国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，包括如下步驟，（1）制作切片：將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切片；（2）漂洗切片：將（1）步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗1min；（3）切片的第一次孵育處理；（4）切片的第二次孵育處理；（5）切片的染色處理；（6）經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照，利用ImagePro-plus6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。本發(fā)明的優(yōu)點，經(jīng)過本發(fā)明方法處理的肌纖維顏色深淺明顯、清晰、辨識度高，節(jié)省試驗成本。
【專利說明】一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于利用動物肌纖維活性改良肌肉功能及肌肉品質(zhì)性狀的【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肌纖維是構(gòu)成肌肉的基本單位，肌纖維的形成是極其復(fù)雜的，經(jīng)歷了一個由前體干細(xì)胞發(fā)育為成熟肌纖維的漸進(jìn)過程，大體上可以被分為四個階段:第一階段是來自中胚層的間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)生終末分化形成單核成肌細(xì)胞；第二階段是單核的成肌細(xì)胞融合形成梭形的多核細(xì)胞肌管；第三階段是肌管進(jìn)一步分化形成成肌纖維；第四階段是肌纖維的生長并最終達(dá)到成熟。大多數(shù)陸棲脊椎動物肌纖維發(fā)育的前三個階段在胚胎期基本上就已經(jīng)完成，動物出生后肌纖維的數(shù)目不再改變，肌肉的生長主要依賴于肌纖維長度增加和直徑增大。因此，胚胎期動物肌纖維的發(fā)育將影響其出生后肌肉的產(chǎn)量。而肌纖維類型并不是出生前就確定下來的，在動物生長過程中，它受到品種、年齡、營養(yǎng)、內(nèi)分泌及機(jī)體各級調(diào)控因子的影響。根據(jù)肌纖維的形態(tài)、功能和生理生化特性，可將肌纖維分成不同的類型，在禽類較常用的肌纖維分類方式是根據(jù)所含的酶系及其活性特點，將肌纖維分為三型:慢肌纖維(紅肌纖維、I型、氧化型肌纖維)；快紅肌纖維(中間型纖維、IIa型、快速氧化型纖維)；快白肌纖維(白肌纖維、IIb型、快速酵解型纖維)。將肌纖維的類型區(qū)分開，可以看出不同類型肌纖維的活性和功能，據(jù)報道，胚胎期到新生期也被稱為是次級纖維形成期，是肌纖維類型分化非常重要的時期，胚胎期動物肌纖維的發(fā)育將影響出生后的肌肉產(chǎn)量，胚胎期肌纖維特性是決定肉質(zhì)和代謝的重要因素，因此，在胚胎期進(jìn)行肌纖維類型的準(zhǔn)確判定、及對各種類型肌纖維特性的研究對研究骨骼肌功能及肉品質(zhì)性狀的遺傳改良將具有重要的意義。
[0003]目前現(xiàn)有的方法主要是采用對肌纖維Guth-Samaha肌球蛋白染色方法進(jìn)行骨骼肌肌纖維分型，該方法自上世紀(jì)70年代建立以來，已成為骨骼肌功能相關(guān)研究的重要手段之一。該染色方法的原理是，三磷酸腺苷酶(ATP酶)與肌肉的能量代謝密切相關(guān)，可催化ATP水解生成ADP及無機(jī)磷的反應(yīng)，這一反應(yīng)放出大量能量，用于運送離子進(jìn)出細(xì)胞，同時供給生物體進(jìn)行需能生命過程。利用染色劑將骨骼肌纖維染色后，磷酸與鈣離子結(jié)合，在酶活性處形成無色的磷酸鈣，磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷，再經(jīng)硫化銨處理形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。因此通過這種染色方法，可以根據(jù)不同肌纖維的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色顆粒沉積于肌纖維中。然后，可根據(jù)反應(yīng)的深淺程度區(qū)分不同肌纖維類型。
[0004]現(xiàn)在比較先進(jìn)的Guth-Samaha肌球蛋白染色方法，是刊登在《解剖學(xué)雜志》中的文章“肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技術(shù)”所公開的方法(肌球蛋白三磷酸腺苷酶的染色技術(shù).解剖學(xué)雜志，2004，27:104-105，作者高美欽等)
