以下診斷方面得以應(yīng)用-1、EB病毒的原發(fā)性感染；2、確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染；3、鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectiousmononucleosis)和傳染性單核細(xì)胞綜合癥(Infectiousmononucleosissyndrome)54、血清學(xué)協(xié)助診斷疑為鼻咽癌；5、早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)度。這三種蛋白(六種抗體檢測(cè))的試劑盒可以相互互補(bǔ)?？梢詥为?dú)使用，也可以組合使用。例如EBNAl-IgA和Zta-IgG的組合檢測(cè)大大地提高了血清學(xué)診斷鼻咽癌的可靠性。即絕大多數(shù)鼻咽癌患者既呈EBNAl-IgA陽(yáng)性，又呈Zta-IgG陽(yáng)性；少數(shù)鼻咽癌患者即使是EBNAl-IgA陰性，也會(huì)呈Zta-IgG陽(yáng)性。而少數(shù)鼻咽癌患者即使是Zta-IgG陰性，也會(huì)呈EBNAl-IgA陽(yáng)性，兩者有互補(bǔ)作用。許多臨床上疑有鼻咽癌的人，經(jīng)此組合檢測(cè)后，如果EBNAl-IgA和Zta-IgG均為陰性，則90%以上可以有把握地排除是鼻咽癌患者。這對(duì)鼻咽癌高發(fā)區(qū)的醫(yī)院和人群來說，無疑貢獻(xiàn)良多。如何在鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群中早期發(fā)現(xiàn)患者，以便早期治療，獲得最佳的預(yù)后？本試劑盒的組合使用，提供了可能性。同時(shí)做EBNAl-IgA、EBNAl-IgG和Zta-IgG后顯示三者陽(yáng)性是高風(fēng)險(xiǎn)人群；兩者陽(yáng)性是中風(fēng)險(xiǎn)人群；僅單陽(yáng)者是低風(fēng)險(xiǎn)人群。這對(duì)鼻咽癌高發(fā)區(qū)人群早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者，又是一重大貢獻(xiàn)。組合使用本試劑盒也有助于傳染性單核細(xì)胞增多癥的診斷和判別各種類型的EB病毒感染?？傊?，選擇這三種EB病毒蛋白作為試劑盒的耙抗原，不但有單獨(dú)使用的價(jià)值，更是一個(gè)整體性的、具有互補(bǔ)性的設(shè)計(jì)和臨床實(shí)踐(見下表)，可以組合使用，非其他試劑盒可以比擬，具有創(chuàng)新性，應(yīng)獲得權(quán)利保護(hù)。請(qǐng)見下表。f聯(lián)免疫吸附法應(yīng)用于EBNA1-IgAEBNA1-IgGZta-IgAZta-IgGP18VCAIgGP18VCAIgMP18VCAIgG+EBNAl-IgGEBNA1-IgA+Zta-IgG.或EBNA1-IgA+Zta-IgAEBNA1-IgA+EBNAl-IgG+Zta鼻咽癌的血清學(xué)診斷鼻咽癌和傳染性單核細(xì)胞增多癥的血清學(xué)診斷鼻咽癌的血清學(xué)診斷鼻咽癌的血清學(xué)診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥的血清學(xué)診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥急性期的血清學(xué)診斷EB病毒近期感染的血清學(xué)診斷鼻咽癌的血清學(xué)診斷-IgG患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估利用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)克隆、表達(dá)和純化的這三種EB病毒蛋白。融合克隆蛋白的大小分別為-EBNA-l=40Kd;BFRF3=44Kd;BZLFl=53Kd。但披覆在檢測(cè)板上的抗原，已采用凝血酶(Thrombin)法從融合蛋白中脫離，因此是去除了谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的抗原。這就避開了在抗原抗體反應(yīng)時(shí)由谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶所引起的非特異性反應(yīng)。這三種EB病毒蛋白的特征可以概括如下表EB病毒蛋白分子量(氨基酸數(shù))EB病毒基因核苷酸(相當(dāng)坐標(biāo))EBNA140Kd(234)BKRF1705(10917卜109875)Zta53Kd(245)BZLF1738(102210-103155)P18VCA44Kd(176)BFRF3531(61507-62037)圖l:采用ELISA檢測(cè)EBNAl-IgA抗體水平時(shí)血清的稀釋度。圖2:鼻咽癌患者與健康供血者的BNAl-IgA抗體水平比較。圖3:優(yōu)化體外診斷鼻咽癌的EB病毒ELISA法。圖4:血清中具有高水平廣譜的抗體是鼻咽癌患者的一種特異性的特征。圖5:鼻咽癌診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的EB病毒抗體譜。[具體實(shí)施方式]一、EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，包括有陽(yáng)性對(duì)照血清、對(duì)照血清、酶底物、終止反應(yīng)液、稀釋緩沖液、沖洗緩沖液以及EB病毒靶抗原，其中EB病毒蛋白為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLFl)蛋白和VCA-p18蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。試劑盒還包括有相當(dāng)于優(yōu)化臨界光密度值的診斷參考血清。參考血清以靈敏度曲線和特異度曲線交接點(diǎn)的相對(duì)光密度值(rOD)為最佳臨界值。EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒的制備方法，包括重組抗原的制備、純化標(biāo)記、效價(jià)滴定、包被板制備、封閉、干燥及包裝、酶標(biāo)抗體濃縮液制備、稀釋液制備、陽(yáng)性對(duì)照制備、正常對(duì)照制備、參考血清制備、底物分裝、終止液及濃縮液置備等步驟。二、EB病毒蛋白在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中的克隆、表達(dá)和純化2.1選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)的EB病毒蛋白最具臨床診斷價(jià)值的EB病毒蛋白為EBNA1(BKRF1)蛋白的后一截、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-pl8蛋白(即18Kd的VCA或BFRF3蛋白)。因此我們采用這三種EB病毒蛋白作為靶抗原，用以檢測(cè)血清中的抗體水平。2.2三種EB病毒蛋白的制備采用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中克隆、表達(dá)和純化這三種EB病毒蛋白。2.2.1選定這三種EB病毒蛋白在基因庫(kù)(V01555，B95-8細(xì)胞株的序列)中的mRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄酶將之轉(zhuǎn)為cDNA序列。2.2.2設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增該cDNA序列的引物，在引物5，端加BamHI酶切序列(GGATCC)或EcoRI序列(GAATTC),以便在BamHI和EcoRl切割后，將之插入物連結(jié)至質(zhì)粒pGEXDNA(4948bp，AmershamBiosciences)。而引物5，端再加TAG,既有利插入，又經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。