專利名稱：丙型肝炎五項指標集成檢測反應板和蛋白芯片試劑盒的制作方法
技術領域：
本實用新型屬于體外臨床檢驗和生物芯片技術領域，確切地說，是一種適于丙型肝炎五項指標(抗-HCVCORE、抗-HCVNS3、抗-HCVNS4、抗-HCVNS5、抗-HCV總)集成檢測的反應板和試劑盒背景技術丙型肝炎是危害人類健康的一種世界性傳染病，建立準確、快速、操作方便的丙肝檢測系統已迫在眉睫。
目前檢測丙型肝炎的方法主要有三個途徑1、用PCR檢測HCV基因；2、用單克隆抗體等檢測HCV抗原；3、用酶標法、蛋白印染法等檢測抗-HCV，以檢測血清中抗HCV抗體的酶標法較為普遍常用的檢測抗-HCV的診斷試劑盒是應用EIA間接法原理，以HCV抗原包被酶標板，用酶標記的抗人IgG作為第二抗體，經酶底物(POD或TMB)顯色后，根據顏色的深淺進行陰陽性判斷。該方法中所包被的抗原的組成和質量為關鍵因素。
目前出產的第三代抗-HCV ELISAKit幾乎都是檢測混合抗體。即包被的抗原是由丙肝核心、NS3、NS4、NS5等重組在一起的抗原，因此，只具初篩作用，確診需加做確證實驗，而目前只有RIBA3能用于確診實驗，可檢測HCV的各個分片段抗體。但RIBA3非常昂貴，操作時間長且繁瑣，盡管特異性好，靈敏度稍遜，不適于常規檢測。因此，本領域迫切需要尋找一種新的方法，既可檢測HCV總抗體，又可檢測HCV分片段抗體，同時，該方法克服上述方法的缺點，集高效、準確、價廉、操作簡便快速于一體。
發明內容
本實用新型的目的就是提供一種可同時檢測血清或血漿中的丙型肝炎病毒總抗體(HCV總)和分片段抗體(HCVCORE抗體、HCVNS3抗體、HCVNS4抗體、HCVNS5抗體)共五項指標，具有HCV感染的初篩和檢測分片段抗體雙重功能，并充分說明HCV感染的狀況的丙型肝炎診斷試劑盒。
在本實用新型的第一方面，提供了一種丙肝五項集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括5-200個樣本孔，1-3個陰性對照孔，1-5個陽性質控孔。其中，其特征在于每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5及它們的混合特異抗原HCV總共五項丙型肝炎病毒抗原組成的微點陣，每一反應孔內設有一個定位基準點。
在一優選例中，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
在另一優選例中，所述樣本孔的數量為1-197個。
在另一優選例中，所述的HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5及它們的混合特異抗原HCV總五項丙型肝炎病毒抗原在固相載體上各有2個點樣點。
在另一優選例中，所述反應孔每孔設有一個定位基準點。
在本實用新型的第二方面，提供了一種丙肝五項集成檢測試劑盒，它包括本實用新型上述的丙肝五項集成檢測反應板。
在另一優選例中，還包括酶標工作液、檢測液、陰性對照、陽性對照品。
在另一優選例中，所述的酶標工作液由兔抗人酶標抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫兩種試劑組成，使用前混合。
在另一優選例中，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
圖1是本實用新型一種固相載體上丙肝抗原的點樣示意圖圖2是本實用新型的反應孔中進行的各抗原——抗體反應的示意圖具體實施方式
丙肝五項集成檢測的關鍵和難點是，檢測的靈敏度和特異性直接關系到結果的準確可靠，本實用新型經過深入而廣泛的研究，對檢測反應板作了改進，在本實用新型應用微點陣檢測技術，結合酶免疫間接法和化學發光檢測技術，大大提高了檢測的靈敏度和特異性，從而解決了上述問題。
具體而言，為提高丙肝五項(HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總)的檢測效率，本實用新型應用微點陣檢測技術，結合酶免疫間接法和化學發光檢測技術設計了一種丙肝五項集成檢測反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括5-200個樣本孔，1-3個陰性對照孔，1-3個陽性質控孔，其中，其特征在于每一反應孔的底部平面上有固相載體，且在固相載體上包被著HCVcore、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原的蛋白質微點陣。
各反應孔的數量沒有特別限制，通常樣本孔為5-200個，較佳地5-50個。陰性對照孔為1-3個，較佳地2-3個。陽性質控孔為為1-5個，較佳地2-3個。
在本實用新型中，反應孔的形狀和大小沒有特別限制，可以是圓形、方形、六角形、橢圓形、或其他形狀。大小通常為直徑0.5-5cm，深度為0.5-2cm。
在本實用新型中，反應板基板的材料可以選用本領域常用的各種材料，較佳的基板材料包括玻璃、塑料、陶瓷等。
在本實用新型中，包被丙肝抗原的固相載體可以選用本領域常用的各種固相載體，包括(但并不限于)玻璃片、塑料、硝酸纖維(NC)膜、PDVF膜等，較佳的固相載體包括NC膜、PDVF膜。
在固相載體上，HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原各有1-3個點樣點，較佳地2個點樣點。此外，較佳地在固相載體上還包括一個定位點(見圖1)。各點樣點之間的距離通常為0.1-5mm。
另一方面，本實用新型還提供了一種丙肝五項集成檢測蛋白芯片試劑盒，該試劑盒可實現多指標并行化、微型化、高通量檢測。它包括本實用新型的反應孔板、洗滌液、酶標工作液、檢測液(A、B)、陰性對照、陽性質控品等。其中，酶標工作液液由HRP標記的兔抗人抗體組成，檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物，使用前混合。