染色方法主要包括以下步驟:
(1)將肌纖維切片置于固定液中固定5分鐘；
(2)堿性預(yù)孵液(巴比妥納貯備液:巴比妥納206mg，氯化鈣lOOmg，雙蒸水50ml，4g/LNaOH調(diào)pH值至10.4 ± (λ 01)中25°C預(yù)孵10分鐘；
(3)置底物孵育液(巴比妥納貯備液10ml，ATP-二鈉鹽15mg，4g/LNaOH調(diào)pH值至9.4±0.01)中 37°C孵育 60 分鐘；
(4)入2%氯化鈷溶液中室溫反應(yīng)3分鐘；
(5)充分水洗，雙蒸水洗過一遍；
(6)入1%硫化胺溶液反應(yīng)I分鐘；
(7)流水沖洗5分鐘；
(8)脫水、透明、中性樹膠封片。
[0005]上述方法適用于人、鼠等哺乳類動物，但存在所用的試劑配制比較繁復(fù)，并每次都要新鮮配制的問題，限制了該方法的推廣應(yīng)用。同時，由于不同物種骨骼肌肌球蛋白ATP酶的PH值穩(wěn)定性存在差異，利用此染色劑，對鴨骨骼肌中肌纖維不適用，纖維界限不清楚，染色背景深，無法區(qū)分出肌纖維的類型，目前尚未有鴨骨骼肌纖維類型鑒別方法的報道，鴨骨骼肌纖維類型的鑒別技術(shù)尚未建立。
[0006]因此，需要開發(fā)一種簡單方便，能夠快速準(zhǔn)確鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決利用現(xiàn)有相近領(lǐng)域鑒別不出鴨骨骼肌中肌纖維類型，以及現(xiàn)有鴨骨骼肌肌纖維類型鑒別方法空白的缺陷，本發(fā)明提供了一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，實現(xiàn)了利用此方法能夠清晰的鑒別出骨骼肌中各種肌纖維類型的目的。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，本發(fā)明開發(fā)出的一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，包括如下步驟，(I)制作切片:將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切片；
(2)漂洗切片:將(I)步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗Imin ；
(3)切片的第一次孵育處理:經(jīng)(2)步處理的切片置入堿性預(yù)孵育液中，在20?30°C條件下孵育15min，堿性預(yù)孵育液的成份包括氯化鈣、甘氨酸、甲醛、氫氧化鈉；現(xiàn)有方法中將切片漂洗后需要先將切片用甲醛固定，本發(fā)明的方法中省掉了這個步驟，采用在預(yù)孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定帶來的ATP酶活性的降低，從而改進(jìn)了染色效果，同時由于巴比妥納目前很難購買且價格較高，采用在預(yù)孵液中用甘氨酸代替巴比妥納的方法，不僅節(jié)省了試驗成本，又為后續(xù)染色效果的提高提供基礎(chǔ)，堿性預(yù)孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而使經(jīng)后續(xù)步驟后試驗結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。
[0009](4)切片的第二次孵育處理:經(jīng)(3)步處理的切片利用Tris洗液漂洗后，在濾紙上將切片上的液體吸干，置入ATP孵育液中，在溫度為37°C的培養(yǎng)箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、氯化鈣、ATP ;用甘氨酸取代了現(xiàn)有使用的巴比妥納，不僅使試驗成本降低了，經(jīng)過試驗證明，使用甘氨酸孵育處理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纖維顏色深淺明顯，利用顯微鏡觀察也可分辨出肌肉纖維的類型，ATP孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而為后續(xù)染色步驟打下良好的基礎(chǔ)，去除掉一些影響因素，保證染色后的切片各種類型的肌纖維顏色深淺清晰、可辨識。
