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利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，屬于植物保護領(lǐng)域。該發(fā)明通過對灰飛虱的采集和研磨后，利用水稻條紋病毒單克隆抗體，建立檢測單頭介體灰飛虱攜帶水稻條紋病毒的dot-ELISA體系。該檢測方法靈敏度高、特異性強，適用于大批量的單頭灰飛虱樣品檢測，且不需要特殊儀器設(shè)備，具有結(jié)果判定簡單易行、檢測結(jié)果便于長期保存等特點，可對田間灰飛虱攜帶水稻條紋病毒的帶毒率進行大規(guī)模調(diào)查和檢測，為田間水稻條紋葉枯病的爆發(fā)流行進行預(yù)測預(yù)報并采取相應(yīng)的防控措施提供技術(shù)支撐。
【專利說明】利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，屬于植物保護領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]水稻條紋病毒(/Pice stripeRSV)是引起水稻條紋葉枯病的病原物，自然界中可以由灰飛風(fēng)(LaoofeTz)Aar str i at el lus、脊飛HUnkanodes白帶飛風(fēng)(K albifascia)和白條飛風(fēng)(Terthron alboviiiaiw?)傳播,但主要依靠灰飛風(fēng)以持久方式經(jīng)卵傳給后代。水稻條紋葉枯病最早于1897年在日本關(guān)東發(fā)生，隨后在俄羅斯、朝鮮、韓國、前蘇聯(lián)和烏克蘭相繼發(fā)生。我國自1963年首次在江蘇南部地區(qū)發(fā)生后，迅速擴及到18個省(市、自治區(qū))廣大稻區(qū),其中于江蘇、安徽、河南、山東、云南、北京、上海、臺灣等地爆發(fā)流行，全國年發(fā)生面積在133萬hm2以上，嚴(yán)重的甚至顆粒無收。近年來該病在全國范圍呈上升趨勢，2004年，該病在江蘇、安徽、河南、山東、云南大流行，發(fā)病面積達333萬hm2以上，僅江蘇發(fā)病面積就達160萬hm2，占江蘇水稻種植總面積的79%，發(fā)病率50%以上的重病田近5000 hm2，1333.3 hm2絕收，給當(dāng)?shù)氐乃旧a(chǎn)造成毀滅性打擊。因此對該病的早期預(yù)測預(yù)報及有效防控就顯得尤為重要。
[0003]介體灰飛虱的帶毒率與水稻條紋葉枯病的發(fā)生關(guān)系密切，快速且準(zhǔn)確地檢測灰飛虱體內(nèi)的RSV對水稻條紋葉枯病的預(yù)測預(yù)報和病害防治等具有重要的意義。要準(zhǔn)確探明田間灰飛虱的帶毒率，需要對大批量單頭灰飛虱進行帶毒情況檢測。通常對灰飛虱體內(nèi)RSV的檢測主要采用RT-PCR方法，但該方法所使用的儀器和試劑成本較高，需要專業(yè)人員進行操作，不利于大批量的樣品檢測，而dot-ELISA具有靈敏度高、特異性強、成本低等優(yōu)點，適用于大批量的樣品檢測，且不需要特殊儀器設(shè)備，操作簡便，結(jié)果判定簡單易行。另外，通常的病毒檢測中，樣品檢測前往往用重復(fù)使用的研缽進行研磨，由于一次只能對一個樣品進行研磨，不但費時費力，而且每次樣品研磨完畢后，必須對研缽、研棒等進行清洗消毒，否則容易造成樣品間的交叉污染，導(dǎo)致結(jié)果的假陽性增加。當(dāng)在對田間成百上千的灰飛虱樣品進行檢測時，清洗研缽研棒不但費時費力，而且很難保證清洗消毒的效果，無法保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明所利用的高通量組織研磨儀可以在4分鐘內(nèi)最多對2 X 96個樣本同時進行快速、有效的研磨，由于采用的是封閉式一次性離心管，有效的避免了樣品交叉污染，而且由于采用研磨球進行研磨，使得樣品的研磨相較于傳統(tǒng)研磨方式更為均勻、充分，便于病毒從病組織中有效分離，極大地提高了檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度，極大地節(jié)約了檢測時間。
[0004]申請?zhí)枮镃N201210423231的專利公開了一種快速檢測煙粉虱攜帶番茄黃化曲葉病毒的dot-ELISA的方法，該專利涉及到的番茄黃花曲葉病毒屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬)，其傳毒介體煙粉虱是粉虱科小粉虱屬昆蟲，而本專利涉及的水稻條紋病毒是布尼亞科纖細病毒屬病毒,其傳毒介體灰飛風(fēng)是飛風(fēng)科灰飛風(fēng)屬，它們分屬于不同的科、屬，寄主不同，自身的生理特征不一樣，沒有同源性，沒有共同點。所以本專利的發(fā)明不存在技術(shù)啟示問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明提供了一種高效、靈敏、特異且低成本的利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的方法。
[0006]為了解決技術(shù)問題，本發(fā)明采用的具體步驟是:利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)RSV的方法包括以下步驟:
(1)灰飛虱的采集及保存:在田間采集灰飛虱，放入提前準(zhǔn)備好水稻苗的培養(yǎng)瓶中備用；或直接將灰飛虱放入75%的酒精瓶中保存；將暫不進行檢測的灰飛虱放入-20°C或_80°C冰箱中保存；
(2)灰飛風(fēng)研磨:用滅菌牙簽挑取單頭灰飛風(fēng),置于干凈并已裝有3-5顆l-3mm小鋼珠的1.5mL離心管中，每個離心管中加0.01 mo I/L PBS緩沖液后，放于高通量組織研磨儀中振蕩研磨至明顯組織消失；或者將單頭灰飛虱放入1.5mL離心管中，每個離心管中加0.01mol/L PBS緩沖液后，用組織研磨棒搗碎至明顯組織消失；研磨后把1.5mL離心管放到離心機中離心，使沉淀沉于底部取出上清待用；
(3)硝酸纖維素(NC)膜準(zhǔn)備:用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格0.7X0.7cm，平整放入培養(yǎng)皿中央；
(4)取2μ L灰飛虱研磨液的上清液點到NC膜的方格中央；室溫干燥20min ;重復(fù)點一次樣，室溫干燥；
(5)將NC膜浸入到能覆蓋NC膜的含5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉；
(6)加入用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋的RSV單克隆抗體至覆蓋NC膜，37°C孵育；
(7)棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗；
(8)棄洗脫液，加入用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗至覆蓋NC膜，室溫孵育；
(9)棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗；
(10)棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干后，放入能覆蓋NC膜的底物顯色液TMB中反應(yīng)，避光靜置3-10min ；
(11)待NC膜上的陽性對照呈現(xiàn)明顯藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)；
(12)將已顯色的NC膜放入能覆蓋NC膜的ddH20中，漂洗Imin后晾干，記錄結(jié)果并照相保存；
(13)檢測結(jié)果判斷:NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍色，說明灰飛虱攜帶RSV;NC膜上的樣品未顯色時，說明灰飛虱未攜帶RSV ;根據(jù)陽性樣品數(shù)/總樣品數(shù)計算灰飛虱帶毒率。
[0007]所述步驟(2)中，用PBS緩沖液研磨灰飛虱時，PBS緩沖液的用量為150-250 μ L ；高通量組織研磨儀的振蕩頻率為60Hz，振蕩研磨時間為60-90s ;離心機離心條件為4°C，12000rpm,離心 3-lOmin。
[0008]所述步驟(5 )中NC膜封閉時間為30_90min。
[0009]所述步驟(6)中RSV單克隆抗體使用前，經(jīng)過含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1:5000-1:10000的比例稀釋處理后，37 °C孵育30_90min。
[0010]所述步驟(8)中辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗使用前，經(jīng)過含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1:5000-1:20000的比例稀釋處理后，37°C孵育30_90min。
[0011]本技術(shù)中所述的0.01 mo I/L PBS緩沖液為由3g十二水磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀組成的混合液，定容至100mL,調(diào)pH至7.2 ；PBST緩沖液為含 0.05% Tween-20 的 0.01 mol/L PBS 緩沖液。
[0012]本發(fā)明的有益效果:提供了一種針對檢測單頭灰飛虱攜帶RSV的血清學(xué)方法，由于使用高度特異性的RSV單克隆抗體，該檢測方法靈敏度高、特異性強，適用于大批量的樣品檢測，不需要特殊的儀器設(shè)備和昂貴的試劑，極大地節(jié)約了檢測成本和檢測時間，不需要特殊的專業(yè)人員即可操作。而且結(jié)果判定中顯示藍色的即為陽性結(jié)果，未顯色即為陰性結(jié)果，非常簡單可靠。利用本發(fā)明對田間灰飛虱的帶毒情況進行調(diào)查，可實現(xiàn)對單頭灰飛虱攜帶的RSV進行檢測，能夠準(zhǔn)確計算出不同時期灰飛虱攜帶RSV的帶毒率，為水稻條紋葉枯病在田間的流行爆發(fā)趨勢進行早期預(yù)測預(yù)報并及時采取相應(yīng)的防控措施提供技術(shù)支撐。而高通量組織研磨儀的使用，不但省時省力，有利于大批量樣品的同步檢測，而且能有效避免樣品交叉污染，極大地提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和靈敏度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是部分田間單頭灰飛風(fēng)RSV 毒率檢測結(jié)果
