超螺旋dna含量的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種超螺旋DNA含量的測定方法，包括：采用AKTAexplorerTM10檢測儀器并利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理，以便獲得總DNA樣品，計算總DNA樣品的質量含量；以及采用嗜硫芳香色譜柱對總DNA樣品進行第二檢測分離處理，計算得到超螺旋DNA在待測樣品中的質量含量。利用上述方法可以定量、有效地測定質粒DNA中超螺旋DNA含量，分析的準確度與毛細管凝膠電泳相當，且顯著優于瓊脂糖凝膠電泳，適合于DNA生產的每個步驟。
【專利說明】超螺旋DNA含量的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物領域，具體而言，本發明涉及一種超螺旋DNA含量的測定方法。
【背景技術】
[0002]在質粒類生物制品工業化生產中，超螺旋DNA是最終的目的產品。然而質粒DNA不僅與RNA、蛋白質等雜質摻合在一起，其中還有少量開環DNA的存在，進而在實際檢測過程中干擾超螺旋DNA色譜峰，影響最終定量檢測。現有檢測超螺旋DNA含量技術中采用的毛細管凝膠電泳法或者瓊脂糖凝膠電泳法均存在檢測方法上的不足，如毛細管凝膠電泳法需要繁瑣的樣品處理，且不適合在質粒DNA生產的每一步中使用；瓊脂糖凝膠電泳法在OD26tl波長下檢測范圍太窄，并且樣品稀釋過程中很容易造成誤差，準確度很低，也不適合在質粒DNA生產的每一步中使用。更重要地，是上述兩種方法均無法定量地檢測超螺旋DNA的含量。
【發明內容】
[0003]本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種實現質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質基線分離、定量檢測超螺旋DNA含量的檢測方法。
[0004]根據本發明的一個方面，本發明提出了一種超螺旋DNA含量的測定方法，該方法包括:采用AKTAeXplorer?10檢測儀器并利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理，以便獲得總DNA樣品，計算總DNA樣品的質量含量；以及采用嗜硫芳香色譜柱對所述總DNA樣品進行第二檢測分離處理，并計算超螺旋DNA在所述待測樣品中的質量含量。
[0005]由此采用分子篩層析法使得RNA、蛋白質等雜質在內水體積中流出，而質粒DNA從外水體積中流出，完美地實現質粒DNA從RNA、蛋白質等其他雜質中的基線分離，減少了RNA、蛋白質等雜質在檢測過程中對質粒DNA的干擾。在此基礎上，利用卩比淀環硫釀基團對超螺旋DNA的特異性親和能力，實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，通過計算兩種DNA在色譜圖中對應的峰面積，進而定量地測定超螺旋DNA在總DNA中的確切含量。本發明上述實施例的測定超螺旋DNA含量的測定方法與毛細管凝膠電泳法和瓊脂糖凝膠電泳法相比，操作過程簡單，檢測過程中受雜質峰干擾小，具有安全、可靠、定量的特點，由此更加適用于實際工業化生產，效果良好。
[0006]另外，根據本發明上述實施例的超螺旋DNA含量的測定方法還可以具有如下附加的技術特征:
[0007]在本發明的一些實施例中，所述第一檢測分離處理和所述第二檢測分離處理采用的紫外檢測波長分別為0D26(i。由此可以進一步地減少RNA、蛋白質與開環DNA等雜質峰的干擾，提高超螺旋DNA含量測定的準確度。
[0008]在本發明的一些實施例中，所述分子篩色譜柱為5ml_HiTrap Sepharose HP色譜柱。由此可以實現質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質的完美分離，得到DNA總含量。[0009]在本發明的一些實施例中，所述嗜硫芳香色譜柱為Iml-HiTrap PlasmidSelectXtra色譜柱。由此可以
[0010]在本發明的一些實施例中，所述第一檢測分離處理是采用流動相A進行第一洗脫完成的，所述流動相A包含2.1M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmM Tris_Hcl，pH7.5。由此可以減少RNA、蛋白質等雜質的含量，降低RNA、蛋白質等雜質在色譜圖中的干擾，進一步地提高超螺旋DNA含量的檢測準確度。
[0011]在本發明的一些實施例中，所述第一洗脫的線性流速為60cm/h。由此可以進一步地提高檢測的準確度。