在本實用新型中，各指標的檢測采用酶免間接法，檢測原理如圖2所示。詳細敘述如下1)將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。封閉，除去未結合的位點。
2)加稀釋的受檢血清其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
3)加酶標抗抗體，與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。
4)加底物固相上的酶催化底物，化學發光，CCD檢測，光強度代表標本中受檢抗體的量本實用新型巧妙地綜合利用了蛋白質微點陣檢測技術，酶免疫間接法和化學發光檢測技術，實現了丙型肝炎感染五種指標的同時檢測。
下面結合具體實施例，進一步闡述本實用新型。應理解，這些實施例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1檢測反應板的制備取48孔板，設置42個樣本孔，3個陰性對照孔，3個陽性質控孔。在每個反應孔的底部放置一固相載體(NC膜或PDVF膜等所有適合的膜)，且在固相載體上包被著HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原的蛋白質微列陣(圖1)。
實施例2試劑盒制備制備含一丙型肝炎五項指標集成檢測的試劑盒，它含有實施例1的反應孔板一塊(24-48人份)，洗滌濃縮液1瓶，酶標工作液1瓶，檢測液A一瓶，檢測液B一瓶，陽性對照一瓶，陰性對照一瓶。
洗滌濃縮液、酶標工作液、檢測液A、檢測液B實施例3丙型肝炎五項指標集成檢測按以下方法對各測試血請樣品進行檢測1.加經稀釋的待檢測血請或陰性對照、陽性對照品于相應反應孔內，150ul/孔。
2.37℃保溫振蕩反應30分鐘。
3.用洗液洗滌4-6次，每次0-2分鐘，振動。
4.每孔加酶標工作液50-200ul。
5.用洗液洗滌4-6次，每次0-2分鐘，振動。
6.加檢測液10-50ul/孔，使檢測液均勻分布于孔的底部。
7、CCD檢測，視發光信號強度曝光120秒。
結果判定依據不同指標的CutOff值，參考陰性對照和陽性質控空，判定樣品血清的陰陽性。
與此同時，用常規方法對測試的血清樣品進行常規檢測。結果表明，用本實用新型的試劑盒得出的測試結果比常規方法更加準確。
在本實用新型提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本實用新型的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本實用新型作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權力要求書所限定的范圍。
權利要求1.一種丙肝五項集成檢測反應板，其特征在于，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括5-200個樣本孔，1-3個陰性對照孔，1-5個陽性質控孔，其中，每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原的微點陣，在每一反應孔內還設有一定位基準點。
2.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的固相載體是NC膜、或PDVF膜。
3.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述樣本孔的數量為1-197個。
4.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，所述的HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原在固相載體上各有2個點樣點。
5.如權利要求1所述的反應板，其特征在于，在每一反應孔內還設有一定位基準點。
6.一種丙肝五項集成檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，它包括反應板，反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括5-200個樣本孔，1-3個陰性對照孔，1-5個陽性質控孔，其中，每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HCVCORE、HCVNS3、HCVNS4、HCVNS5、HCV總五種抗原的微點陣，在每一反應孔內還設有一定位基準點。。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，還包括酶標工作液和檢測液、陰性對照、陽性對照品。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標工作液由HRP標記的兔抗人抗體組成，所述的檢測液由發光物和過氧化氫二種試劑組成，使用前混合。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的發光物為魯米諾、異魯米諾或其衍生物。
專利摘要本實用新型涉及丙型肝炎五項指標集成檢測反應板和蛋白芯片試劑盒。所述的反應孔板包括基板和位于基板上的反應孔，所述的反應孔包括5－200個樣本孔，1－3個陰性對照孔，1－5個陽性質控孔，其中，每一反應孔的底部有固相載體，且在固相載體上包被著HCV
文檔編號G01N33/535GK2777543SQ20052003976
公開日2006年5月3日 申請日期2005年2月24日 優先權日2005年2月24日
發明者穆海東 申請人:穆海東
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