[0010](5)切片的染色處理:①經(jīng)上步處理的切片用質(zhì)量濃度為13.3g/L氯化鈣溶液洗滌4次，每次I?2min ;②將切片用濾紙吸干后浸潰在質(zhì)量百分比濃度為2%的氯化鈷溶液中3min ;③用純水沖洗切片4次,每次I?2min 再將切片浸潰在質(zhì)量百分比濃度為2%的硫化銨溶液中3?4min ;⑤用流水沖洗切片3min后,純水再清洗一次最后依次用體積百分比濃度為50%、70%、96%、100%的乙醇溶液將切片脫水，用二甲苯透明后中性樹膠封片；由于上述孵育液的改變，染色處理隨之做出相應(yīng)的改變，但方法步驟并沒有增加，試驗難度也沒有增加，卻得到了更好的染色效果。
[0011](6)經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照，利用Image Pro-plus
6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。在染色后采用ImagePro-plus 6.0版本軟件分析圖片，不僅圖片辨識度更清晰了，同時取代了原始的人工手動測量，使得測量速度大大提高，同時也避免了人工操作所帶來的誤差，保證了測量的準(zhǔn)確性。
[0012]步驟(I)將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻后，再移入放有干冰的封閉箱中冷凍lh。由于肌組織的細(xì)胞比較大，特別容易產(chǎn)生冰晶，染色后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量大小不等的空泡，影響ATP酶染色效果，因此首先在樣品的處理上采取先將產(chǎn)氣泡較少的異戊烷冷卻于液氮中，再將組織在充分冷卻的異戊烷中固定30s后，移入放有干冰的封閉箱中，放置I小時，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈，這樣處理一方面能保持肌肉內(nèi)部完整的原始形態(tài)，避免酶的失活，另一方面還解決了傳統(tǒng)的將組織直接放入液氮內(nèi)，組織周圍產(chǎn)生大量的汽化液泡，產(chǎn)生熱割斷效應(yīng)，延遲冷卻速度而產(chǎn)生冰晶的問題。
[0013]步驟(2)和(4)中Tris洗液的配制方法為，在20?30°C條件下，將Tris堿、質(zhì)量濃度19.98g/L氯化鈣溶液、質(zhì)量濃度> 37%的鹽酸、純水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量為，Tris堿的質(zhì)量濃度為10?13g/L，氯化鈣溶液的體積百分比為8?12%，純水的體積百分比為88?92%，添加鹽酸的量為直至Tris洗液的PH值為7.3?7.4時停止。后續(xù)預(yù)孵育液在成份上做出了變化，在方法步驟中，每個處理開始之前或結(jié)束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后續(xù)的步驟，不會帶來其它干擾因素。
[0014]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液的配制方法為，在20_30°C條件下，將氯化鈣、甘氨酸、質(zhì)量百分比濃度為37%的甲醛、質(zhì)量濃度為4g/L的氫氧化鈉混合即可，各成份在預(yù)孵育液的量為，氯化鈣的質(zhì)量濃度為8?12g/L，甘氨酸的質(zhì)量濃度為5?8g/L，甲醛的體積百分比為8?12%，純水的體積百分比為88?92%，添加氫氧化鈉的量為直至堿性預(yù)孵育液PH值為10.39?10.41時停止。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的堿性預(yù)孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20-30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。
[0015]步驟(4)中ATP孵育液的配制方法為，①在20?30°C條件下，將質(zhì)量濃度為
7.51g/L甘氨酸緩-氫氧化鈉沖液、19.98g/L氯化鈣溶液、純水按照2:1:7的體積比混合；②將上步的混合液加熱至37°C;③再在避光的條件下加入ATP，使混合液的PH值為9.59?9.61。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的ATP孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20?30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性，如果室溫低于20度或者高于30度則需要開啟空調(diào)來調(diào)節(jié)。
