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專利名稱：一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于獸藥鹽酸克倫特羅殘留的檢測試紙。
背景技術(shù)：
鹽酸克倫特羅(Clenbuterol)縮寫為CL，俗稱瘦肉精，是一種人工合成的腎上腺素神經(jīng)興奮劑，屬β-興奮劑類激素。克倫特羅從化學(xué)性質(zhì)上看是苯乙醇胺的衍生物，其分子結(jié)構(gòu)與腎上腺髓質(zhì)等處分沁的腎上腺方去甲腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類相似。在生理上，它能抑制糖原合成酸并激活磷四化酶，從而加速糖原分解，提高血糖和精代謝率；通過作用于脂肪組織，可提高激素敏感脹酶活性，加速脂肪分解，提高血液中游離脂肪酸濃度，促進(jìn)其在肌肉組織中的氧化分解，增加心率、心血輸出量、心縮壓，提高骨骼肌，冠狀動脈和肝臟等局部血流量。在動物體內(nèi)代謝上，利用它具有促進(jìn)畜禽脂肪分解、增加肌肉生長作用，為增加瘦肉產(chǎn)量而添加于飼料生產(chǎn)中。入食用了飼喂克倫特羅這種添加劑的動物所生產(chǎn)的畜產(chǎn)品后，由于畜產(chǎn)品中殘留的克倫特羅會引起中毒，用量超標(biāo)人體會產(chǎn)生心悸、嘔吐、肌肉不自主震顫等癥狀，甚至有生命危險，長期過量攝入會積蓄中毒，還有導(dǎo)致染色體畸變的可能。我國政府已明文規(guī)定在畜牧生產(chǎn)中嚴(yán)禁使用克倫特羅等β-興奮劑。
目前，測定動物組織中的克倫羅的方法有高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)等。以上所述色譜分析方法通常繁瑣，樣品前處理過程復(fù)雜，靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，工作量大，檢測設(shè)備昂貴，并要求有專業(yè)的技術(shù)人員及較長的分析周期，不適合大批量樣品的檢測與分析。酶聯(lián)免疫吸附法方法制成的試劑盒需要冷藏，運(yùn)輸不變，同時也需要有專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作。由于以上原因，當(dāng)前迫切希望有一種靈敏度高，特異性強(qiáng)，簡便易行，價格低廉的方法，能在野外或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)進(jìn)行檢測，且不需要對工作人員進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn)。
免疫分析為鹽酸克倫特羅的殘留檢測提供了一個新的分析檢測途徑。目前已有鹽酸克倫特羅免疫分析方法的報道，但要將免疫分析方法運(yùn)用到實(shí)際中，還需要將其研制成試紙。現(xiàn)已有利用免疫膠體金方法制成試紙，授權(quán)專利02101928.2鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條；授權(quán)專利02228104.5鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條(II)；授權(quán)專利02202033.0鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條；授權(quán)專利200320117280.1克倫特羅快速半定量檢測試紙；公開專利02139704.X半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法；公開專利02111518.4一種β-興奮劑金標(biāo)層析快速檢測方法及裝置；公開專利03153346.9檢測鹽酸克倫特羅的參比免疫層析試紙及其檢測方法；公開專利02157708.0檢測鹽酸克倫特羅的免疫膠體金試劑及其制備方法；公開專利200310112423.4克倫特羅快速半定量檢測方法；公開專利02131321.0一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備，以上專利都是利用免疫膠體金競爭法原理制成，本發(fā)明是通過雙抗體夾抗原即雙抗夾心法原理制成，此方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，批間差小等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述存在的一些問題，提供了一種適用于鹽酸克倫特羅殘留分析的試紙及其檢測方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的在鹽酸克倫特羅殘留檢測試紙底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線和一條羊抗鼠多克隆抗體控制線，在底板一端端頭為吸水層，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水層和鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接(交疊連接部分在1-2毫米范圍)，在鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層。關(guān)于底板、硝酸纖維素膜、吸水紙、膠體金標(biāo)墊的組合方法已是公知技術(shù)。萬華普曼生物工程有限公司于1995年已獲雙抗夾心法檢測人絨毛膜促性腺激素診斷試紙的國藥批準(zhǔn)文號國藥準(zhǔn)字S10950049號，并將產(chǎn)品投放市場。
配對單抗的建立是通過調(diào)整免疫劑量，高劑量為致死量的50％，即10-60ug進(jìn)行免疫。低劑量為5ug以下，低劑量免疫容易誘導(dǎo)出高選擇性和高親合性的抗體；而高劑量則相反，通過對低劑量所產(chǎn)生的抗體、高劑量所產(chǎn)生的抗體配對篩選，獲得配對單抗幾率較大。利用此原理構(gòu)建膠體金雙抗夾心法，篩選出兩株配對單抗，其中一株抗體稱為I用于包被試驗(yàn)線，另一株種抗體稱為II用于膠體金標(biāo)記。
將畜類產(chǎn)品用打漿機(jī)將其打成漿狀，用稀釋液將其對倍稀釋，把檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入畜類產(chǎn)品的稀釋液中(液面不得超過MAX線圖中8)，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，當(dāng)移動至鹽酸克倫特羅單克隆抗體II金標(biāo)墊時，樣品中的鹽酸克倫特羅與鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動至固定有鹽酸克倫特羅單克隆抗體I試驗(yàn)線時，樣品中的鹽酸克倫特羅又與試驗(yàn)線中的鹽酸克倫特羅單克隆抗體相結(jié)合，因此其膠體金滯留于試驗(yàn)線上，試驗(yàn)線處顯示紅色為陽性；相反如果樣品中沒有鹽酸克倫特羅，鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)探針就不會與試驗(yàn)線上的鹽酸克倫特羅單克隆抗體I發(fā)生特異結(jié)合，沒有膠體金滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是雙抗夾心法原理。根據(jù)此原理，兩條線為陽性，一條線為陰性得出判斷。