2.2.3具體的引物設(shè)計(jì)、序列擴(kuò)增過程2.2.3.1關(guān)于EB病毒EBNA1蛋白(又稱BKRFl蛋白)2.2.3.1.1EBNA-1(BKRF1)引物設(shè)計(jì)5，-TACGGATCCCCTGTAGGGGAAGCCGATTA-3，BamHI5，-TACGAATTCTCACTCCTGCCCTTCCTCCAC-3，EcoRI引物5'端的3個(gè)堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。GGATCC為BamHI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite),GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite)。2.2.3.1.2擴(kuò)增的EBNA-1編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的EBNA1(BKRF1)的核苷酸編碼序列應(yīng)為107950-109875。現(xiàn)在擴(kuò)增的序列為109171-109875。即無需107950-109170甘氨酸(Gly)重復(fù)區(qū)截取的EBNA-1編碼序列。所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的完全一致，共705堿基。以下劃線表示。107950—atgtctgacg;aggggccaggtacaggacctggaaatggcctaggagagaag108061幼ccatggacgaggacgggga卿ggacgaggacgaggaggcgga柳ccaggagccccg108121ggcggctcaggatcagggccaagacatatgagatggtgtccggagaccccaaa祖cgtcca108001ggagacacatct卿cc柳aggctccggcggcagtggacctca幼gaagagggggtgat108061a3CC3tggacgaggacgggg3agaggacgaggacg柳aggcggaagaccagg3gccccg108121ggcggctcaggatcagggccaagacatagagatggtgtccggagaccccaaaaacgtcca108181agttgcattggctgca幼gggacccacggtggaacaggagc鄉(xiāng)agcaggagcgggaggg108241gC3gg3gC3ggaggggcaggagcaggaggaggggcaggagcaggaggaggggcaggaggg鵬01gcaggaggggcaggaggggcaggagcaggaggaggggcaggagcaggagg108361ggggc鄉(xiāng)aggggcaggagcaggaggaggggcaggagcaggaggaggggc108421ggagcaggaggaggggcaggaggggcaggaggggC3gg3gc鄉(xiāng)3ggaggggcaggagca108481ggagg鄉(xiāng)ggcaggaggggcggaggggcaggaggggcagg3ggggC3gg3108541gcaggaggaggggc鄉(xiāng)3gcagg叫g(shù)ggcaggaggggcaggaggggcaggagcaggaggg10卿1gcaggagcaggaggaggggcgg&ggggC3ggagcaggaggggc3ggagca108661ggaggggcaggagcaggaggggcaggagcaggaggggcagg鄉(xiāng)ggC3ggagcaggaggg108721gcaggaggggcaggagcsggaggggcaggaggggcaggagcaggaggaggggC3gg柳g108781gcaggagceLggaggaggggcaggaggggcaggagcaggaggggcaggaggggcaggagca108841ggaggggcaggaggggcaggagcaggaggggcaggaggggcaggagc柳aggaggggca108901ggagcaggagggg(:3gggigcggccggggtcgaggaggcagtggsggccgg108961ggtcgagg叫g(shù)tagtggaggccggggtcgaggaggtagtgg鄉(xiāng)ccgccggggtagagga109021cgtgaaagagccagggggggaagtcgtgaa柳gcc柳ggg卿ggtcgtggacgtgga109081g幼aagaggcccaggagtcccagtagtcagtcatcatcatccgggtctccaccgcgcagg109171109141ccccctccaggtagaaggccatttttccaccctgtaggggaagccgattattttgaatac109201caccaagaaggtggccc柳tggtgagcctgacgtgcccccgggagcgata卿cagggc109261cccgcagatgaccca卿gaaggccc肪gcactggaccccggggtcagggtgatggaggc109321aggcgcaaaaaaggagggtggtttggaaagcatcgtggtcaaggaggttccaacccgaaa109381tttgagaacattgc.柳aggtttaagagctctcctggctaggagtcacgtagaaaggact109441accgacgaaggaacttgggtcgccggtgtgttcgtatatggaggtagtaagacctccctt109501tacaacctaaggcgaggaactgcccttgctattccacaatgtcgtcttacaccatt咖t109561cgtctcccctttggaatggcccctggacccggcccacaacctggcccgctaagggagtcc109621attgtctgttatttcatggtctttttacaaactcatatatttgctgaggttttgaa柳t109681gcgattaaggaccttgttatgac幼agcccgctcctacctgcaatatcagggtgactgtg109741tgcagctttgacgat柳gt柳tttgcctccctggtttccacctatggtggaaggggct109801gccgcggaggstgatgacgg柳tgac卿gatgaa柳ggtgatg咖atgagggtgag109861卿柳caggagtga—109875*:>為終止密碼子2.2.3丄3所翻譯形成的氨基酸序列(aminoacidsequenc)除109873-109875的tga為終止密碼子外，實(shí)際翻譯到234個(gè)氨基酸，以下劃線表示。MSDEGPGTGPGNGLGEKGDTSGPEGSGGSGPQRRGGDNHGRGRGRGRGRGGGRPGAPGGSGSGPRHRDGVRRPQKRPSCIGCKGTHGGTGAGAGAGGAGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGGAGGAGAGGAGAGGGAGGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGGAGAGGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGAGGAGAGGGAGAGGAGAGGGGRGRGGSGGRGRGGSGGRGRGGSGGRRGRGRERARGGSRERARGRGRGRGEKRPRSPSSQSSSSGSPPRRPPPGRRPFFHPVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTCPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLQTHIFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGMAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE2.2.3.2關(guān)于EB病毒Zta(BamHIZirans絲ctivator)或ZEBRA(BamHIZEpstein-BarrReplicationActivator)蛋白或BZLFl蛋白2.2.3.2.1Zta(BZLFl)引物設(shè)計(jì)5'-TACGGATCCATGATGGACCCAAACTCGAC-3'BamHI5'-TACGAATTCTTAGAAATTTAAGAGATCCTC-3'EcoRI引物5'端的3個(gè)堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。