專利名稱：：酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒及其檢測方法
技術領域：
：本發明屬于生物樣品中草酸含量的檢測分析領域，特別涉及一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
：草酸是自然界中廣泛存在的一種有機羧酸，多是以草酸鹽的形式存在，是生物體生長過程中的一種代謝產物。草酸的代謝生成主要源自于三羧酸的循環和乙醛酸的循環。草酸能夠與體內的一些金屬離子絡合形成化合物。在生物體內，草酸水平過高形成草酸鹽積累會對生物體產生一定的毒性。例如在一些植物(豆類、番茄、向日葵等)中，草酸鹽的積累會導致植物營養缺失、生長停滯等相關癥狀。已有的研究表明，草酸不僅對植物有害而且對包括人類在內的幾乎所有生物都有毒害作用。在人類和其它脊椎動物中，由于草酸鹽的積累易產生尿結石、腎結石、高草酸尿、低血鈣癥、維生素B6缺乏等癥狀。人體內的草酸既是甘氨酸和維生素C的代謝產物，也可以經由食物(如菠菜、莧菜、白菜及茶葉等)攝入。體內草酸過多易患多種疾病，一方面由于草酸只能經腎臟隨尿液排泄，當體內草酸含量超標時，易引起腎臟負擔過重導致器官功能發生病變紊亂，如引起高草酸尿癥(PrimaryHyperoxaluriatypel，PHI)、腎衰竭等病；另一方面，由于Ca++、Mg++等多種金屬離子和其它稀有元素與草酸根離子螯合形成鹽或絡合物，從而導致^及一些微量元素從體內流失，進而產生低血*丐癥、維生素B6缺乏癥、尿結石等多種疾病。在一些工業生產中，由于草酸絡合金屬離子產生沉積，造成堵塞管道、篩孔等現象。如制漿造紙以及啤酒工業經常會遇到這些問題。因此，人們在應用實踐中需要檢測一些不同來源樣品的草酸含量，如在食品中檢測草酸含量以對人民健康負責，在工業樣品中檢測草酸含量以判斷引起管道和篩孔堵塞的臨界草酸濃度。目前檢測草酸的手段主要有滴定法、原子吸收法、比色法、高壓液相色譜法、離子色譜法、毛細管電泳法、酶法及酶_電極法。滴定法建立最早，作為一種經典方法至今仍在食品分析中廣泛應用，但發展不大，毛細管電泳靈敏度高，操作也較簡便，但該儀器尚未普及。高效液相色譜法(HPLC)靈敏度高，重復性好，操作簡便，快捷，但分離過程中無機酸的干擾較嚴重，且儀器昂貴，對操作人員的要求較高，普及困難，難以大范圍使用，尤其是在一線工業生產或食品生產廠家使用。艾玉玲等在專利200710021171中公布了一種化學顯色比色法測定雙草酸硼酸鋰中草酸含量，該方法靈敏度低，操作較繁瑣、耗時的缺陷沒有改善。比色法廉價、靈敏度高，但預沉淀操作難于完全將草酸提取出來，操作繁瑣且重復性較差。酶法及酶_電極法檢測草酸簡便快速，靈敏度高，選擇性好，回收率高，將酶法的放大作用、良好選擇性與電極法的快速簡便有機的結合了起來，是一種很有前途的檢測方法。綜合比較可知，高效液相色譜法與酶法及酶_電極法是兩種較有前途的草酸檢測方法。目前的酶法及酶-電極法均是利用草酸氧化酶(Oxalateoxidase)催化草酸與氧氣生成二氧化碳和過氧化氫的特性，通過檢測氧氣的消耗量，或二氧化碳、過氧化氫的生成量來定量測定草酸。草酸氧化酶主要存在于植物中，譬如菠菜、辣椒葉、甜菜葉與莖、高粱根莖葉、大麥苗和根以及小麥苗等，玉米的根和莖等中，其中以大麥苗中的含量最高，因此目前大麥源的草酸氧化酶使用最頻繁。在該酶法檢測中，通常Cl—、N03—、SCN—及一些陽離子等會抑制酶活力，干擾測定結果。王爾中在專利200710024719.9、200710024720.1、200710024721.6、200710024722.0、200710024723.5、200710024724.X、200710024725.4中公布了一種草酸氧化酶比色法及酶聯法技術的草酸診斷/測定試劑盒，靈敏度高，選擇性好，回收率高，將酶法的放大作用、良好選擇性與電極法的快速簡便有機地結合了起來。酶法及酶-電極法簡便、精確度高，是目前測定草酸的經典方法。但是由于該技術所用的草酸氧化酶造價較高，該法的大范圍推廣應用受到了很大限制。該法的大規模推廣應用將有待于草酸氧化酶高效低成本制備技術的突破。因此急需尋找一種可替代該經典方法，且耗時短、價格較便宜、精確度和重現性高、操作簡單方便的測定草酸的切實可行的分析方法。