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專利名稱：5-fu抗腫瘤療效與安全性檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種檢測個(gè)體5-FU抗 腫瘤療效與安全性的試劑盒，通過檢測5-氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性位 點(diǎn)來評(píng)估個(gè)體5-FU抗腫瘤療效與安全性。
背景技術(shù)：
腫瘤是機(jī)體在各種致瘤因素作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去對(duì)其生長 的調(diào)控，導(dǎo)致克隆性異常增生而形成的新生物。腫瘤被人類發(fā)現(xiàn)已有3000多年歷史，一般 分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩大類，通常所講的“癌癥”指的是所有的惡性腫瘤。目前調(diào)查研究顯示，腫瘤已成為常見病，多發(fā)病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健 康最嚴(yán)重的一類疾病。我國最為常見和危害性最嚴(yán)重的腫瘤為肺癌、肝癌、大腸癌、食管癌、 胃癌、乳腺癌和白血病等。在腫瘤的治療中，化療占有十分重要的地位，是手術(shù)后輔助治療的必要手段。然而 各種抗腫瘤藥物因具有細(xì)胞殺傷能力而潛藏著嚴(yán)重的藥物毒副作用，且因人而異的發(fā)揮著 難以預(yù)測的治療作用。因此，隨著人們對(duì)藥動(dòng)學(xué)、藥效學(xué)和藥物基因組學(xué)的深入了解和把 握，使得通過更加靈敏、有效的基因檢測手段來預(yù)測藥物療效和規(guī)避不良反應(yīng)成為可能。5-氟尿嘧啶該藥為嘧啶類的氟化物，屬于抗代謝抗腫瘤藥，能抑制胸腺嘧啶核苷 酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成脫氧胸腺嘧啶核苷核，干擾DNA合成。對(duì)RNA的合 成也有一定的抑制作用。二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-氟尿嘧啶(5-FU)分解代謝的限速酶，其活性的高低 將影響5-FU的代謝速度，進(jìn)而影響到5-FU的療效和毒副反應(yīng)。DPD由二氫嘧啶脫氫酶基因 (DPYD)編碼，DPYD序列上堿基的突變可能引起DPD結(jié)構(gòu)及活性的改變。估計(jì)約有3_8%的 腫瘤患者帶有導(dǎo)致DPD活性降低的基因突變位點(diǎn)。這使得病人即使是僅服用非常小劑量的 5-FU或僅服用1次5-FU后，就可能導(dǎo)致非常嚴(yán)重的毒副作用，甚至危及生命。對(duì)于DPYD基因的變異和堿基序列的缺失也研究得較多。到目前為止，至少有20 余種突變與DPD活性下降有關(guān)。其中與5-FU密切相關(guān)的是DPYD第1986位剪接位點(diǎn)發(fā)生 G到A的轉(zhuǎn)化(DPYD*2A)導(dǎo)致外顯子14的缺失(IVS14+1G > A)，形成無活性DPD，使5-FU 的代謝清除受阻，而合成途徑更加活躍。合成途徑的活性代謝產(chǎn)物累積可以導(dǎo)致血液、神經(jīng) 以及消化系統(tǒng)的毒性，甚至危及生命。

發(fā)明內(nèi)容
基于5-氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性可用來評(píng)估個(gè)體5-FU抗腫 瘤療效與安全性的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種檢測個(gè)體5-FU抗腫瘤療效與安全性的試劑盒。該試劑盒包括檢測5-氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異 性熒光探針對(duì)；
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熒光定量PCR反應(yīng)組件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反應(yīng)緩沖液、去離 子水等)。本試劑盒中所述的特異性熒光探針對(duì)是能夠輕易完成設(shè)計(jì)的，特異性熒光探針對(duì) 可用常規(guī)的探針合成技術(shù)進(jìn)行合成。本發(fā)明試劑盒的組分和含量包括10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 Pi，25mM dNTP 混合液 0. 1 u 1,25mM MgC12 溶液 0. 6u 1,5units/ u 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 u 1,20 iiM特異性引物對(duì)每條引物各0.225 iil，10 uM特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 u M，去離子水 5. 325ii 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，或按照廠商所建議的條件。實(shí)施例檢測試劑盒的使用步驟1:DNA模板的抽取用硅膠吸附法抽提口腔上皮細(xì)胞的基因組DNA。步驟2 熒光定量PCR反應(yīng)使用檢測試劑盒中的熒光定量PCR套裝，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)的體系為總 體積10 u 1，包含濃度為20ng/ yl的DNA模板2 ill、1 ill 10X熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、 0. 1 u 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 u 1 25mMMgCl2 溶液、0. 025 u 1 (5units/ u 1) Taq DNA 聚合 酶、20 y M的有義引物和反義引物各0. 225 iU、10 y M的帶VIC熒光探針和帶FAM熒光探針 各 0. 25ii 1，去離子水 5. 325 u 1。在PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，進(jìn)行60個(gè)循環(huán) 的95°C、30秒，60°C、1分鐘。反應(yīng)結(jié)束后在熒光定量PCR儀上讀取樣品熒光量。步驟4 基因型分析根據(jù)試劑盒使用說明書標(biāo)示的基因分型圖示對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行基因型分析。熟悉熒光定量PCR技術(shù)的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過辨識(shí)熒光定量PCR儀上顯示 的最終樣品熒光量，根據(jù)不同序列探針熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可確定所檢測的SNP位點(diǎn)的基因 型。
權(quán)利要求
一種檢測個(gè)體5 FU抗腫瘤療效與安全性的試劑盒，其特征在于包括檢測5 氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于試劑盒的組分和含量包括 IOX熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液1 μ 1，；25mM dNTP 混合液 0· 1 μ 1,；25mM MgCl2 溶液 0. 6 μ 1，；5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 025 μ 1,；20 μ M特異性引物對(duì)每條引物各0. 225 μ 1，；10 μ M特異性熒光探針對(duì)每條探針各0. 25 μ 1，去離子水5. 325 μ 1。本試劑盒供一人份檢測應(yīng)用，試劑盒的保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測個(gè)體5-FU抗腫瘤療效與安全性的試劑盒。該試劑盒包括檢測5-氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性位點(diǎn)的特異性引物對(duì)及特異性熒光探針對(duì)、熒光定量PCR常規(guī)組件等。本發(fā)明的試劑盒通過檢測5-氟尿嘧啶藥物用藥靶向位點(diǎn)DPYD基因多態(tài)性位點(diǎn)來評(píng)估個(gè)體5-FU抗腫瘤療效與安全性。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101928765SQ200910053960
公開日2010年12月29日 申請日期2009年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者馮哲民, 鄒祖燁 申請人:上海主健生物工程有限公司