GGATCC為BamHI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite),GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite)。2.2.3.2.2擴(kuò)增的Zta編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的Zta(BZLF1)的核苷酸編碼序列應(yīng)為102210-102338,102423-102530，102655-103155三段拼接而成。以下劃線表示。所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的三段拼接而成的序列完全一致，共738堿基。以下劃線表示。102210i102181tgaagcaggcgtggtttcaat幼cgg咖tt戰(zhàn)a幼tttaagagatcctcgtgtaaaaca102241tctggtgtccgggggataatggagtcaacatccaggcttgggcacatctgcttcaac服g102301aggcgcagcctgtcattttcagatgatttggcagcagccacctgcggacaaaaatcaggct102338102361gtttagatggggceitttatgtttgggacgctagccgcctgggcattcgtgttagtatata1024234102421ctgacctcacggtagtgctgcagcagttgcttaaacttggcccggcattttctggaagcct102530102541gggetatgcgtteLCtacELELgtggtgcctagtcagttga幼c犯gccccEiccatccgctgcc102655102601gcccctccatgagccccaccgtccgctgccgcccctccttgagcccctccttaccgattc102661tggctgttgtggtttccgtgtgcgtcgtgccggggcagccactggtgcaggctgtggaac102721accaatgtctgctagctgttgtccttggttagccccggggc犯gc犯acaccactgctgc102781tgctgtttgaacagtagaattgtctccaggtt肪ggtgcttctcccccggcttggttagt102841ctgttrattctgggttatgtcgg柳ctgg咖c柳tgaggtgctgcat卿cttgata102901agcattctcaggagcaggctgaggggcagaaaaccacgacccagtcggagcggttgaaac102961atgataggcagttagctggccttgtggcagaggctctggcagcaccggccacagcacaca103021aggcaaaggagcttgcgatggccctcccaggtcctgatagactctggtagcttggtcaaa103081agcttp:tacaaaaggcacctggtatgggtcaggtgtaaattttacatcttcagaagtcga103141gtttgggtccatcatcttcagcaaagatagcaaaggtggccggcaaggtgcetatgtttagt103155三段拼接而成的序列如下-*〉為終止密碼子ttagaaatttaagagatcctcgtgtaaaacatctggtgtccgggggataatggagtc幼catccaggcttgggcacatctgcttcaacaggaggcgcagcctgtcattttcagatgatttggcagcagcgacctcacggtagtgctgcagcagttgcttaaacttggcccggcattttctggaagccacccgattcttgtatcgctttatttctagttcagaatcgcattcctccagcgattctggCtgttgtggtttCCgtgtgCgtCgtgCCggggC3gCC￡LCtggtgCaggCtgtgg咖accaatgtctgctagctgttgtccttggttagccccggggcaagcaaacaccactgctgctgctgtttgaacagtagaattgtctccaggttgaggtgcttctcccccggcttggttagtctgttgattctgggttatgtcggagactgggaacagctgaggtgctgcat卿cttgataagcattctcaggagcaggctgaggggcagaaaaccacgacccagtcggaigcggttgsLaacatgeitaggcagttagctggccttgtggcagaggctctggcEigcaccggccacagcscacaEtggca犯ggagcttgcgeitggccctcccaggtcctgatagactctggtagcttggtca幼agcttgtacaaaaggcacctggtatgggtcaggtgtaaattttacatcttcagaagtcgagtttgggtcc3tC￡lt2.2.3.2.3所翻譯形成的氨基酸序列(aminoacidsequenc)除102212-102210的taa)為終止密碼子外，實(shí)際翻譯到245個(gè)氨基酸，以下劃線表示。MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPE,AY鋼LFPVSDITQNQQT瞎GEAPQPGDNS雨嵐VVFACPGAN畫LADIGTOAPVMPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF2.2.3.3關(guān)于EB病毒VCA-pl8蛋白(又稱BFRF3蛋白)，即18kd的VCA蛋白2.2.3.3.1VCA-pl8(BFRF3)引物設(shè)計(jì)5，-TACGGATCCATGGCACGCCGGCTGCCCAAG-3，BamHI5，-TACGAATTCCTACTGTTTCTTACGTG-3，EcoRI弓l物5'端的3個(gè)堿基TAC經(jīng)限制性酶消化后不出現(xiàn)在克隆中。GGATCC為BamHI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite),GAATTC則為EcoRI限制性酶切序列(BamHIrestrictionsite)。2.2.3.3.2擴(kuò)增的BFRF3編碼序列(cDNA)B95-8細(xì)胞的BFRF3的核苷酸編碼序列應(yīng)為61507-62037。所克隆的編碼DNA序列與B95-8細(xì)胞的完全一致，共531堿基。以下劃線表示。6150761501cgcgttatggcacgccggctgcccaagcccaccctccaggggaggctggaggcggatttt61561ccagacagtcccctgcttccta幼tttcaagagctgaaccagaataatctccccaatgat61621gtttttcgggaggctcaaagaagttacctggtatttctgacatcccagttctgctacgaa61681gagtacgtgcagaggacttttggggtgcctcggcgccaacgcgccatagacaagaggcag61741agagccagtgtggctggggctggtgctcatgcacaccttggcgggtcatccgccaccccc61801gtccagcaggctcaggccgccgcatccgctgggaccggggccttggcatcatcagcgccg61861tccacggccgta;gcccagtccgcgaccccctctgtttcttcatctattagcagcctccgg61921gccgcgacttcgggggcgactgccgccgcctxcgccgccgcagccgtcgataccgggtca61981ggtggcggggg加:aaccccacgacaccgccccacgcggggcacgt肪g站acagtagaggf6203761507—atggcacgccggctgcccaagcccaccctccaggggaggctggaggcggattttccaggLcagtcccctgcttcctaaatttcaagagctgaaccagaataatctccccaatgatgtttttcgggaggctcaaagaagttacctggtatttctgacatcccagttctgctacgaa咖tscgtgc3g3卿cttttggggtgcctcggcgcc犯cgcgcc3tsg3ca柳ggceigagagccap;tgtggctggggctggtgctcatgcacaccttggcgggtcatccgccacccccgtccagc柳ctcaggccgccgcatccgctgggaccggggccttggcatcatcagcgccgtccacggccgtagcccagtccgcgaccccctctgtttcttcatctattagcagcctccgggccgcgacttcgggggc路ctgccgccgcctccgccgccgcgtgccgtcgataccgggtcaggtggcgggggacaaccccacgacaccgccccacgcggggcacgtaagaaacagtag—62037*〉為終止密碼子2.2.3.3.3所翻譯形成的氨基酸序列(aminoacidsequenc)除62035-620370的tag為終止密碼子外，實(shí)際翻譯到176個(gè)氨基酸，以下劃線表示。MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLLPKFQELNQNNLPNDVFREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGV:PRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGAR鵬總結(jié)關(guān)于EB病毒EBNA1蛋白、Zta蛋白、和VCA-pl8蛋白的基因片段、基因庫(kù)序列大小、擴(kuò)增克隆序列大小和表達(dá)多肽的氨基酸數(shù)如下。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>2.3將PCR擴(kuò)增子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因克隆到EcoRl/BamHI消化的原核細(xì)胞表達(dá)pGEX2T質(zhì)粒載體(Pharmacia,Uppsala,Sweden)上系在一起。采用氯化鈣技術(shù)將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌。加乳糖類似物異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)到了重組質(zhì)粒的大腸桿菌數(shù)小時(shí)，然后收獲細(xì)菌并以去垢triton(—系列有機(jī)的非離子型表面活化劑的商品名)X-100和超聲波裂解細(xì)菌。細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽瓊脂糖4B經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽親和色譜儀純化。純度達(dá)94.0%以上。融合克隆蛋白的大小為EBNA-1=40Kd;BFRF3=44Kd;BZLF1=53Kd。具體步驟如下。2.3.1.cDNA的擴(kuò)增2.3.1.1RNA的制備。2.3.11.1根據(jù)RnaidPlus試劑盒(BIO101)說明書的要求從培養(yǎng)細(xì)胞中分離RNA。采用RNaidPlus試劑盒從懸浮的細(xì)胞中抽提RNA。培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS洗一次，然后每106細(xì)胞加lmlquanidinethiocyanate溶解液，并與vortex混合。再加等容積酸性酚(acidphenol),并混合。力Blmlchloroformisoamylalcohol(BDH)至溶液中，再次混合。溶解產(chǎn)物在冰塊上孵15min后，在4QC下旋轉(zhuǎn)10，000xg20min。將上層轉(zhuǎn)移至一新管，再用1/2容積的chloroformisoamylalcohol(BDH)旋轉(zhuǎn)2min。將上層再轉(zhuǎn)移至一新管。加入15ulRNAMATRIX，并在室溫下孵育5min，孵育中偶加混合，使RNA吸附。RNA/RNAMATRIX復(fù)合物在10,000xg下1min形成小球，在500ix1RNA洗液中洗兩次。小球再次懸浮在30-100ulDiethpyrocarbonate(DEPC，Sigma)處理過的水中。RNA在55GC下洗提5min，并適合于光譜分析。2.3.1.1.2.采用RTPCR擴(kuò)增RNA轉(zhuǎn)錄物。2.3.1.2在BamHI和EcoRl切割后，將插入物連結(jié)至質(zhì)粒pGEXDNA(4948bp，AmershamBiosciences)。2.3.2將連結(jié)產(chǎn)物轉(zhuǎn)至XL1反應(yīng)潛能細(xì)胞。2.3.3采用摘取個(gè)別克隆法使質(zhì)粒小孔化。2.3.4小孔化DNA的限制性酶切。2.3.5從pGEX重組物中篩選融合蛋白表達(dá)。2.3.6SDSPAGE分析。2.3.7采用抗谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抗體做Westernblot。2.3.8大量純化融合蛋白。2.3.9如果需要的話用凝血酶將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白中的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶除去。3.所選三類EB病毒抗原的特點(diǎn)所選三類EB病毒抗原的ELISA法對(duì)測(cè)定EB病毒抗體既敏感、特異、又客觀。表2EB病毒抗原的ELISA法對(duì)測(cè)定EB病毒抗體既敏感、特異、又客觀血清號(hào)EB病毒感染狀態(tài)VCAIgGVCAIgAZtaIgGZtaIgAEBNA1IgGEBNA1IgAN11未感染嬰兒<200未測(cè)定未測(cè)定未測(cè)定<1k未測(cè)定N31傳染性單核細(xì)>3k<100<200<20<1k<100胞增多癥患者M(jìn)IN健康EB病毒>3k<100<200<203k陰性攜帶者PG495取自鼻咽癌>3k1.6k>3k100>6k800患者血清庫(kù)PA196取自鼻咽癌>3k>1.6k>3k400>6k>800患者血清庫(kù)臨界值=所測(cè)血清的平均光密度值/血清空白的平均光密度值=S/N=3為了檢測(cè)ZtaIgA，開始的血清稀釋度是1:20;為了檢測(cè)p18VCAIgA和EBNAlIgA，開始的血清稀釋度是1:100;為了檢測(cè)pl8VCAIgG和ZtalgG，開始的血清稀釋度是1:200;為了檢測(cè)EBNAlIgG，開始的血清稀釋度是1:1000。滴度=高于臨界值的最大血清稀釋從表2可知(1)取自1例從未感染過EB病毒的嬰兒血清(N11)，沒有檢測(cè)到VCAIgG;而在一例傳染性單核細(xì)胞增多癥患者急性感染期所取的血清樣本中(N31)，VCAIgG抗體很早就產(chǎn)生了?？梢詾榱丝陀^地作抗體的定量。(2)在急性時(shí)期的傳染性單核細(xì)胞增多癥患者血清樣本中(N31)無EBNA1IgG抗體。在產(chǎn)生VCAIgG抗體8個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)期后才產(chǎn)生EBNAlIgG(ChanKH等)。(3)因此，同時(shí)出現(xiàn)VCAIgG和EBNA1IgG是過去感染EB病毒的指標(biāo)。(4)與健康攜帶者相對(duì)比，鼻咽癌患者血清中具有廣譜的抗EB病毒抗體。(5)EBNA1IgG的抗體水平高于其他的抗體水平。這說明，EBNA1是EB病毒感染，特別是鼻咽癌患者的一種重要抗原。這也是與EBNA1是寄生在腫瘤細(xì)胞中的EB病毒所表達(dá)的主要抗原相一致的。(6)總之，上述結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫吸附法可用于鑒別EB病毒的各種感染狀態(tài)。