[0012]在本發明的一些實施例中，所述第二檢測分離處理是采用流動相B和流動相C進行第二洗脫完成的，所述流動相B包含2.25M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmM Tris-Hcl,ρΗ7.5，所述流動相 C 包含 2.0M NaClUOmM EDTA 以及 IOOmM Tris-Hcl, ρΗ7.5。
[0013]在本發明的一些實施例中，所述第二洗脫是以(100%流動相Β、0%流動相C)?(45%流動相Β、55%流動相C)的梯度洗脫方式進行的。由此可以進一步地實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，減少雜質峰干擾，提高檢測的靈敏度與準確度。
[0014]在本發明的一些實施例中，所述第二洗脫的線性流速為60cm/h，所述第二洗脫的洗脫體積為11個柱體積。由此可以進一步地提高檢測的準確度。
[0015]本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:
[0017]圖1是根據本發明實施例的超螺旋DNA含量測定方法中標準曲線圖；
[0018]圖2是根據本發明實施例的超螺旋DNA含量測定方法中測定0.5mlDNA樣品的色譜圖；
[0019]圖3是根據本發明實施例的超螺旋DNA含量測定方法中測定1.5mlDNA樣品到的色譜圖；
[0020]圖4是根據本發明實施例的超螺旋DNA含量測定方法中不同濃度標液色譜圖；
[0021]圖5是根據本發明實施例的超螺旋DNA含量測定方法測定總DNA樣品含量色譜圖。
【具體實施方式】
[0022]下面詳細描述本發明的實施例，其中描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0023]在一些實施例中，測定超螺旋DNA含量的測定方法可以包括:
[0024](I)采用AKTAeXplOrer?10檢測儀器并利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理，以便獲得總DNA樣品，計算總DNA樣品的質量含量；以及
[0025](2)采用嗜硫芳香色譜柱對所述總DNA樣品進行第二檢測分離處理，并計算超螺旋DNA在所述待測樣品中的質量含量。[0026]根據本發明實施例的測定超螺旋DNA含量的測定方法采用AKTAexplorer?10檢測儀，利用分子篩色譜柱分離質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質，并利用吡啶環硫醚基團對超螺旋DNA的特異性親和能力，采用嗜硫芳香色譜柱實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，通過檢測儀器自帶的UNIC0RN?5.01軟件計算色譜圖中與之對應的峰面積的大小，就可以分別得到兩種DNA在總DNA中的含量，操作過程簡單、快速、方便，且能定量測定超螺旋DNA含量，效果良好。
[0027]毛細管凝膠電泳法雖然可以測定超螺旋DNA的含量，但是樣品前處理過程比較繁瑣，且不適合在質粒DNA生產的每一步中使用；本發明的發明人采用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理的方法，即可得到總DNA樣品，進而采用嗜硫芳香色譜柱通過線性鹽梯度洗脫對所述總DNA樣品進行第二檢測分離處理，即可采用儀器自帶的UNIC0RN?5.01軟件計算色譜圖中與之對應的峰面積的大小分別得到兩種DNA在總DNA中的含量。操作簡單、安全、可靠，且能定量分析。另外，采用瓊脂糖凝膠電泳法在OD26tl波長下檢測范圍太窄，并且樣品稀釋過程中很容易造成誤差，準確度很低，也不適合在質粒DNA生產的每一步中使用。本發明的發明人通過上述步驟，利用在OD26tl波長下檢測范圍窄的特點，減少了其他雜質干擾峰的影響，進一步地提高了檢測的靈敏度和準確度。
[0028]下面詳細描述本發明實施例的測定超螺旋DNA含量的方法。
[0029]根據本發明的具體實施例，上述利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理的檢測波長并不受特別限制，例如，可以在紫外檢測波長為OD26tl下進行第一檢測分離處理。由此可以進一步提聞檢測的準確度，進而有效地將DNA和RNA、蛋白質進行分尚。
[0030]根據本發明的具體實施例,上述所用分子篩色譜柱可以為5ml_HiTrap SepharoseHP色譜柱。由此可以徹底地將質粒DNA與RNA、蛋白質等雜質實現完美的分離，得到DNA總含量，進而降低色譜檢測過程中RNA、蛋白質等雜質干擾峰的影響，提高超螺旋DNA含量檢測的靈敏度和準確度。
