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專利名稱：基于限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的熒光生物傳感方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明屬于一種檢測(cè)有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的生物傳感技術(shù)，其具體是 指，限制性內(nèi)切酶Fokl 二聚體形成條件以及抑制位點(diǎn)的選擇，中間修飾有機(jī)小分子的寡核 苷酸DNA鏈與蛋白的相互作用，限制性內(nèi)切酶Fokl抑制分析，和基于T叫man探針的實(shí)時(shí)熒 光定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用、藥物與化學(xué)毒素等有機(jī)小分子以及小分子結(jié)合 蛋白的快速篩查與檢測(cè)對(duì)于臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、食品與公共安全、藥物篩選、環(huán)境監(jiān)測(cè)等 領(lǐng)域具有極其重要的意義。目前常用的有機(jī)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的檢測(cè)技術(shù)主要有 表面等離子共振、酶互補(bǔ)片斷免疫分析以及熒光各向異性分析等。這些檢測(cè)技術(shù)靈敏度不 高、可靠性差，且需要精密的儀器，不能滿足準(zhǔn)確快速檢測(cè)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提出了一種基于限制性 內(nèi)切酶FokI抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的生物傳感方法，此方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單， 僅需設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)且包含有限制性內(nèi)切酶Fokl識(shí)別位點(diǎn)的寡核苷酸DNA鏈和Taqman探針 即可，在其中間抑制位點(diǎn)進(jìn)行小分子標(biāo)記后即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，此方法可實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)， 并且操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏。 本發(fā)明的技術(shù)方案是，所述基于限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合 蛋白相互作用的生物傳感方法為利用包含有中間修飾有機(jī)小分子的寡核苷酸DNA雙鏈與 蛋白相互作用后對(duì)限制性內(nèi)切酶Fokl抑制，通過(guò)T叫man探針的熒光實(shí)時(shí)變化，定量分析檢 測(cè)小分子與蛋白的相互作用以及小分子或其結(jié)合蛋白。
以下對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明 所述基于限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的熒光生 物傳感方法包括 (1)包含中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA雙鏈與蛋白的相互作用及限制性內(nèi) 切酶FokI抑制分析； (2)形成限制性內(nèi)切酶Fokl 二聚體，選擇抑制位點(diǎn)； (3)采用基于T叫man探針的實(shí)時(shí)熒光定量方法進(jìn)行限制性內(nèi)切酶Fokl抑制分析 的定量檢測(cè)。 以下對(duì)本發(fā)明做出進(jìn)一步說(shuō)明。 所述包含中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA雙鏈與蛋白相互作用的檢測(cè)及限 制性內(nèi)切酶Fokl抑制分析采用以下步驟實(shí)現(xiàn) 對(duì)于小分子與其結(jié)合蛋白的相互作用，檢測(cè)步驟是取所述有機(jī)小分子修飾的含有限制性內(nèi)切酶FokI的寡核苷酸DNA單鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中；再于微量管 中加入包含小分子結(jié)合蛋白的樣品溶液；然后加入限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)，得抑制反應(yīng)的 產(chǎn)物； 對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)的步驟是取所述有機(jī)小分子修飾的 含有限制性內(nèi)切酶FokI的寡核苷酸DNA單鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中；再加入包 含待測(cè)小分子的樣品溶液，混合均勻后加入小分子結(jié)合蛋白或單克隆抗體溶液；再加入限 制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)，得抑制反應(yīng)的產(chǎn)物。 限制性內(nèi)切酶Fokl 二聚體抑制位點(diǎn)選擇Fokl識(shí)別位點(diǎn)上游5個(gè)堿基和下游3個(gè) 堿基中的任意一個(gè)。 