(7)所以，針對(duì)EB病毒特異性抗原而創(chuàng)建的酶聯(lián)免疫吸附法，在血清學(xué)診斷EB病毒相關(guān)疾病時(shí)，確實(shí)具有十分潛在優(yōu)勢(shì)的可用性。4.優(yōu)化血清學(xué)診斷鼻咽癌的ELISA法(l)創(chuàng)建了以靈敏度和特異度曲線的交界點(diǎn)為臨界光密度值由于鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗體水平與健康攜帶者血清中抗EB病毒抗體水平有相互重疊，不會(huì)具有能回答"陽(yáng)"或"陰"的絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(見附圖2)，我們所創(chuàng)建的以靈敏度和特異度曲線的交界點(diǎn)為臨界光密度值(見附圖3)的方法，區(qū)分"高"和"低"，就能客觀地反映鼻咽癌患者血清中抗EB病毒抗體的特征。(2)創(chuàng)建了根據(jù)鼻咽癌患者組和健康成人組的滴度曲線確定檢測(cè)血清的稀釋度(見圖1)。表3優(yōu)化血清學(xué)診斷鼻咽癌的ELISA法<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>*根據(jù)74例鼻咽癌患者和81例對(duì)照組的數(shù)據(jù)而得z:抗免疫球蛋白購(gòu)自Zyraed，zG表示ZymedIgG,zA表示ZymedIgA(3)為了診斷標(biāo)準(zhǔn)的判定，在試劑盒中提供一支相當(dāng)于優(yōu)化臨界光密度值的診斷參考血清。這就使使用同一批號(hào)的試劑盒分批檢測(cè)樣本時(shí)，可以糾正每一批檢測(cè)所應(yīng)用的區(qū)分高、低水平的相對(duì)光密度值，得出更精確可靠的數(shù)據(jù)。(4)由于鼻咽癌患者血清中大多具有廣譜的高水平的抗EB病毒抗體，特別是IgA抗體的特征(見圖4)，我們創(chuàng)建了兩步檢測(cè)法，即首先使用EBNAIgA,如屬"高"水平則與進(jìn)行第二步，使用ZtaIgG以診斷，或同時(shí)使同Zta-IgG和EBNAIgG以篩選(見附圖5)?？傊?，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)具有客觀性和EB病毒抗原的特異性，它提供了定量撿測(cè)針對(duì)個(gè)體EB病毒抗原的不同免疫球蛋白抗體的亞型。這種優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)完全是新的，是傳統(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)法做不到的，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的血清學(xué)檢測(cè)法并不能明確抗原的特異性。而且，新的優(yōu)化的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)采用了參考血清，可以糾正每批檢測(cè)間的差異，保證了診斷的可靠性。5.重組EB病毒抗原在診斷方面的應(yīng)用5.1EB病毒的原發(fā)性感染5丄1免疫熒光顯示存在VCA抗體；由于延遲的EBNA抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)，所以采用抗補(bǔ)體免疫熒光顯示無EBNA抗體。5.1.2EBVIgM陽(yáng)性。5丄3低親和性VCAIgG抗體這里要強(qiáng)調(diào)的是:采用熒光免疫(IF)檢測(cè)低親和性VCAIgG不敏感，而采用ELISA則較敏感；采用熒光免疫(IF)檢測(cè)VCAIgM不敏感，而采用ELISA較敏感。為了測(cè)定低親和性VCAIgG抗體，將一系列血清樣本在平行的徽板上起作用。一個(gè)板孔以4M尿素處理30min，而另一個(gè)板孔則不經(jīng)處理。當(dāng)尿素處理引起抗體水平下降4倍或4倍以上時(shí)，則顯示低親和性VCAIgG抗體存在。5.2確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染表4EB病毒各種感染狀態(tài)的抗體譜<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>表5各種EB病毒感染狀態(tài)的鑒別診斷酶聯(lián)免疫吸附法免疫熒光法PCR法EB病毒感染狀態(tài)VCAIgG陽(yáng)性和EBNAIgG陰性低親和性p18VCAIgGVCAIgMEB病毒DNA急性原發(fā)性感染(n=46)近期感染(n=12)過去感染(n=15)未感染(n=8)100%讓0承0林97.8%67.4%80.4%00000.7%0.7%000*所有過去感染過EB病毒的人,經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)VCAIgG和EBNA1IgG,均呈陽(yáng)性。"所有過去未感染過EB病毒的人，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)VCAIgG和EBNAlIgG，均呈陰性。由此可見，由于EBNAIgG要在感染后一段時(shí)間血清抗體才轉(zhuǎn)陽(yáng)，采用傳統(tǒng)的免疫熒光法不能鑒別急性原發(fā)性感染和近期感染；而采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清低親和性p18VCAIgG和VCAIgM，則大多數(shù)急性原發(fā)性感染患者(低親和性pl8VCAIgG為97.8%，VCAIgM為67.49&)可呈陽(yáng)性。即，采用酶聯(lián)免疫吸附法可鑒別急性原發(fā)性感染和近期感染。5.3鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥(Infectiousmononucleosis)和傳染性單核細(xì)胞綜合癥(Infectiousmononucleosissyndrome)5.3.l除癥狀、白細(xì)胞升高(12000-18000)、外周血涂片見不典型CD4T淋巴細(xì)胞、異嗜抗羊紅細(xì)胞抗體(heteophilanti-she印redbloodcellantibodies)、涂片EBERs原位雜交等夕卜。5.3.2首先出現(xiàn)傳染性單核細(xì)胞增多癥的急性表指，即pl8VCAIgM和低親和性VCAIgG，然后是VCAIgG，8個(gè)月后才出現(xiàn)EBNA1IgG。因此未感染EB病毒VCA陰性、EBNAl為陰性。傳染性單核細(xì)胞增多癥VCA陽(yáng)性、EBNAl陰性。健康攜帶者VCA陽(yáng)性、EBNAl陽(yáng)性。VCA陰性、EBNA1為陰性，為未感染EB病毒。因此，采用ELISA法檢測(cè)EBNA1IgG陽(yáng)性和pl8VCAIgM陽(yáng)性則為傳染性單核細(xì)胞增多癥；而傳染性單核細(xì)胞綜合癥則否。5.4血清學(xué)協(xié)助診斷疑為異咽癌5.4.1鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征及血清學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用范圍表6鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征及血清學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用范圍鼻咽癌患者血清EB病毒抗體水平特征血清學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用范圍廣譜的血清EB病毒抗休，特別是IgA的升高1.血清學(xué)診斷鼻咽癌2.人群普査以早期發(fā)現(xiàn)鼻咽癌高拷貝量的血清/血漿中EB病毒DNA1.預(yù)測(cè)治療的療效5.4.2免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法的單獨(dú)使用在香港瑪麗醫(yī)院218例連續(xù)檢測(cè)的血清樣本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤樣癌、23例其他癌和140例其他疾病)作了如下分析。