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒及其檢測方法，該檢測試劑盒具有靈敏度高，穩定性強，操作方便，使用試劑及設備成本低，可測定多種不同來源的樣品，應用范圍廣，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度高，有很好的實用性。所述的緩沖溶液B為100-200mM磷酸-磷酸氫二鹽緩沖液、巴比妥鹽_鹽酸緩沖液Jris-鹽酸緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液、甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液、硼砂_氫氧化鈉緩沖液或者其它緩沖液，緩沖溶液B的pH為9.09.5，離子強度100-200mM;所述的緩沖溶液C為含20-200mM磷酸氫二鹽_檸檬酸、檸檬酸_檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、甘氨酸_鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸_鹽酸緩沖液、檸檬酸_氫氧化鈉_鹽酸緩沖液或者其它緩沖液，緩沖溶液C的pH為1.55.6，離子強度20-200mM。本發明的一種生物樣品中草酸含量的檢測方法，包括如下步驟(1)待測樣品的前處理將待測樣品與上述緩沖溶液A按體積比1:15混合配成混合液，檢查pH是否在5.010.0，如果不是，用酸和堿將pH調至5.010.0，加入與混合液0.050.5g/mL的活性碳共混220min，期間偶爾攪動或旋轉混勻一下，再經抽濾或離心10-30min，去除酶反應抑制物和干擾物，得上清液；(2)草酸脫羧酶催化草酸生成甲酸反應體系的構建空白樣品的準備量取0.3mL上述緩沖溶液C，0.lmL經前處理的待測樣品溶液，混合備用；待測樣品的準備量取0.3mL上述緩沖溶液C，0.lmL經前處理的待測樣品溶液，混合備用；第一步草酸脫羧酶催化草酸生成甲酸反應體系，經前處理的待測樣品通過加入0.lmL酶活>0.8U/mL的草酸脫羧酶啟動反應(總體積為0.5mL);空白樣品則不加入草酸脫羧酶(總體積為O.4mL)，反應pH為1.5-4.5，反應溫度為15-60°C，反應時間為20-60min;(3)第二反應體系將輔酶I(NAD+)溶于緩沖溶液B中，配成9.35mg/mL的溶液D;空白樣品組在第一步反應體系的酶催化反應空白樣品液中加入2.OmL上述溶液D和0.55mL去離子水；待測樣品組在第一步反應體系的酶催化反應待測樣品液中加入2.OmL上述溶液D和0.45mL去離子水；第二反應體系總體積為2.95mL，混合l_5min后，于340nm處分別讀取吸光值A工；[OO37](4)第三反應體系空白樣品組在第二步反應體系中加入0.05mL甲酸脫氫酶，混合后在15-6(TC的水浴中反應15-60min，于340nm處讀取樣品的吸收值A2，計算AAee=A廠Ai;待測樣品組在第二步反應體系中加入0.05mL甲酸脫氫酶，混合后在15_60°C的水浴中反應15-60min，于340nm處讀取樣品的吸收值(A2)，計算AA樣品二A2-A！;計算AA340=AA樣品AA空白.(A2-A》樣品-(VA》空白(5)根據以下計算公式計算得到樣品中草酸的含』VxMsxdxvx1000-反應最終體積，3[mL]公式(Dv——待測樣品體積，0.1[mL]d——光路直徑1[cm]-NADH的吸收系數:340nm=6.3[LXmmol—1Xcm—"AA,AA樣品AA空白.(A2-A》樣品-(VA》空白本發明的草酸酶偶聯分光光度法測定原理反應式如下草酸(草酸鹽)靴纖氣甲斷甲酸鹽)+C02(反應式D甲酸脫氧酸甲酸(甲酸鹽)+NAD+十H20-^重碳酸(重碳酸鹽)+NADH+H+(反應式2)草酸脫羧酶是一種含錳的酶，該酶能催化草酸(或草酸鹽)分解產生甲酸(甲酸鹽)和二氧化碳(見反應式l);生成的甲酸在輔酶I(NAD+)存在下，被甲酸脫氫酶完全氧化為重碳酸鹽，NAD+則被還原為NADH(反應式2)，而NADH在340nm處有一最大吸光值。