所述限制性內(nèi)切酶抑制的定量檢測(cè)可采用標(biāo)準(zhǔn)的T叫man探針熒光實(shí)時(shí)定量檢 本發(fā)明中，所述寡核苷酸DNA單鏈的中間有機(jī)小分子的修飾通過(guò)現(xiàn)有的交聯(lián)反應(yīng) 技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，對(duì)于帶有羧基的有機(jī)小分子，可以采用1-乙基_3- (3- 二甲基氨丙基)_碳 二亞胺與琥珀酰亞胺交聯(lián)反應(yīng)技術(shù)與中間堿基NH2標(biāo)記的包含限制性內(nèi)切酶Fokl識(shí)別位 點(diǎn)的寡核苷酸DNA單鏈進(jìn)行交聯(lián)；對(duì)于帶氨基的有機(jī)小分子，可以采用4- (N-馬來(lái)酰亞胺基 甲基)環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯的交聯(lián)反應(yīng)技術(shù)與中間標(biāo)記有巰基的寡核苷酸DNA單 鏈進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物可用透析純化。 進(jìn)一步地，本發(fā)明中，所述中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA鏈與蛋白的相互 作用的檢測(cè)及限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析采用以下步驟實(shí)現(xiàn) a.對(duì)于小分子與其結(jié)合蛋白的相互作用的檢測(cè)的步驟是取5iU上述小分子修 飾寡核苷酸DNA鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中，加入3iU 10X限制性內(nèi)切酶FokI 反應(yīng)緩沖溶液(50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT，pH 7. [email protected]°C )，然后加入 8yl包含小分子結(jié)合蛋白的樣品溶液，在37t:恒溫反應(yīng)0.5小時(shí)，再加入3ia限制性內(nèi)切 酶Fokl和6 ill Taqman探針，置于37。C反應(yīng)2h后，升溫至65。C反應(yīng)20min進(jìn)行熱滅活以 終止酶反應(yīng)。 b.對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)的步驟是取5 ill上述小分子修飾 寡核苷酸DNA鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中，3iU 10X限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)緩 沖溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT， pH 7. [email protected]°C )，然后加入5ii 1 包含待測(cè)小分子的樣品溶液，混合均勻后加入一定濃度的小分子的結(jié)合蛋白或(鼠源)單 克隆抗體溶液3 1，單克隆抗體終濃度為加入的小分子修飾寡核苷酸DNA鏈濃度的5倍； 在37"恒溫反應(yīng)0. 5小時(shí)，再加入3 ii 1限制性內(nèi)切酶Fokl和6 ill Taqman探針，置于37 °C 反應(yīng)2h后，升溫至65t:反應(yīng)20min進(jìn)行熱滅活以終止酶反應(yīng)。 注意，以上反應(yīng)條件為最優(yōu)條件，所述溶液體積均可成倍變化不改變最優(yōu)結(jié)果。改 變比例或試劑加入順序可使被酶切的Taqman探針效率在1% 100%內(nèi)變化。
本發(fā)明中，所述限制性內(nèi)切酶FokI抑制的定量檢測(cè)可采用標(biāo)準(zhǔn)的Taqman探針，以 下是用Taqman探針對(duì)限制性內(nèi)切酶抑制定量檢測(cè)步驟 用lx限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)緩沖溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl， 10mM MgCl， ImM DTT，pH 7. [email protected]°C )將反應(yīng)最終產(chǎn)物稀釋到120 iU，轉(zhuǎn)移到微量石英杯中，放入熒光光 譜儀，以495nm為激發(fā)波長(zhǎng)，518nm為發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度。
本發(fā)明提出了一種基于限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析的方法，此方法設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，僅 需設(shè)計(jì)一對(duì)包含有限制性內(nèi)切酶Fokl識(shí)別位點(diǎn)的互補(bǔ)鏈和T叫man探針即可，在其中間抑 制位點(diǎn)進(jìn)行小分子標(biāo)記，即可實(shí)現(xiàn)檢測(cè)；它也可直接用于小分子結(jié)合蛋白的檢測(cè)，還可通過(guò) 樣品溶液中小分子與小分子標(biāo)記的寡核苷酸DNA鏈競(jìng)爭(zhēng)與抗體結(jié)合間接檢測(cè)有機(jī)小分子， 其操作快速簡(jiǎn)便、靈敏特異，可望為臨床診斷、藥物研發(fā)、藥毒物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等提供一個(gè) 通用技術(shù)平臺(tái)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :基于限制性內(nèi)切酶Fokl抑制分析檢測(cè)生物素 1)中間氨基標(biāo)記的寡核苷酸DNA鏈和生物素(biotin)的交聯(lián) 稱取6. lmg的生物素溶于2. 5mL磷酸緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加