表7免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法單獨(dú)使用的比較檢測(cè)方法鼻咽癌真陽(yáng)性/假陰性對(duì)照組假陽(yáng)性/真陰性舊性預(yù)測(cè)陰性預(yù)測(cè)實(shí)用性免疫熒光VCAIgA51/465/9844%96%排除和(預(yù)測(cè))EAIgA40/155/15889%91%預(yù)測(cè)酶聯(lián)免疫吸附EBNA1IgA46/922/14168%94%(排除)和預(yù)測(cè)ZtalgG41/1428/13559%91%EBVDNA31/243/16091%87%預(yù)測(cè)陽(yáng)性預(yù)測(cè)=真陽(yáng)性/真陽(yáng)性+假陽(yáng)性x100%=A/(A+C)xl00%陰性預(yù)測(cè)=真陰性/假陰性+真陰性x100%=D/(B+D)x脇5.4.3免疫熒光法和酶聯(lián)免疫吸附法的聯(lián)合使用的比較在香港瑪麗醫(yī)院218例連續(xù)檢測(cè)的血清樣本中(51例鼻咽癌、4例鼻咽以外的淋巴上皮瘤樣癌、23例其他癌和140例其他疾病)同樣作了如下分析。表8免疫熒光法聯(lián)合使用在血清學(xué)診斷鼻咽癌方面的比較鼻咽癌組健康成人對(duì)照組舊性預(yù)測(cè)陰性預(yù)測(cè)真陽(yáng)性假陰性假陽(yáng)性真陰性VCAIgA陽(yáng)性+EAIgA陽(yáng)性4015515888.9%VCAIgA陽(yáng)性+EAIgA陰性1144649914.7%VCAIgA陰性+EAIgA陽(yáng)性0550163VCAIgA陰性+EAIgA陰性514899495.9%陽(yáng)性預(yù)測(cè)=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性*假陽(yáng)性)x100%=TP/(TP+FP)40/(40+5)=88.9%11/(11+64)=14.7%陰性預(yù)測(cè)=真陰性/(假陰性+真陰性)xl00%=TN/(TN+FN)94/(94+4)=95.9%值得指出的是，無論是鼻咽癌患者或健康成人，EAIgA陽(yáng)性者中沒有一例呈VCAIgA陰性，這是因?yàn)樗捎玫腂95-8細(xì)胞所產(chǎn)生的"VCA"中既有溶解晚期的抗原，又包含了溶解早期的抗原。所以，在免疫熒光法中所采用的VCAIgA的抗原特異性與EAIgA的抗原特異性相互重疊了。也就是說，雖然聯(lián)合使用了兩種免疫熒光法，卻不能達(dá)到"1+1=2"的作用，即互補(bǔ)作用不強(qiáng)。而且，VCAIgA和EAIgA雙陰性98中，4例為假陰性，假陰性率達(dá)4.1%(4/4+94),并不能在臨床上起到有效的排除診斷鼻咽癌的作用。以下所述酶聯(lián)免疫吸附法的聯(lián)合使用卻可以克服這一缺點(diǎn)。5.4.4先做酶聯(lián)免疫吸附法的EBNA1IgA，再做免疫熒光VCAIgA表9<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表io酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合使用的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>陽(yáng)性預(yù)測(cè)=真陽(yáng)性/(真陽(yáng)性+假陽(yáng)性)x100%=TP/(TP+FP)33/(33+5)=88.8%13/(13+17)=43.3%8/(8+25)=陰性預(yù)測(cè)=真陰性/(假陰性+真陰性)xl00%=TN/(TN+FN)116/(1+116)=比較后可知，酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合使用(EBNAlIgA+ZtaIgG)的陰性預(yù)測(cè)值(99.1%)大大高于免疫熒光法聯(lián)合使用(VCAIgA+EAIgA)，即臨床上聯(lián)合使用EBNAIgA和ZtaIgG時(shí)，如果是雙陰性，則排除鼻咽癌診斷的可靠性達(dá)99.1%。兩種酶聯(lián)免疫吸附法聯(lián)合檢測(cè)在血清學(xué)診斷鼻咽癌時(shí)具有很強(qiáng)的互補(bǔ)作用。5.4.5采用免疫熒光和采用酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷鼻咽癌之間的關(guān)聯(lián)表11采用免疫熒光和采用酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷鼻咽癌之間的關(guān)聯(lián)免疫熒光血清學(xué)診斷酶聯(lián)免疫吸附血清學(xué)診斷百分率5.4.6酶聯(lián)免疫吸附聯(lián)合應(yīng)用的血清學(xué)診斷鼻咽癌的預(yù)測(cè)和排除表12<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>5.5早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估患募咽癌的風(fēng)險(xiǎn)度聯(lián)合應(yīng)用EBNAlIgA、EBNAlIgG和ZtaIgG顯示優(yōu)勢(shì)比大大增高。表13聯(lián)合應(yīng)用EBNAlIgA、EBNAlIgG和ZtaIgG顯示優(yōu)勢(shì)比大大增高<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(14.0%，140/1000)認(rèn)為具有患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)度。在這140人中4人(2.86%，4/140)認(rèn)為具有高風(fēng)險(xiǎn)度；40人(28.57%,40/140)認(rèn)為具有中等風(fēng)險(xiǎn)度；96人(68.57%，96/140)認(rèn)為具有微風(fēng)險(xiǎn)度。860人EBNAlIgA低，未進(jìn)一步做Zta-IgG和EBNAlIgG，認(rèn)為無風(fēng)險(xiǎn)度。另香港某私人機(jī)構(gòu)篩查了香港居民2000人，發(fā)現(xiàn)6例具有高風(fēng)險(xiǎn)度的人，其中1人證實(shí)為鼻咽癌忠患者，經(jīng)治療后5年無復(fù)發(fā);所有其他人均未患鼻咽癌。5.6協(xié)助診斷Burkitt淋巴瘤應(yīng)用ZtalgGl。兩個(gè)層次的篩査笫一層次EBNAIgA笫二層次ZtalgG+EBNAIgG表14早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)度的兩個(gè)層次的篩査/1000EBNA1IgAEBNA1IgGZtaIgG風(fēng)險(xiǎn)度水平相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度隨訪138疑為鼻咽癌9宜監(jiān)護(hù)的風(fēng)險(xiǎn)度4宜監(jiān)護(hù)的風(fēng)險(xiǎn)度0.3微風(fēng)險(xiǎn)度0.2不必在意高中中低低高低高低，高高低低未高高高.H低646129EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法序列表(SEQUENCELISTING)<110>香港神農(nóng)有限公司(SinocloneLimited')<120〉EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒及其制備方法<130>EBVSerologicalDiagnositicKits〈160〉6<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211〉705<212>DNA<213>Epstein-BarrVirus<400〉1cctgtaggggaagccgattattttgaataccaccaagasggtggCCC3g3tggtgagcct60gacgtgcccccgggagcgat3gagcagggccccgcagatgacccaggagasggcccaagc120actggaccccggggtcagggtgatggaggcaggcgc犯aaaaggagggtggtttgg扁g180catxgtggtcaaggaggttctttgagaacaUgc柳3ggtttaagagct240ctcctggctaggagtcacgtagaaaggactaccgacgaagg認(rèn)ttgggtcgccggtgtg300ttcgtatatggaggtagtaagacctccctttacaacctaaggcgaggaactgcccttgct360attccacsatgtcgtcttacaccattgagtcgtctcccctttggaatggcccctggaccc420ggcccacascctggcccgctaagggagtccattgtctgttatttcatggtctttttacaa480actcatatatUgctgaggttUgaaggatgCg3U33ggaccttgttatgacaaagccc540gctcctacctgcaa城cagggtgactgtgtgcagctttgacgatggagtagatttgcct600ccctggtttccacctatggtgg犯ggggctgccgcggagggtgatgacgg卿tg3CggSL660gatgaaggaggtgatggagatgagggtgaggaagggcaggagtga705<210〉2<211〉234<212>PRT<213〉Epstein-BarrVirus〈400〉2ProValGlyGluAlaAspTyrPheGluTyrHisGinGluGlyGlyPro151015AspGlyGluProAspValProProGlyAlalieGluGinGlyProAla202530AspAspPi-oGlyGluGlyProSerThrGlyProArgGlyGinGlyAsp354045GlyGlyArgArgLysLysGlyGlyTrpPheGlyILysHisArgGlyGin505560GlyGlySerAsnProLysPheGluAsnlieAlaGluGlyLeuArgAla657b7580LeuLeuAlaArgSerHisValGluArgThrThrAspGluGlyThrTrp859095ValAlaGlvValPheValTyrGlvGlySerLysThrSerLeuTvrAsn100ioS110LeuArgArgGlyThrAlaLeuAlalieProGinCysArgLeuThrPro115120125LeuSerAi'gLeuProPheGlyMetAlaProGlyProGlyProGinPro130135140GlyProLeuArgGluSerlieValCysTyrPheMetValPheLeuGin145150155160ThrHisliePheAlaGluValLeuLysAspAlalieLysAspLeuVal165170175MetThrLysProAlaProThrCysAsnlieArgValThrValCysSer180185i90'PheAspAspG1yValAspLeuProProTrpPheProProMetValGlu195200205GlyAlaAlaAlaGluGlyAspAspGlyAspAspGlyAspGluGlyGly210215220AspGlyAspGluGlyGluGluGlyGinGlu225230<210〉3〈211〉531〈212>腿〈213>Epstein-BarrVirus<400>3atggcacgccggctgcccaagcccaccctccaggggaggc:tggaggcggattttccagac60agtcccctgcttcctaaatttcaagagctgaaccagaataatctccccaatgatgttttt120cgggaggctcaaagELEigttacctggtatttctgacatcccagttctgctacg犯gagtac180gtgcagaggaCtUtggggtgcctcggcgccaacgcgccatagacaagaggc柳gagcc240agtgtggctggggctggtgctcatgcacaccttggcgggt:catccgccacccccgtccag300caggctcaggccgccgcatccgctgggaccggggccttggcatcatcagcgccgtccacg360gccgtagcccagtccgcgaccccctctgtttcttcatctattagcagcctccgggccgcg420acttcgggggcgactgccgccgcctccgccgccgcagccgtcgataccgggtcaggtggc480gggggacaaccccsicgscaccgccccacgcggggcacgtaagaaacagtag531<210〉4<211〉176<2i2〉PRT<213>Epstein-BarrVirus<400〉4MetAlaArgArgLeuProLysProThrLeuGinGlyArgLeuGluAla151015AspPheProAspSerProLeuLeuProLysPheGinGluLeuAsnGin202530AsnAsnLeuProAsnAspValPheArgGluAlaGinArgSerTyrLeu354045ValPheUuThrSerGinPheCvsTyrGluGluTyrValGinArgThr50556bPheG1yValProArgArgGinArgAlalieAspLysArgGinArgAla65707580Sei'ValAlaGlyAlaGlyAlaHisAlaHisLeuGlyGlySerSerAla859095ThrProVaiGinGinAlaGinAlaAlaAlaSerAlaGlyThrG1yAla100105110LeuAlaSerSerAlaProSerThrAlaVaiAlaGinSerAlaThrPro115120125SerValSerSerSerlieSerSerLeu八rgAlaAlaThrSerGlyAla130135140ThrAlaAlaAlaSerAlaAlaAlaAlaValAspThrGlySerGlyGly14515015516bGlyGlyGinProHisAspThrAlaProArgGlyAlaArgLysLysGin165170175<210〉5<211〉738<212>DNA<213>Epst,ein-BarrVirus〈400〉5atgatggacccaaactcgacttctgaagatgtaaaatUacacctgacccataccaggtg60ccttttgtac犯gcttttgaccaagctaccagagtctatcaggacctgggagggccatcg120caagctcctttgccUgtgtgctgtggccggtgctgccagagcctctgccacaaggccag180ctaactgcctatcatgtttcaaccgctccgactgggtcgtggttttctgcccctcagcct240gctcctgagaatgcttatcaagcttatgcagcacctcag(:tgttcccagtctccgacata300acccagaatcccaagccgggggag犯g匿ctcaacctggagacaattxt360actgttcaaacagcagcELgcagtggtgtttgcttgccccggggctaaccaagg3caacag420ctagcagacattggtgttccacagcctgcaccagtggctgccccggcacgacgcacacgg480aaaccaic犯cagccagaatcgttggaggaatgcgattctgaaagcgatac540aagaatcgggtggcttccagsaaatgccgggccaagtttaagcaactgctgcagcactac600cgtgaggtggctgctgccaaatcatctgaa犯tgacagg(:tgcgcctcctgttgaagcag660atgtgcccaagcctggatgttgactccattatcccccggacaccagatgttttacacgag720gatctcttaaatttctaa738<210>6<211〉245<212〉PRT<213〉Epstein-BarrVirus<400>6MetMetAsp1ProAsnSer5ThrSerGluAspValLysPheThrProAsp1015