[0016]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液、步驟(4)中的ATP孵育液保存的溫度均為-15?-25°C。本發(fā)明的堿性預(yù)孵育液、ATP孵育液可以在-15?_25°C保存，使用前解凍即可，免去每次染色前新鮮配制的繁瑣，并且在兩周內(nèi)使用對染色效果并無影響。
[0017]綜上，本發(fā)明的有益效果是，①由于鴨骨骼肌肌組織的細(xì)胞比較大，特別容易產(chǎn)生冰晶，染色后細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量大小不等的空泡，影響ATP酶染色效果，因此首先在樣品的處理上采取先將產(chǎn)氣泡較少的異戊烷冷卻于液氮中，再將組織在充分冷卻的異戊烷中固定30s后，移入放有干冰的箱中，放置I小時，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈，這樣處理一方面能保持肌肉內(nèi)部完整的原始形態(tài)，避免酶的失活，另一方面還解決了傳統(tǒng)的將組織直接放入液氮內(nèi)，組織周圍產(chǎn)生大量的汽化液泡，產(chǎn)生熱割斷效應(yīng)，延遲冷卻速度而產(chǎn)生冰晶的問題；②采用冰凍技術(shù)制備切片，采用統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)切片，利于大量的樣本統(tǒng)計和彼此間的相關(guān)分析；③節(jié)省掉了甲醛固定步驟，采用在預(yù)孵液中加入一定濃度甲醛的方法，防止由于固定帶來的酶活性的降低，從而改進(jìn)了染色效果，同時由于巴比妥納目前很難購買且價格較高，采用在堿性預(yù)孵液和ATP孵育液中用甘氨酸代替巴比妥納的方法，染色效果較佳；④并且本發(fā)明制備出的堿性預(yù)孵液和ATP孵育液，可以在-15?_25°C保存，使用前解凍即可，免去每次染色前新鮮配制的繁瑣，并且在兩周內(nèi)使用對染色效果并無影響；⑤最后，在染色后采用Image Pro-plus 6.0版本軟件分析圖片，取代了原始的人工手動測量，使得測量速度大大提高，同時也避免了人工操作所帶來的誤差，保證了測量的準(zhǔn)確性。因此，本發(fā)明具有試驗成本低、操作便捷、效果穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確優(yōu)點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是實施例一中對巢湖鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖2是采用現(xiàn)有方法對巢湖鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖3是以各種肌纖維類型為橫軸，肌纖維百分比為縱軸的巢湖鴨各種肌纖維百分比在雌性、雄性中的不同柱狀示意圖；
圖4是實施例二中對高郵鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖5是采用現(xiàn)有方法對高郵鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖6是以各種肌纖維類型為橫軸，肌纖維百分比為縱軸的高郵鴨各種肌纖維百分比在雌性、雄性中的不同柱狀示意圖；
圖7是實施例三中對微山麻鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖8是采用現(xiàn)有方法對微山麻鴨肌纖維染色后顯微鏡拍下的圖；
圖9是以各種肌纖維類型為橫軸，肌纖維百分比為縱軸的微山麻鴨各種肌纖維百分比在雌性、雄性中的不同柱狀示意圖；
圖中，1、雄性巢湖鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)；2、雌性巢湖鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)；3、雄性高郵鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)；4、雌性高郵鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)；5、巢湖鴨紅肌纖維；
6、巢湖鴨白肌纖維；7、巢湖鴨中間肌纖維；8、高郵鴨紅肌纖維；9、高郵鴨白肌纖維；10、高郵鴨中間肌纖維；11、微山麻鴨紅肌纖維；12、微山麻鴨白肌纖維；13、微山麻鴨中間肌纖維；14、雄性微山麻鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)；15、雌性微山麻鴨肌纖維的百分比數(shù)據(jù)。
【具體實施方式】