[0031]根據本發明的具體實施例，上述第一檢測分離處理是采用流動相A進行第一洗脫完成的，所述流動相A包含2.1M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmM Tris_Hcl，pH7.5。由此可以減少RNA、蛋白質等雜質的含量，降低RNA、蛋白質等雜質在色譜圖中的干擾，進一步地提高超螺旋DNA含量的檢測準確度。
[0032]上述利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理的檢測波長并不受特別限制，例如，可以在紫外檢測波長為OD26tl下進行第一檢測分離處理。由此可以進一步提高檢測的準確度，進而有效地將DNA和RNA、蛋白質進行分離。
[0033]根據本發明的具體實施例，上述第一洗脫的線性流速并不受特別限制，例如，可以在線性流速為60cm/h下進行第一洗脫。由此可以進一步地提高檢測的準確度。
[0034]通過上述方法對待測樣品進行處理，采用第一檢測分離得到了總DNA質量含量。根據本發明的具體實施例，下面進一步對上述總DNA進行檢測分離，例如，可以采用嗜硫芳香色譜柱對總DNA樣品進行第二檢測分離處理，并計算超螺旋DNA在待測樣品中的質量含量。
[0035]根據本發明的具體實施例，上述利用嗜硫芳香色譜柱對待測樣品進行第二檢測分離處理的檢測波長并不受特別限制，例如，可以在紫外檢測波長為OD26tl下進行第二檢測分離處理。由此可以有效地將超螺旋DNA和開環DNA進行分離，降低色譜檢測過程中開環DNA色譜峰對超螺旋DNA色譜峰的干擾，進一步提高檢測的靈敏度和準確度，
[0036]根據本發明的具體實施例，上述第二檢測分離處理的色譜柱并不受特別限制，例如可以采用Iml-HiTrap PlasmidSelect Xtra嗜硫芳香色譜柱。由此可以進一步提高開環DNA和超螺旋DNA的分離效果。
[0037]根據本發明的具體實施例，上述第二檢測分離處理是采用流動相B和流動相C進行第二洗脫完成的，所述流動相B包含2.25M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmM Tris-Hcl,ρΗ7.5，所述流動相 C 包含 2.0M NaClUOmM EDTA 以及 IOOmM Tris_Hcl，pH7.5。由此進一步實現超螺旋DNA與開環DNA的分離，提高檢測的準確度。具體的，PlasmidSelect Xtra填料通過采用疏水作用和親合作用與開環和超螺旋質粒進行結合，并且這兩種作用都對超螺旋質粒要強烈一些。在流動相B中包含2.25M(NH4)2SO4，沒有NaCl，主要目的是為了讓開環和超螺旋質粒都掛到層析柱上，而流動相C中包含2.0M NaCl，沒有(NH4) 2S04，這樣在拉梯度時就可以通過降低(NH4)2SO4的濃度的方式來減弱疏水結合，進而通過升高NaCl濃度來減弱親和作用。由此，通過采用兩種洗脫方式相互結合可以讓開環和超螺旋質粒達到基線分離。
[0038]根據本發明的具體實施例，上述第二洗脫是以(100%流動相B、0%流動相C)?(45%流動相B、55%流動相C)的梯度洗脫方式進行的。由此，采用該洗脫方式可以使得開環和超螺旋質粒達到基線分離，使通過峰面積積分分析得到的結果更為精確。同時，發明人在進行梯度洗脫方式過程中發現，當梯度達到(45%流動相B、55%流動相C)時，開環和超螺旋質粒已經完全洗脫下來。由此，采用(100%流動相B、0%流動相C)?(45%流動相B、55%流動相C)的梯度洗脫方式可以顯著節省時間，提高工作效率。
[0039]根據本發明的具體實施例，上述第二洗脫的線性流速及洗脫體積并不受特別限制，例如，可以在線性流速為60cm/h下進行第二洗脫，所述第二洗脫的洗脫體積為11個柱體積。發明人經過一系列實驗確定，首先在第二洗脫的線性流速為20cm/h的速度下需要11個柱體積才能將開環和超螺旋質粒全部洗干凈，然后通過優化線性速度來提高工作效率(由于每批生產過程中需要檢測的樣品比較多，因而需要盡可能縮短每個樣品檢測所需的時間)，優化過程中發現60cm/h時可以滿足基線分離的要求，超過60cm/h則導致開環和超螺旋質粒分不開。由此，在線性流速為60cm/h，洗脫體積為11個柱體積條件下進行第二洗脫可以進一步提聞開環和超螺旋質粒分尚效果，并提聞工作效率。
[0040]下面參考具體實施例，對本發明進行描述，需要說明的是，這些實施例僅僅是描述性的，而不以任何方式限制本發明。
[0041]實施例
[0042]1、前處理