圖中:A1-F5是所檢測的田間灰飛虱樣品，A6、B6是陽性對照，C6是陰性對照【具體實施方式】:
下面結(jié)合附圖1和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，以方便技術(shù)人員理解。
[0014]實施例一:以田間采集的灰飛虱樣品進行單頭灰飛虱攜帶RSV的檢測，計算灰飛風(fēng)的帶毒率。
[0015]具體步驟如下:在田間用吸蟲器采集灰飛虱30頭并放入提前準(zhǔn)備好水稻苗的瓶子中，以利于灰飛虱存活；把采集的灰飛虱放入_80°C超低溫冰箱中保存。檢測時用滅菌牙簽挑取單頭灰飛虱，置于干凈并已裝有3顆2_小鋼珠的1.5mL離心管中，每個離心管中加150 μ L 0.01 mol/L PBS緩沖液后，放于振蕩頻率為60Hz的高通量組織研磨儀中振蕩研磨60s至明顯組織消失。將離心管放入離心機中4°C, 12000rpm下離心3min,上清待用。用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格0.7 X 0.7 cm，剪6 X 6格大小的膜平整放入直徑為6cm的培養(yǎng)皿中央。取2 μ L樣品上清液點到NC膜方格中央，并設(shè)置陽性、陰性對照，室溫干燥20min。重復(fù)點一次樣，室溫干燥，同時吸取50 μ L樣品上清提取RNA作為模板進行RT-PCR驗證。等膜晾干后，加1mL 5%脫脂奶粉室溫封閉30min。棄液體，加1mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和2 μ L的RSV單克隆抗體(即RSV單克隆抗體稀釋了 5000倍)，37°C孵育30min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗；棄洗脫液，加1mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和2 μ L的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(即辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗稀釋了 5000倍)，室溫孵育30min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗。棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干后，放入能覆蓋NC膜的底物顯色液TMB中反應(yīng)，避光靜置5min。待NC膜上的陽性樣品呈現(xiàn)明顯藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)。將已顯色的NC膜放入能覆蓋NC膜的ddH20中，放置Imin后晾干，記錄結(jié)果并照相保存。檢測結(jié)果顯示，30頭灰飛虱中共有11頭灰飛虱顯藍色成陽性反應(yīng)(如圖1)，計算出灰飛虱的帶毒率為36.67%，表明云南田間灰飛虱RSV的帶毒率非常高，水稻條紋葉枯病發(fā)生流行的可能性非常大，需盡快采取防范措施。該dot-ELISA檢測結(jié)果得到了RT-PCR的驗證，證明本發(fā)明的檢測結(jié)果真實可信。
[0016]實施例二:以溫室飼養(yǎng)的灰飛虱樣品進行單頭灰飛虱攜帶RSV的檢測，計算灰飛風(fēng)的帶毒率。
[0017]具體步驟如下:用吸蟲器采集溫室飼養(yǎng)的灰飛虱60頭后，把灰飛虱放入-20°C冰箱中冷凍5min。用滅菌牙簽挑取單頭灰飛虱，放入1.5mL離心管中，每個離心管中加200 μ L0.01 mo I/L PBS緩沖液后，用組織研磨棒搗碎至明顯組織消失。將離心管放入離心機中4°C,12000rpm下離心5min，上清待用。用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格0.7X0.7 cm，剪7X9格大小的膜平整放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中央。取2 μ L樣品上清液點到NC膜方格中央，并設(shè)置陽性、陰性對照，室溫干燥20min。重復(fù)點一次樣，室溫干燥，同時吸取50 μ L樣品上清提取RNA作為模板進行RT-PCR驗證。等膜晾干后，加20mL 5%脫脂奶粉室溫封閉60min。棄液體，加20mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和2.5μ L的RSV單克隆抗體(即RSV單克隆抗體稀釋了 8000倍)，37°C孵育60min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗；棄洗脫液，加20mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和2 μ L的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(即辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗稀釋了 10000倍)，室溫孵育60min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗。棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干后，放入能覆蓋NC膜的底物顯色液TMB中反應(yīng)，避光靜置5min。待NC膜上的陽性樣品呈現(xiàn)明顯藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)。將已顯色的NC膜放入?泛復(fù)蓋NC I吳的ddH20中，放直Imin后晚干，記錄結(jié)果并照相保存。檢測結(jié)果顯不，60頭灰飛虱中共有6頭灰飛虱顯藍色成陽性反應(yīng)，計算出灰飛虱的帶毒率為10.00%。表明溫室飼養(yǎng)的灰飛虱RSV帶毒率較高，適合用來做進一步的傳毒實驗。該dot-ELISA檢測結(jié)果得到了 RT-PCR的驗證，證明本發(fā)明的檢測結(jié)果真實可信。
[0018]實施例三:以溫室采集的灰飛虱樣品進行單頭灰飛虱攜帶RSV的檢測，計算灰飛風(fēng)的帶毒率。
[0019]具體步驟如下:用吸蟲器采集溫室飼養(yǎng)的灰飛虱79頭后，把灰飛虱放入-20°C冰箱中冷凍5min。用滅菌牙簽挑取單頭灰飛風(fēng),置于干凈并已裝有5顆Imm小鋼珠的1.5mL離心管中，每個離心管中加250 μ L 0.01 mol/L PBS緩沖液后，放于振蕩頻率為60Hz的高通量組織研磨儀中振蕩研磨90s至明顯組織消失。將離心管放入離心機中4°C，12000rpm下離心lOmin，上清待用。用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格0.7X0.7 cm，剪9X9格大小的膜平整放入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中央。取2 μ L樣品上清液點到NC膜方格中央，并設(shè)置陽性、陰性對照，室溫干燥20min。重復(fù)點一次樣，室溫干燥，同時吸取50 μ L樣品上清提取RNA作為模板進行RT-PCR驗證。等膜晾干后，加20mL 5%脫脂奶粉室溫封閉90min。棄液體，加20mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和2 μ L的RSV單克隆抗體(即RSV單克隆抗體稀釋了 10000倍)，37°C孵育90min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗；棄洗脫液，加20mL含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液和I μ L的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗(即辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗稀釋了 20000倍)，室溫孵育90min。棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗。棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干后，放入能覆蓋NC膜的底物顯色液TMB中反應(yīng)，避光靜置lOmin。待NC膜上的陽性樣品呈現(xiàn)明顯藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)。將已顯色的NC膜放入能覆蓋NC膜的ddH20中，放置Imin后晾干，記錄結(jié)果并照相保存。檢測結(jié)果顯示，79頭灰飛虱中共有8頭灰飛虱顯藍色成陽性反應(yīng)，計算出灰飛虱的帶毒率為10.13%。表明溫室飼養(yǎng)的灰飛虱RSV帶毒率較高，適合用來做進一步的傳毒實驗。該dot-ELISA檢測結(jié)果得到了 RT-PCR的驗證，證明本發(fā)明的檢測結(jié)果真實可信。
[0020]結(jié)果表明:無論是用低倍數(shù)還是高倍數(shù)稀釋的RSV單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗，本發(fā)明的方法均能在相同實驗條件下從溫室和田間單頭灰飛虱樣品中檢測到RSV，而陰性對照均無假陽性結(jié)果發(fā)生，檢測結(jié)果特異性強、真實可靠。由于采用高通量組織研磨儀及封閉式一次性離心管對樣品進行研磨，既省時省力，又避免了樣品間的交叉污染，還極大地節(jié)約了檢測成本。因此本發(fā)明具有檢測效率高、準(zhǔn)確性高、特異性強、靈敏度高和成本低等優(yōu)點，可應(yīng)用于水稻或其他相關(guān)植物上發(fā)生的單頭灰飛虱中RSV的高通量特異性檢測，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0021]本發(fā)明通過實施例進行說明的內(nèi)容，在不脫離本發(fā)明范圍的情況下，還可以對本發(fā)明專利進行各種變換及等同代替，因此，本發(fā)明專利不局限于所公開的具體實施過程，而應(yīng)當(dāng)包括落入本發(fā)明專利權(quán)利要求范圍內(nèi)的全部實施方案。