[0019]實施例一:本發(fā)明開發(fā)出的一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，選取的鴨為普通常見品種的鴨，本發(fā)明的方法適用范圍廣，對任何品種的鴨一般都能有鑒別出來其骨骼肌肌纖維的類型，例如，本實施例選取鴨為巢湖鴨，對于巢湖鴨鑒別其骨骼肌中肌纖維類型的方法，包括如下步驟，
(I)制作切片:將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切
片;
①樣本采集:樣本采集:選取在相同的日糧水平下飼喂的同日齡巢湖鴨收集種蛋。種蛋孵化前，進(jìn)行稱重、消毒和編號，蛋重變異系數(shù)在2%以內(nèi)。在相同條件下(溫度為37.5-37.8°C，相對濕度為50-70%)孵化。種蛋入孵后的24小時設(shè)定為I胚齡，于25胚齡每個品種各采樣20只，打開鴨胚的圓端氣室，輕輕挑破外膜，用鑷子輕輕挑出鴨胚，記錄胚重，用眼科鑷剝離腿部皮膚，采集腓腸肌外側(cè)頭，固定于硬紙片上，迅速置入液氮充分冷卻的異戊烷中，向左右迅速而輕柔地晃動30s后，移入放有干冰的箱中，放置lh，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈，然后移入_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫詣e鑒定后，選留5公5母進(jìn)行試驗。
[0020]②制備冰凍切片:啟動Leica CM3050S冰凍切片機(jī)，設(shè)置切片室溫度-25 V，冰凍頭溫度為-20°C，預(yù)冷0.5h ;取出樣本，放入到冰凍切片室中平衡半小時；取出樣品，每只鴨在腓腸肌外側(cè)頭相同位置取樣，切面與肌纖維走向垂直，修成長0.5 cm、寬0.5 cm、厚0.3cm的組織塊；每個冰凍組織塊各做10張連續(xù)切片，切片厚度為12 μ m,室溫干燥5min后，放入載玻片盒中-15?-25°C保存。
[0021](2)漂洗切片:將(I)步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗Imin ；
(3)切片的第一次孵育處理:經(jīng)(2)步處理的切片置入堿性預(yù)孵育液中，在20?30°C條件下孵育15min，堿性預(yù)孵育液的成份包括氯化鈣、甘氨酸、甲醛、氫氧化鈉；現(xiàn)有方法中將切片漂洗后需要先將切片用甲醛固定，本發(fā)明的方法中省掉了這個步驟，采用在預(yù)孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定帶來的ATP酶活性的降低，從而改進(jìn)了染色效果，同時由于巴比妥納目前很難購買且價格較高，采用在預(yù)孵液中用甘氨酸代替巴比妥納的方法，不僅節(jié)省了試驗成本，又為后續(xù)染色效果的提高提供基礎(chǔ)，堿性預(yù)孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而使經(jīng)后續(xù)步驟后試驗結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。
[0022](4)切片的第二次孵育處理:經(jīng)(3)步處理的切片利用Tris洗液漂洗后，在濾紙上將切片上的液體吸干，置入ATP孵育液中，在溫度為37°C的培養(yǎng)箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸緩沖液、氯化鈣、ATP;用甘氨酸取代了現(xiàn)有使用的巴比妥納，不僅使試驗成本降低了，經(jīng)過試驗證明，使用甘氨酸孵育處理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纖維顏色深淺明顯，利用顯微鏡觀察也可分辨出肌肉纖維的類型，ATP孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而為后續(xù)染色步驟打下良好的基礎(chǔ)，去除掉一些影響因素，保證染色后的切片各種類型的肌纖維顏色深淺清晰、可辨識。
[0023](5)切片的染色處理:①經(jīng)上步處理的切片用質(zhì)量濃度為13.3g/L氯化鈣洗液洗滌4次，每次I?2min ;②將切片用濾紙吸干后浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的氯化鈷溶液中3min ;③用純水沖洗切片4次,每次I?2min ;④再將切片浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的硫化銨溶液中3?4min ;⑤用流水沖洗切片3min后，純水再清洗一次；⑥最后依次用體積百分濃度為50%、70%、96%、100%的乙醇溶液將切片脫水，用二甲苯透明后中性樹膠封片；由于上述孵育液的改變，染色處理隨之做出相應(yīng)的改變，但方法步驟并沒有增加，試驗難度也沒有增加，卻得到了更好的染色效果。