具體操作步驟見表l，表1酶偶聯紫外分光光度法測定步驟反應體系反應試劑樣品空白待測樣品緩沖溶液C(mL)0.300.30第一反應體系待測樣品溶液(mL，v)草酸脫羧酶(mL,>0.8U/mL)0.100.100.10混合后在15-60'C的水浴中反應20-60min,然后加入下面試劑啟動反應；輔酶I的溶液D(mL)2.002.00第二反應體系去離子水(mL)0.550.45混合2min后在340nm處讀取它的吸光值(A!),然后加入下面試劑啟動反應；甲酸脫氫酶(mL，>40U/mL)0.050.05第.三反應體系混合后在15-60'C的水浴中反應15-60min,在340nm處馬上讀取樣品的吸收值(A2)AA34o=AA樣品陽厶A空白AA空白=A2-Ai草酸脫羧酶(oxalatedecarboxylase,0xDC，EC4.1.1.2)主要存在于木材腐朽真菌中，尤其是白腐菌，有關這方面的研究已有大量報道。在褐腐菌Postiaplacenta以及軟腐菌Aspergillusniger禾口Aspergillusphoenicis中也曾有過報道。在其它真菌中，迄今為止報道相對較少。后來又有人在豚鼠(天竺鼠)的肝臟中發現該酶，其它動物的肝臟中則未見報道。最近，有研究發現枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis在低pH值環境下也可以誘導合成草酸脫羧酶。洪楓等在專利200710040314.4中公開了一種高效低成本生產草酸脫羧酶的技術方法，降低了該酶的生產和應用成本，可以使其快速產業化。本發明首次將草酸脫羧酶與分光光度計偶聯來測定樣品中草酸含量，可將多種不同來源樣品制成液體(比如各種蔬菜提取液，水果提取液、尿液、血液以及不同工業的廢水等)測定，應用范圍廣，由于這些液體中都存在酶抑制物或其它干擾物，因此在樣品的前處理中，添加活性碳吸附劑及EDTA來處理脫毒，以提高測定方法的準確性、穩定性和靈敏度。有益效果本發明的檢測試劑盒具有靈敏度高，穩定性強，操作方便，使用試劑及設備成本低，可測定多種不同來源的樣品，應用范圍廣，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度高，有很好的實用性。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明7而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1不同來源的草酸樣品的前處理(1)樣品的準備將新鮮的蔬菜洗凈、晾干去除表面的水份，準確稱取一定量的蔬菜放入榨汁機中充分粉碎成糊狀，取出樣品進行離心得到上清液，用20%的鹽酸或10M的NaOH調節pH值至4.06.0的范圍內，然后放入冰箱保存；—份24h的尿液樣品被收集在含有lOmL濃鹽酸的容器中，計量體積后置于冰箱保存；(2)樣品前處理取出前面準備好的蔬菜樣品，以1:3的體積比例與pH值為7.0的50mM磷酸氫二鈉_檸檬酸緩沖液混合，以PH計測定pH值的大小，如果偏離緩沖液自身pH值7.0，則用鹽酸或Na0H溶液調節至pH7.0，然后加入活性碳吸附劑(200g/L)處理5min，抽濾或在12，000rpm轉速下離心20min后得到上清液。利用經典的HPLC法測蔬菜樣品中草酸濃度，得知經活性碳吸附劑處理后草酸回收率大于95%。以pH值7.0，含20mMEDTA的50mM磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液按1:1的體積比將保存的尿液稀釋，以pH計測定pH值的大小，如果偏離緩沖液自身pH值7.0，則用鹽酸或Na0H溶液調節至pH7.O，然后加入活性碳吸附劑(200g/L)處理5min。濾紙抽濾或在12，000rpm轉速下離心20min后得到上清液。利用經典的HPLC法測得尿液樣品中草酸的回收率大于95%。實施例2由于蔬菜樣品中含有酶抑制或其它干擾物，所以必須對樣品進行前處理。本實驗先以白菜汁為模型，進行前處理的研究，實驗結果見表2。表2顯示，未處理的白菜汁樣品測得的草酸含量最小，以水稀釋8倍后，測定值從6.lmmol/L上升到了39.lmmol/L，說明稀釋的方法能夠減少測定的干擾因素。