[0043]取Ig 大腸桿菌菌體置于 IOml Bufferl (50mM Tris, 50mM 葡萄糖，IOmM EDTA,pH7.5)中懸浮，待充分混合均勻之后，緩慢加入IOml Buffer2 (0.2M NaOH，1%SDS)，溫和攪拌，形成均勻膠狀物。之后緩慢加入IOml Buffer3 (3M醋酸鉀，pH5.5)，溫和攪拌至完全中和，在4°C環境下靜置lh。采用紗布過濾除去溶液中白色沉淀物，再用0.22um紗網過濾，濾液用于色譜柱測試。
[0044]2、標準質粒的來源及標準曲線的制備
[0045]標準質粒的來源:自主生產的pUDK-HGF質粒。大腸桿菌裂解液上清經Sepharose6Fast Flow、Plasmind Select Xtra、Source30Q 純化后，用 HPLC 檢測純度達到99%以上。
[0046]標準曲線的制備:
[0047]取30ml純化后的質粒加入70ml無水乙醇，混勻后4°C環境下沉淀lh，然后采用高速離心機在12000rpm，且4°C環境下離心lh。除掉上清液，再用IOml無水乙醇清洗兩次，清洗完成后再次在12000rpm，4°C環境下離心20min。洗出殘留的無水乙醇，再在超凈工作臺中吹干至粉末狀。使用XP2U超微量天平(0.lug, METTER TOLEDO)分別秤取20，38，58，76，94，114，206和412ug質粒粉末溶于2ml注射用水中，制作成濃度為10，19，29，38，47，57，103和206ug/ml的標準品。分別取1.5ml上5ml HiTrap Sepharose HP層析柱，得到各自對的峰面積，并計算得到標準曲線公式為(y=4.490X+1.386，R2=0.999)。具體數據見表1:
[0048]表1
[0049]
【權利要求】
1.一種超螺旋DNA含量的測定方法，其特征在于，包括: 采用AKTAeXplorer?10檢測儀器并利用分子篩色譜柱對待測樣品進行第一檢測分離處理，以便獲得總DNA樣品，計算總DNA樣品的質量含量；以及 采用嗜硫芳香色譜柱對所述總DNA樣品進行第二檢測分離處理，并計算得到超螺旋DNA在所述待測樣品中的質量含量。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一檢測分離處理和所述第二檢測分離處理采用的紫外檢測波長分別為0D.。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述分子篩色譜柱為5ml-HiTrapSepharose HP 色譜柱。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的嗜硫芳香色譜柱為Iml-HiTrapPlasmidSelect Xtra 色譜柱。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一檢測分離處理是采用流動相A進行第一洗脫完成的，所述流動相A包含2.1M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmM Tris-Hcl,ρΗ7.5。
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一洗脫的線性流速為60cm/h。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二檢測分離處理是采用流動相B和流動相C進行第二洗脫完成的，所述流動相B包含2.25M(NH4)2SO4UOmM EDTA以及IOOmMTris-Hcl, ρΗ7.5，所述流動相 C 包含 2.0M NaClUOmM EDTA 以及 IOOmM Tris-Hcl, ρΗ7.5。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二洗脫是以(100%流動相Β、0%流動相C)?(45%流動相B、55%流動相C)的梯度洗脫方式進行的。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二洗脫的線性流速為60cm/h，所述第二洗脫的洗脫體積為11個柱體積。
【文檔編號】G01N30/02GK103852530SQ201410015213
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年1月14日 優先權日:2014年1月14日
【發明者】王學海, 李 杰, 李莉娥, 許勇, 何昆, 陳愛芳, 呂興凱, 田呂明, 馬梵辛, 楊仲文, 涂榮華, 肖強, 張緒文, 馬錚, 裴達, 黃韞韜 申請人:人福醫藥集團股份公司
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