[0024](6)經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照，利用Image Pro-plus
6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。在染色后采用ImagePro-plus 6.0版本軟件分析圖片，不僅圖片辨識度更清晰了，同時取代了原始的人工手動測量，使得測量速度大大提高，同時也避免了人工操作所帶來的誤差，保證了測量的準(zhǔn)確性。
[0025]步驟6、觀察與拍照:正置顯微鏡目鏡10倍，物鏡10倍或20倍下觀察切片，每組切片選取1- 2個完整肌束，每只鴨共取6 - 7個肌束，約500個肌纖維。
[0026]用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分析圖片:軟件安裝后，F(xiàn)ile菜單中選open打開圖片；在工具欄中點“放大鏡”工具對需要統(tǒng)計的肌束進(jìn)行放大后，點對話框右上角的放大標(biāo)識，圖片放大后可點對話框上下滾動條滾動圖片。點工具欄中NEW ADI按鈕，再選擇多邊形AOI工具，出現(xiàn)對話框，點擊“Trace”尋跡工具，通過在細(xì)胞邊緣多次點擊左鍵圈住細(xì)胞，單擊右鍵完成選擇，點擊工具欄中多重AOI工具按鈕，選中“add”完成第I個肌細(xì)胞的選擇。圈第2個肌細(xì)胞時，需要再點擊NEW ADI按鈕，在細(xì)胞邊緣多次點擊左鍵圈第2個肌細(xì)胞，單擊右鍵完成選擇，依次點擊直至選完整個肌束中的所有肌細(xì)胞。在measure菜單中選擇count/size,在出現(xiàn)的對話框中選擇Measure菜單中的select measurement,選擇area、Density (mean)和Diameter (mean)3個參數(shù)后，點擊OK,完成參數(shù)選擇。count/size對話框中選擇Edit菜單中的 convert AOI (S) to object (S),選擇 View菜單中的MeasurementsDate,結(jié)果顯不在Measurements Date對話框中。count/size對話框中選擇File菜單中Export date即可將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel中。
[0027]步驟(2)和(4)中Tris洗液的配制方法為，在20?30°C條件下，將Tris堿、質(zhì)量濃度為19.98g/L氯化鈣溶液、質(zhì)量百分比濃度>37%的鹽酸、純水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量為，Tris堿的質(zhì)量濃度為10g/L，氯化鈣的體積百分比為8%，純水的體積百分比為88%，添加鹽酸的量為直至Tris洗液的PH值為7.3時停止。后續(xù)預(yù)孵育液在成份上做出了變化，在方法步驟中，每個處理開始之前或結(jié)束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后續(xù)的步驟，不會帶來其它干擾因素。
[0028]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液的配制方法為，在20?30°C條件下，將氯化鈣、甘氨酸、質(zhì)量百分比濃度為37%的甲醛、質(zhì)量濃度為4g/L的氫氧化鈉混合即可，各成份在預(yù)孵育液的量為，氯化鈣的質(zhì)量濃度為8g/L，甘氨酸的質(zhì)量濃度為5g/L，甲醛的體積百分比為8%，純水的體積百分比為88%，添加氫氧化鈉的量為直至堿性預(yù)孵育液PH值為10.39?10.41時停止。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的堿性預(yù)孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20?30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。
[0029]步驟(4)中ATP孵育液的配制方法為，①在20?30°C條件下，將質(zhì)量濃度為
7.51g/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、19.98g/L氯化鈣溶液、純水按照2:1:7的體積比混合；②將上步的混合液加熱至37°C;③再在避光的條件下加入ATP，使混合液的PH值為9.59?