當(dāng)移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，無論樣品中有無鹽酸克倫特羅，標(biāo)記的金標(biāo)探針都會與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測時樣品液面超過MAX線或試紙已經(jīng)過期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙具有這樣的有益效果，即特異性強(qiáng)，靈敏度高，易儲存，無須專門技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖1為鹽酸克倫特羅檢測試紙的主視結(jié)構(gòu)圖。
圖2為鹽酸克倫特羅檢測試紙的側(cè)視結(jié)構(gòu)圖。
圖3為本發(fā)明檢測時顯示為陰性結(jié)果圖；圖4為本發(fā)明檢測時顯示為陽性結(jié)果圖；圖中1、吸水板，2、硝酸纖維素膜，3、羊抗鼠多克隆抗體控制線，4、試驗(yàn)線，5、單克隆抗體金標(biāo)墊，6、樣品吸液層，7、底板，8、MAX線。
具體實(shí)施例1.鹽酸克倫特羅免疫原合成用重氮法合成鹽酸克倫特羅半抗原，將其連接BSA、OVA，鹽酸克倫特羅-BSA用于免疫或包被，鹽酸克倫特羅-OVA用于檢測。
2.鹽酸克倫特羅單克隆抗體的制備(1)將5ug/ml和60ug/ml兩種劑量的鹽酸克倫特羅-BSA分別免疫BALB/c小鼠。用SP20細(xì)胞融合建立瘤株進(jìn)行篩選，取瘤細(xì)胞注射于BALB/c小鼠腹腔，使其產(chǎn)生腹水。
(2)提取小鼠腹水純化篩選，獲得能同時與鹽酸克倫特羅分子結(jié)合的兩種鹽酸克倫特羅單克隆抗體I、II，抗體II可用于雙抗夾心法的膠體金標(biāo)記和競爭法的膠體金標(biāo)記。
3.膠體金的制備及與鹽酸克倫特羅單克隆抗體的結(jié)合(1)取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到90～95℃，加入適量枸櫞酸三納繼續(xù)加熱攪拌至沸騰5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2)把鹽酸克倫特羅單克隆抗體標(biāo)記的膠體金液，吸附纖維材料上，干燥后備用。
4.制膜機(jī)制膜利用電腦控制傳動速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
5.試紙條組合按公知技術(shù)組合。
6.使用方法將畜類產(chǎn)品用打漿機(jī)將其打成漿狀，用稀釋液將其對倍稀釋，把檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙的樣品吸液層端放入畜類產(chǎn)品的稀釋液中(液面不得超過MAX線圖中8)，1分鐘后取出試紙平放，由于毛細(xì)管和虹吸作用樣品將沿著試紙條吸水層端移動，5分鐘時觀察結(jié)果。
7.結(jié)果判斷反應(yīng)線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條紅色線時為陽性；只有一條紅色控制線時為陰性。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于是由底板(7)、吸水板(1)、硝酸纖維素膜(2)、鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊(5)、樣品吸液層(6)組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上有一條試驗(yàn)線(4)和一條多克隆抗體控制線(3)，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，利用免疫膠體金法來檢測畜類產(chǎn)品中的是否有鹽酸克倫特羅殘留。
2.一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于此試紙是利用雙抗夾心原理制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，當(dāng)樣品通過膠體金標(biāo)記的鹽酸克倫特羅單克隆抗體移動至羊抗鼠多克隆抗體控制線時，控制線便顯示紅色。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于配對單抗的建立是通過調(diào)整免疫劑量，高劑量為致死量的50％，即10-60ug進(jìn)行免疫；低劑量為5ug以下，低劑量免疫容易誘導(dǎo)出高選擇性和高親合性的抗體，而高劑量則相反，通過對低劑量所產(chǎn)生的抗體、高劑量所產(chǎn)生的抗體配對篩選，獲得配對單抗幾率較大，利用此原理構(gòu)建膠體金雙抗夾心法，篩選出兩株配對單抗，其中一株抗體稱為I用于包被試驗(yàn)線，另一株種抗體稱為II用于膠體金標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的試驗(yàn)線顏色深淺與待測樣品中的鹽酸克倫特羅含量高低成正比。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，其特征在于利用雙抗夾心法制成試紙的試驗(yàn)線顏色為紅色，即顯色區(qū)為兩條線時為陽性；只有一控制線為紅色時為陰性。
全文摘要
一種快速檢測鹽酸克倫特羅殘留的膠體金試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、鹽酸克倫特羅單克隆抗體金標(biāo)墊、樣品吸液層組成。配對單抗的建立是通過調(diào)整免疫劑量，高劑量為致死量的50％，即10－60μg進(jìn)行免疫。低劑量為5μg以下，低劑量免疫容易誘導(dǎo)出高選擇性和高親合性的抗體；而高劑量則相反，通過對低劑量所產(chǎn)生的抗體、高劑量所產(chǎn)生的抗體配對篩選，獲得配對單抗幾率較大。利用此原理構(gòu)建膠體金雙抗夾心法，篩選抗體制成試紙，檢測畜類產(chǎn)品中是否有鹽酸克倫特羅殘留。此方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，批間差小，操作簡便，易于貯藏及運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。
文檔編號G01N21/77GK1725013SQ200510083198
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月15日
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