【權(quán)利要求】
1.利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法包括以下步驟: (1)灰飛虱的采集及保存:在田間采集灰飛虱，放入提前準(zhǔn)備好水稻苗的培養(yǎng)瓶中備用；或直接將灰飛虱放入75%的酒精瓶中保存；將暫不進行檢測的灰飛虱放入-20°C或_80°C冰箱中保存； (2)灰飛風(fēng)研磨:用滅菌牙簽挑取單頭灰飛風(fēng),置于干凈并已裝有3-5顆l-3mm小鋼珠的1.5mL離心管中，每個離心管中加0.01 mo I/L PBS緩沖液后，放于高通量組織研磨儀中振蕩研磨至明顯組織消失；或者將單頭灰飛虱放入1.5mL離心管中，每個離心管中加0.01mol/L PBS緩沖液后，用組織研磨棒搗碎至明顯組織消失；研磨后把1.5mL離心管放到離心機中離心，使沉淀沉于底部取出上清待用； (3)硝酸纖維素(NC)膜準(zhǔn)備:用鉛筆在NC膜外層紙上劃線，使NC膜印上方格線痕跡，每格規(guī)格0.7X0.7cm，平整放入培養(yǎng)皿中央； (4)取2μ L灰飛虱研磨液的上清液點到NC膜的方格中央；室溫干燥20min ;重復(fù)點一次樣，室溫干燥； (5)將NC膜浸入到能覆蓋NC膜的含5%脫脂奶粉封閉液中，室溫封閉； (6)加入用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋的水稻條紋病毒單克隆抗體至覆蓋NC膜，37 °C孵育； (7)棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗； (8)棄洗脫液，加入用含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗至覆蓋NC膜，室溫孵育； (9)棄液體，加PBST緩沖液至覆蓋NC膜，洗膜5-6次，每次3min，最后一次用PBS緩沖液洗； (10)棄洗脫液，將NC膜用濾紙吸干或靜置晾干后，放入能覆蓋NC膜的底物顯色液TMB中反應(yīng)，避光靜置3-10min ； (11)待NC膜上的陽性對照呈現(xiàn)明顯藍色而陰性對照未顯色時棄顯色液終止反應(yīng)； (12)將已顯色的NC膜放入能覆蓋NC膜的ddH20中，漂洗Imin后晾干，記錄結(jié)果并照相保存； (13)檢測結(jié)果判斷:NC膜上的樣品呈現(xiàn)藍色，說明灰飛虱攜帶水稻條紋病毒；NC膜上的樣品未顯色時，說明灰飛虱未攜帶水稻條紋病毒；根據(jù)陽性樣品數(shù)/總樣品數(shù)計算灰飛風(fēng)帶毒率。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，用PBS緩沖液研磨灰飛虱時，PBS緩沖液的用量為150-250μ? ;高通量組織研磨儀的振蕩頻率為60Hz，振蕩研磨時間為60-90s ;離心機離心條件為4°C，12000rpm,離心 3-lOmin。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，所述步驟(5)中NC膜封閉時間為30-90min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，所述步驟(6)中水稻條紋病毒單克隆抗體使用前，經(jīng)過含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1:5000-1:10000的比例稀釋處理后，37°C孵育30_90min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，所述步驟(8)中辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 二抗使用前，經(jīng)過含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液按1:5000-1:20000的比例稀釋處理后，37°C孵育30_90min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4或5所述，利用dot-ELISA檢測單頭灰飛虱體內(nèi)水稻條紋病毒的方法，其特征在于，所述的0.01 mol/L PBS緩沖液為由3g十二水磷酸氫二鈉，0.2g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉和0.2g氯化鉀組成的混合液，定容至100mL,調(diào)pH至7.2 ；PBST緩沖液為含 0.05% Tween-20 的 0.01 mol/L PBS 緩沖液。
【文檔編號】G01N33/577GK104267186SQ201410544959
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】李凡, 張水英, 李月月, 李梅蓉, 譚冠林, 楊耀珠, 馬慶 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)