9.61。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的ATP孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20?30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。
[0030]甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液的配制方法為，125mL甘氨酸(將7.51g的甘氨酸溶于250mL純水)，加入到42mL 32g/L NaOH,加水至500mL配制而成。
[0031]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液、步驟(4)中的ATP孵育液保存的溫度均為-15?-25°C。本發(fā)明的堿性預(yù)孵育液、ATP孵育液可以在-15?_25°C保存，使用前解凍即可，免去每次染色前新鮮配制的繁瑣，并且在兩周內(nèi)使用對染色效果并無影響。
[0032]本試驗方法的原理為，三磷酸腺苷酶或ATP酶(adenosinetriphosphatase ；ATPase)與肌肉的能量代謝密切相關(guān)，可催化ATP水解生成ADP及無機(jī)磷的反應(yīng)，這一反應(yīng)放出大量能量，用于運送離子進(jìn)出細(xì)胞，同時供給生物體進(jìn)行需能生命過程。磷酸與鈣離子結(jié)合，在酶活性處形成無色的磷酸鈣，磷酸鈣經(jīng)氯化鈷處理形成磷酸鈷，再經(jīng)硫化銨處理形成棕黑色的硫化鈷沉淀在酶活性部位。因此通過肌球蛋白ATP酶染色，可以根據(jù)不同纖維的ATP酶的酶活性的高低，形成不同量的棕黑色顆粒沉積于肌纖維中。然后，可根據(jù)反應(yīng)的深淺程度區(qū)分不同肌纖維類型。在堿性預(yù)孵液中，紅肌纖維含有較低的ATP酶活性，遇堿不穩(wěn)定，顯示為不著色或很淡的著色；白肌纖維含有較高的ATP酶活性，遇堿穩(wěn)定，顯示為棕黑色；而ATP酶活性一般的肌纖維，著色程度介于這兩者顏色之間，即為中間型纖維。
[0033]本實施例的試驗結(jié)果為，在顯微鏡下可以清楚的對肌纖維類型判定:如圖1所示，可以看到顏色深淺相區(qū)別的三種肌纖維類型，箭頭5指向著色淡的為紅肌纖維，屬于慢肌纖維的一類，箭頭6指向著色深的為白肌纖維，屬于快白肌纖維的一類，箭頭7指向介于兩種顏色之間的為中間肌纖維，屬于快紅肌纖維的一類，經(jīng)本發(fā)明染色方法，在顏色上有很好的區(qū)分度，如圖2所示，為現(xiàn)有方法染色的切片，在顏色上的區(qū)分度沒有本發(fā)明區(qū)分的好。
[0034]再利用光密度值確認(rèn)結(jié)果，確定白肌纖維和紅肌纖維，本發(fā)明用5公、5母，每只鴨連續(xù)10個切片做了平行試驗，根據(jù)Image-Pro Plus 6.0中給出的平均光密度值(Density (mean))進(jìn)行排序，分別得出紅肌纖維光密度值的范圍(165-185)和白肌纖維光密度值的范圍(110-145)，紅肌纖維光密度值要大于白肌纖維，故肌纖維類型的判定依據(jù)是:光密度值小于145的為白肌纖維，光密度值在145-165之間的為中間型纖維，光密度值大于165的為紅肌纖維，根據(jù)如上規(guī)則，進(jìn)行對比，分析出肌纖維類型。
[0035]公、母巢湖鴨中各種類型肌纖維的比例，如圖3所示，I代表雄性肌纖維百分比，2代表雌性肌纖維百分比，每個個體腓腸肌外側(cè)頭不同類型肌纖維的百分比=該種類型肌纖維的個數(shù)/統(tǒng)計的肌纖維總數(shù)。結(jié)果表明，巢湖鴨胚胎期25胚齡不同類型肌纖維的比例在性別之間并不存在顯著的差異，腓腸肌外側(cè)頭是一種混合型肌肉，其中白肌纖維比例最高(雌性51.83%，雄性為51.03%)，中間型纖維比例次之(雌性24.53%，雄性為28.80%)，紅肌纖維比例最低(雌性23.63%，雄性為20.13%)。
[0036]實施例二:利用本發(fā)明方法對胚胎期的高郵鴨，骨骼肌中肌纖維做類型的鑒別，對于胚胎期肌纖維類型的鑒別，可以看出哪種肌纖維的活力高，可以應(yīng)用此結(jié)論進(jìn)行轉(zhuǎn)基因品種的改進(jìn)，從而使鴨各種類型肌肉發(fā)達(dá)，對品種做出了改良。
[0037]本發(fā)明鑒定鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，包括如下步驟，(I)制作切片:將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切片；