樣品經活性碳吸附劑處理后發現測定值有較大的提高，表明吸附劑能夠吸附一部分干擾物質，改善了酶反應效果。結合使用上面兩種處理方法，即水稀釋法加上吸附劑處理，得到的結果比單獨使用一種處理方法要好許多，測定值達到了42.4mmol/L，但是與HPLC測得的實際草酸含量45.8mmol/L仍存在一定偏差。在前面處理方法的基礎上，通過往樣品中添加EDTA至終濃度為20mM，獲得了較滿意的測定結果，測得的數據46.lmmol/L與HPLC的測定結果45.8mmol/L非常接近，表明蔬菜汁可能存在可以抑制酶反應的金屬離子，EDTA螯合了這些金屬離子，改善了酶反應。表2紫外分光光度法測定處理后樣品白菜中草酸含量8<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注所用白菜汁中含草酸45.8mmol/L(HPLC法)。實施例3不同蔬菜中草酸含量的測定(以公認的HPLC經典方法測定的結果為對照)以實施例1中的蔬菜汁為測試樣品，按表3中的實驗步驟測定草酸，表3實驗步驟<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>按表3的實驗步驟測得AA，后，根據下列公式計算蔬菜汁樣品中的草酸含]<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>V——反應最終體積，3[mL]v——反應樣品體積，0.1[mL]d——光路直徑[cm]e——NADH的吸收系數340nm<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>測定結果見下表4:表4<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注HPLC測試前不需吸附劑預處理。從表中可以看出酶偶聯分光光度法與HPLC法所測結果相近，重現性好，同時酶偶聯分光光度法對設備及操作要求不高，有利于大范圍推廣應用。實施例4尿液中草酸含量的測定(以公認的HPLC經典方法測定的結果為對照)以實施例1中的尿液為測試樣品，按表5中的實驗歩驟測定草酸，表5實驗步驟反應試劑樣品空白待測樣品50mM，pH5.0醋酸緩沖液(mL)0.30待測尿液樣品溶液(mL)(v)0-10草酸脫羧酶(mL,>0.8U/mL)_混合后在35'C的水浴中反應30min，然后加入下面試劑啟動反應；0.300.100.10輔酶I的溶液D(mL)去離子水(mL)混合2min后在340nm處讀取它的吸光值(Ai)2.002.000.550.45然后加入下面試劑啟動反應；甲酸脫氫酶(mL，>40U/mL)0.050.05混合后在25'C的水浴中反應20min。在340nm處馬上讀取樣品的吸收值(A2)AA34o=AA樣品-AA空白AA空白=A2-Ai厶A樣品=A2-A!按表5的實驗步驟測得AA，后，根據公式1計算蔬菜汁樣品中的草酸含〗測定結果見下表6:表6樣品酶偶聯分光光度法(mmol/L)HPLC(mmol/L)未處理吸附劑處理后尿液i00.410.39尿液200.260.28尿液300.150.1210權利要求一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒，包括(1)樣品前處理試劑盒活性碳吸附劑0.1～1g；緩沖溶液A2～10mL；以上所述的藥品和試劑的用量只針對2mL待測樣品；(2)樣品反應試劑盒，包括草酸脫羧酶，酶活＞0.8U/mL0.1mL×2；輔酶I，即NAD+18.7mg×2緩沖溶液B2.0mL×2；緩沖溶液C0.3mL×2甲酸脫氫酶，酶活＞40U/mL0.05mL×2；0.2-1.0mM草酸標準品2.0mL；以上所述的藥品和試劑的用量僅針對1份0.1mL樣品和1份空白對照。2.根據權利要求1所述的一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒，其特征在于所述的緩沖溶液A為含0-50mM的EDTA的20-100mM磷酸-磷酸氫二鹽、磷酸氫二鹽-磷酸二氫鹽、磷酸氫二鹽_檸檬酸緩沖液、磷酸二氫鹽_氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鹽_鹽酸緩沖液Jris-鹽酸緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液、甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液、硼砂_氫氧化鈉緩沖液，緩沖溶液A的pH為5.010.0，離子強度20-100mM。