入lmg的1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌15min，再加入
2. 8mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，在室溫反應(yīng)30min。取260 活化后的生物素溶液加入到 260 ii 1濃度為10 ii M的中間氨基標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCT ATATATGGATGAAT(NH2)CAAC)的溶液中，在輕微攪拌下室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)后在混合液中加入
3. 6mg鹽酸羥胺終止反應(yīng)。 把交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量為6000D。把透析管放
入500ml磷酸鹽緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4"透析12h，每隔3h更換一次透
析液，最后一次用超純水透析。透析之后的寡核苷酸DNA單鏈分管保存于-20°C的冰箱中備
用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA單鏈用滅菌水稀釋10倍并保存于4t:冰箱中作為次
級(jí)儲(chǔ)備液備用。 2)生物素的檢測(cè) 取5 ill上述生物素標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈次級(jí)儲(chǔ)備液和5 y 1互補(bǔ)鏈的儲(chǔ)備液 于微量管中，加入3iU的10X限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)緩沖溶液(50mM Tris-HCl， lOOmM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT， pH 7. [email protected]°C )混合均勻，升溫至95°C反應(yīng)5min，緩慢降溫至 37t:反應(yīng)lh，再加入5 ii 1待檢測(cè)的生物素樣品溶液，混合均勻后加入3 ii 1濃度為640nM的 鏈霉親和素(str印tavidin)，室溫反應(yīng)15min，反應(yīng)后加入3 yl限制性內(nèi)切酶Fokl (NEB公 司產(chǎn)品)和6 iil T叫man探針在37"酶切2h后，升溫至65"反應(yīng)20min進(jìn)行熱滅活以終 止酶反應(yīng)。加入lx限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)緩沖溶液(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl，10mM MgCl，lmMDTT， pH 7. [email protected]°C )將反應(yīng)混合液稀釋至120ul，轉(zhuǎn)移到微量石英杯中，放入熒光 光譜儀，以495nm為激發(fā)波長(zhǎng)，518nm為發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度。
實(shí)施例2 :基于限制性內(nèi)切酶抑制分析檢測(cè)葉酸結(jié)合蛋白
1)中間氨基標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈和葉酸的交聯(lián)稱取10mg的葉酸溶于2. 5mL磷酸緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)，再加入lmg的
1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)_碳二亞胺(EDC)，在室溫下攪拌15min，再加入2. 8mg N-羥 基琥珀酰亞胺(NHS)，在室溫反應(yīng)30mm。取260 yl活化后的葉酸溶液加入到260 y 1濃度 為10 ii M的中間氨基標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈(GAACAACAACCAACATCCAAACTTCTATATATGGAT GAAT (NH2) CAAC)的溶液中，在輕微攪拌下室溫反應(yīng)2h。反應(yīng)后在混合液中加入3. 6mg鹽酸 羥胺終止反應(yīng)。
把交聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物移到lmL的透析管中，透析管的截留分子量為6000D。把透析管放 入500ml磷酸鹽緩沖溶液(0. 1M NaH2P04， pH 7. 4)中在4"透析12h，每隔3h更換一次透 析液，最后一次用超純水透析。透析之后的寡核苷酸DNA單鏈分管保存于-20°C的冰箱中備 用。上述的-2(TC保存的寡核苷酸DNA單鏈用滅菌水稀釋10倍并保存于4t:冰箱中作為次 級(jí)儲(chǔ)備液備用。以上所有的反應(yīng)均在遮光的條件下進(jìn)行。