Pro丁yrGinValProPheValGinAlaPheAspGinAlaThrArgVal202530TyrGinAspLeuGlyGlyProSerGinAlaProLeuProCysValLeu354045TrpProValLeuProGluProLeuProGinGlyGinLeuThrAlaTyr505560HisValSerThrAlaProThrGlySerTrpPheSerAlaProGinPro65707580AlaProGluAsnAlaTyrGinAlaTyrAlaAlaProGinLeuPhePro859095ValSerAsplieThrGinAsnGinGinThrAsnGinAlaGlyGlyGlu100105110AlaProGinProGlyAspAsnSerThrValGinThrAlaAlaAlaVal115120125ValPheAlaCysProGlyAlaAsnGinGlyGlriGinLeuAlaAsplie130135140GlyValProGinProAlaProValAlaAlaProAlaArgArgThrArg145150155160LysProGinGinProGluSerLeuGluGluCysAspSerGluLeuGlu165170175lieLysArgTyrLysAsnArgValAlaSerArgLysCysArgAlaLys180185190PheLysGinLeuLeuGinHisTyrArgGluValAlaAlaAlaLysSer195200205SerGluAsnAspArgLeuArgLeuLeuLeuLys,GinMetCysProSer210215220LeuAspValAspSerlielieProArgThrProAspValLeuHisGlu225230AspLeuLeuAsnPhe245235240權(quán)利要求1、一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒，包括有陽(yáng)性對(duì)照血清、陰性對(duì)照血清、酶底物、終止反應(yīng)液、稀釋緩沖液、沖洗緩沖液以及EB病毒靶抗原，其特征在于EB病毒靶抗原蛋白為EBNA1蛋白、Zta蛋白和VCA-p18蛋白，其中所述的Zta蛋白的氨基酸序列為MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYMPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTAMWFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF。2、一種EB病毒蛋白酶聯(lián)免疫吸附診斷試劑盒的制備方法，包括EB病毒重組抗原的制備、純化標(biāo)記、效價(jià)滴定、包被板制備、封閉、干燥及包裝、酶標(biāo)抗體濃縮液制備、稀釋液制備、陽(yáng)性對(duì)照制備、正常對(duì)照制備、底物分裝、終止液及濃縮液制備等步驟，其特征在于它還包括參考血清的制備，其中EB病毒蛋白重組抗原的制備為A、選定EBNA1蛋白的后一截，艮卩PVGEADYFEYHQEGGPDGEPDVPPGAIEQGPADDPGEGPSTGPRGQGDGGRRKKGGWFGKHRGQGGSNPKFENIAEGLRALLARSHVERTTDEGTWVAGVFVYGGSKTSLYNLRRGTALAIPQCRLTPLSRLPFGMAPGPGPQPGPLRESIVCYFMVFLgmiFAEVLKDAIKDLVMTKPAPTCNIRVTVCSFDDGVDLPPWFPPMVEGAAAEGDDGDDGDEGGDGDEGEEGQE和Zta蛋白序列，艮卩MMDPNSTSEDVKFTPDPYQVPFVQAFDQATRVYQDLGGPSQAPLPCVLWPVLPEPLPQGQLTAYHVSTAPTGSWFSAPQPAPENAYQAYAAPQLFPVSDITQNQQTNQAGGEAPQPGDNSTVQTMAVVFACPGANQGQQLADIGVPQPAPVAAPARRTRKPQQPESLEECDSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL,CPSL畫SI證P亂服DLLNF以及VCA-p18蛋白序列，艮卩MARRLPKPTLQGRLEADFPDSPLL,PKFQELNQNNLPNDyPREAQRSYLVFLTSQFCYEEYVQRTFGVPRRQRAIDKRQRASVAGAGAHAHLGGSSATPVQQAQAAASAGTGALASSAPSTAVAQSATPSVSSSISSLRAATSGATAAASAAAAVDTGSGGGGQPHDTAPRGAR卿這三種EB病毒蛋白在基因庫(kù)中的mRNA序列，逆轉(zhuǎn)錄酶將之轉(zhuǎn)為cDNA序列；B、設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增該cDNA序列的引物、進(jìn)行序列擴(kuò)增；C、將PCR擴(kuò)增子與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因克隆到EcoRl/BamHI消化的原核細(xì)胞表達(dá)PGEX2T質(zhì)粒載體上，將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌，誘導(dǎo)已經(jīng)轉(zhuǎn)到了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，然后收獲并裂解細(xì)菌，細(xì)菌裂解產(chǎn)物經(jīng)離心后除去碎片而澄清，含融合蛋白的上清液采用谷胱甘肽瓊脂糖4B經(jīng)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶-谷胱甘肽親和色譜儀純化。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒的制備方法，其特征在于EBNA-1引物設(shè)計(jì)為:5，-TACGGATCCCCTGTAGGGGAAGCCGATTA-3'BamHI5，-TACGAATTCTCACTCCTGCCCTTCCTCCAC-3'EcoRI4、根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒的制備方法，其特征在于Zta引物設(shè)計(jì)為5'-TACGGATCCATGATGGACCCAAACTCGAC-3'BamHI5'-TACGMTTCTTAGMATTTAAGAGATCCTC-3，EcoRI5、根據(jù)權(quán)利要求2所述試劑盒的制備方法，其特征在于VCA-p18引物設(shè)計(jì)為5'-TACGGATCCATGGCACGCCGGCTGCCCAAG-3'BaraHI5'-TACGMTTCCTACTGTTTCTTACGTG-3'EcoRI全文摘要本發(fā)明涉及采用特定的EB病毒蛋白作為靶抗原檢測(cè)血清中抗體水平的試劑盒以及EB病毒重組多肽制備酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的方法。選擇血清學(xué)診斷鼻咽癌(或傳染性單核細(xì)胞增多癥)最具臨床診斷價(jià)值的EB病毒蛋白EBNA1(BKRF1)蛋白、Zta(BZLF1)蛋白和VCA-p18蛋白作為靶抗原，用以檢測(cè)血清中的抗體水平，并通過在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因融合系統(tǒng)中對(duì)EB病毒蛋白進(jìn)行克隆、表達(dá)和純化，創(chuàng)制出診斷試劑盒，從而使重組EB病毒抗原在EB病毒的原發(fā)性感染、確立EB病毒感染的抗體譜和鑒別診斷各種EB病毒感染、鑒別傳染性單核細(xì)胞增多癥和傳染性單核細(xì)胞綜合癥、協(xié)助診斷疑為鼻咽癌、早期發(fā)現(xiàn)和評(píng)估患鼻咽癌的風(fēng)險(xiǎn)度等診斷方面得以應(yīng)用。文檔編號(hào)G01N33/535GK101144817SQ200610079938公開日2008年3月19日申請(qǐng)日期2003年8月20日優(yōu)先權(quán)日2003年8月20日發(fā)明者吳子柏,吳文翰,陳國(guó)雄,陳泓霖申請(qǐng)人:香港神農(nóng)有限公司