3.根據權利要求1所述的一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒，其特征在于所述的緩沖溶液B為100-200mM磷酸-磷酸氫二鹽緩沖液、巴比妥鹽_鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、硼酸_硼砂緩沖液、甘氨酸_氫氧化鈉緩沖液、硼砂_氫氧化鈉緩沖液，緩沖溶液B的pH為9.09.5，離子強度100-200mM。4.根據權利要求1所述的一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒，其特征在于所述的緩沖溶液C為含20-200mM磷酸氫二鹽-檸檬酸、檸檬酸_檸檬酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、甘氨酸_鹽酸緩沖液、鄰苯二甲酸_鹽酸緩沖液、檸檬酸_氫氧化鈉_鹽酸緩沖液，緩沖溶液C的pH為1.55.6，離子強度20-200mM。5.根據權利要求1所述的試劑盒用于生物樣品中草酸含量的檢測方法，包括如下步驟(1)待測樣品的前處理將待測樣品與上述緩沖溶液A按體積比1:15混合配成混合液，用酸或堿將pH調至5.010.O，加入與混合液0.050.5g/mL的活性碳共混220min，期間偶爾攪動或旋轉混勻一下，再經抽濾或離心10-30min，去除酶反應抑制物和干擾物，得上清液；(2)草酸脫羧酶催化草酸生成甲酸反應體系的構建空白樣品的準備量取O.3mL上述緩沖溶液C，0.lmL經前處理的待測樣品溶液，混合備用；待測樣品的準備量取O.3mL上述緩沖溶液C，0.lmL經前處理的待測樣品溶液，混合備用；第一步草酸脫羧酶催化草酸生成甲酸反應體系，經前處理的待測樣品通過加入0.lmL酶活>0.8U/mL的草酸脫羧酶啟動反應，總體積為0.5mL;空白樣品則不加入草酸脫羧酶，總體積為0.4mL，反應pH為1.5-4.5，反應溫度為15_60°C，反應時間為20_60min;(3)第二反應體系將輔酶I溶于緩沖溶液B中，配成9.35mg/mL的溶液D;空白樣品組在第一步反應體系的酶催化反應空白樣品液中加入2.0mL上述溶液D和0.55mL去離子水；待測樣品組在第一步反應體系的酶催化反應待測樣品液中加入2.OmL上述溶液D和0.45mL去離子水；第二反應體系總體積為2.95mL，混合l-5min后，于340nm處分別讀取吸光值^;(4)第三反應體系空白樣品組在第二步反應體系中加入0.05mL甲酸脫氫酶，混合后在15-6(TC的水浴中反應15-60min，于340nm處讀取樣品的吸收值A2;待測樣品組在第二步反應體系中加入0.05mL甲酸脫氫酶，混合后在15-6(TC的水浴中反應15-60min，于340nm處讀取樣品的吸收值A2;(5)根據測得的吸收值計算得到樣品中草酸的含量。全文摘要本發明涉及一種酶偶聯法測定生物樣品中草酸含量的試劑盒，包括樣品前處理試劑盒及樣品反應試劑盒；其檢測步驟包括待測樣品先經前處理，去除酶反應抑制物和干擾物；在處理后的樣品溶液中添加草酸脫羧酶，于15-60℃反應20-60min；加入輔酶I的溶液和去離子水，測定吸光值A1；再加入甲酸脫氫酶反應15-60min，測定反應液的吸光值A2；另做一空白樣品進行對照，最后根據測得的吸收值計算得出草酸的含量。本發明的檢測試劑盒具有靈敏度高，穩定性強，操作方便，使用試劑及設備成本低，可測定多種不同來源的樣品，應用范圍廣，與其它市售的測定草酸的試劑盒相比精確度高，有很好的實用性。文檔編號G01N21/31GK101788488SQ20101002284公開日2010年7月28日申請日期2010年1月15日優先權日2010年1月15日發明者曹張軍,楊光,洪楓申請人:東華大學
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