2)葉酸結(jié)合蛋白的檢測(cè) 取5 iU上述葉酸標(biāo)記的寡核苷酸DNA單鏈次級(jí)儲(chǔ)備液和5 y 1其互補(bǔ)鏈的儲(chǔ) 備液于微量管中，加入3iU的10X限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)緩沖溶液混合均勻，(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl，10mM MgCl，lmM DTT，pH 7. [email protected]°C )，升溫至95。C反應(yīng)5min，緩慢降 溫至37t:反應(yīng)lh，再加入5 iU待檢測(cè)的葉酸結(jié)合蛋白樣品溶液，室溫反應(yīng)15min，反應(yīng)后加 入3 iil限制性內(nèi)切酶Fokl (NEB公司產(chǎn)品)和6 iil T叫man探針在37。C酶切2h后，升溫至 65t:反應(yīng)20min進(jìn)行熱滅活以終止酶反應(yīng)。在此微量管中加入lx限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng) 緩沖溶液(50mM Tris-HCl， 100mM NaCl， 10mM MgCl， lmM DTT，pH 7. [email protected]°C )稀釋至120ul， 混合均勻。轉(zhuǎn)移到微量石英杯中，放入熒光光譜儀，以495nm為激發(fā)波長(zhǎng)，518nm為發(fā)射波 長(zhǎng)，測(cè)其熒光信號(hào)強(qiáng)度。
權(quán)利要求
一種基于限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的熒光生物傳感方法，包括(1)包含中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA雙鏈與蛋白的相互作用及限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析；(2)形成限制性內(nèi)切酶FokI二聚體，選擇抑制位點(diǎn)；(3)采用基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光定量方法進(jìn)行限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析的定量檢測(cè)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于限制性內(nèi)切酶FokI酶切抑制分析檢測(cè)小分子與其結(jié)合蛋 白相互作用的熒光生物傳感方法，其特征是，所述中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA雙 鏈與蛋白的相互作用的檢測(cè)及限制性內(nèi)切酶FokI抑制分析為對(duì)于小分子與其結(jié)合蛋白的相互作用，檢測(cè)步驟是取所述有機(jī)小分子修飾的含有限 制性內(nèi)切酶FokI的寡核苷酸DNA單鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中；再于微量管中 加入包含小分子結(jié)合蛋白的樣品溶液；然后加入限制性內(nèi)切酶FokI反應(yīng)，得抑制反應(yīng)的產(chǎn) 物；對(duì)于有機(jī)小分子的檢測(cè)，采用競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)檢測(cè)步驟取所述有機(jī)小分子修飾的含有限制 性內(nèi)切酶FokI的寡核苷酸DNA單鏈與其互補(bǔ)鏈的雜交液置于微量管中；再加入包含待測(cè)小 分子的樣品溶液，混合均勻后加入小分子結(jié)合蛋白或單克隆抗體溶液；再加入核酸外切酶 I，得抑制反應(yīng)的產(chǎn)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于限制性內(nèi)切酶Fokl酶切抑制分析檢測(cè)小分子與其結(jié)合蛋 白相互作用的熒光生物傳感方法，其特征是，限制性內(nèi)切酶FokI 二聚體抑制位點(diǎn)選擇FokI 識(shí)別位點(diǎn)上游5個(gè)堿基和下游3個(gè)堿基中的任意一個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明為一種基于限制性內(nèi)切酶抑制分析檢測(cè)小分子與結(jié)合蛋白相互作用的熒光生物傳感方法，包括中間有機(jī)小分子修飾的寡核苷酸DNA鏈與蛋白的相互作用、限制性內(nèi)切酶FokI二聚體形成條件及抑制位點(diǎn)選擇、基于Taqman探針的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)技術(shù)。它利用寡核苷酸DNA鏈中間修飾的小分子和其結(jié)合蛋白或抗體的特異性結(jié)合，基于小分子與蛋白或抗體相互作用對(duì)限制性內(nèi)切酶FokI酶切的抑制作用，通過(guò)對(duì)被酶切的Taqman探針熒光實(shí)時(shí)定量分析來(lái)檢測(cè)小分子與蛋白相互作用及小分子或其結(jié)合蛋白。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，可用于生物醫(yī)學(xué)中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與分子調(diào)控機(jī)理研究、食品與農(nóng)產(chǎn)品安全檢測(cè)、環(huán)境毒物檢測(cè)、藥物篩選等。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101717824SQ20091022702
公開日2010年6月2日 申請(qǐng)日期2009年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者俞汝勤, 楚霞, 沈國(guó)勵(lì), 甄珍, 蔣健暉 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)