具體操作方法為:①樣本采集:選取在相同的日糧水平下飼喂的同日齡高郵種鴨收集種蛋。種蛋孵化前，進(jìn)行稱重、消毒和編號，蛋重變異系數(shù)在2%以內(nèi)。在相同條件下(溫度為37.5-37.8°C，相對濕度為50-70%)孵化。種蛋入孵后的24小時設(shè)定為I胚齡，于25胚齡各采樣20只，打開鴨胚的圓端氣室，輕輕挑破外膜，用鑷子輕輕挑出鴨胚，記錄胚重，用眼科鑷剝離腿部皮膚，采集腓腸肌外側(cè)頭，固定于硬紙片上，迅速置入液氮充分冷卻的異戊烷中，向左右迅速而輕柔地晃動30s后，移入放有干冰的箱中，放置lh，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈，然后移入_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫詣e鑒定后，選留5公5母進(jìn)行試驗。
[0038]②制備冰凍切片:啟動Leica CM3050S冰凍切片機(jī)，設(shè)置切片室溫度-25 V，冰凍頭溫度為-20°C，預(yù)冷0.5h ;取出樣本，放入到冰凍切片室中平衡半小時；取出樣品，每只鴨在腓腸肌外側(cè)頭相同位置取樣，切面與肌纖維走向垂直，修成長0.5 cm、寬0.5 cm、厚0.3cm的組織塊；每個冰凍組織塊各做10張連續(xù)切片，切片厚度為12 μ m,室溫干燥5min后，放入載玻片盒中_20°C保存。
[0039](2)漂洗切片:將(I)步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗Imin ；
(3)切片的第一次孵育處理:經(jīng)(2)步處理的切片置入堿性預(yù)孵育液中，在20?30°C條件下孵育15min，堿性預(yù)孵育液的成份包括氯化鈣、甘氨酸、甲醛、氫氧化鈉；
(4)切片的第二次孵育處理:經(jīng)(3)步處理的切片利用Tris洗液漂洗后，在濾紙上將切片上的液體吸干，置入ATP孵育液中，在溫度為37°C的培養(yǎng)箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、氯化鈣、ATP ；
(5)切片的染色處理:①經(jīng)上步處理的切片用質(zhì)量濃度為13.3g/L氯化鈣洗液洗滌4次，每次I?2min ;②將切片用濾紙吸干后浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的氯化鈷溶液中3min ;③用純水沖洗切片4次,每次I?2min ;④再將切片浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的硫化銨溶液中3?4min ;⑤用流水沖洗切片3min后，純水再清洗一次；⑥最后依次用體積百分濃度為50%、70%、96%、100%的乙醇溶液將切片脫水，用二甲苯透明后中性樹膠封片；
(6)經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照,利用ImagePro-plus 6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。
[0040]步驟(2)和(4)中Tris洗液的配制方法為，在20?30°C條件下，將Tris堿、質(zhì)量濃度為19.98g/L氯化鈣溶液、質(zhì)量百分比濃度>37%的鹽酸、純水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量為，Tris堿的質(zhì)量濃度為13g/L，氯化鈣的體積百分比為12%，純水的體積百分比為92%，添加鹽酸的量為直至Tris洗液的PH值為7.4時停止。[0041]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液的配制方法為，在20?30°C條件下，將氯化鈣、甘氨酸、質(zhì)量百分比濃度為37%的甲醛、質(zhì)量濃度為4g/L的氫氧化鈉混合即可，各成份在預(yù)孵育液的量為，氯化鈣的質(zhì)量濃度為12g/L，甘氨酸的質(zhì)量濃度為8g/L，甲醛的體積百分比為12%，純水的體積百分比為92%，添加氫氧化鈉的量為直至堿性預(yù)孵育液PH值為10.39?
10.41時停止。
[0042]步驟(4)中ATP孵育液的配制方法為，①在20?30°C條件下，將質(zhì)量濃度為
7.51g/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、19.98g/L氯化鈣溶液、純水按照2:1:7的體積比混合；
②將上步的混合液加熱至37°C;③再在避光的條件下加入ATP，使混合液的PH值為9.59?
9.61。
[0043]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液、步驟(4)中的ATP孵育液保存的溫度均為-15 ?-25°C。
[0044]本實施例的試驗結(jié)果為，在顯微鏡下可以清楚的對肌纖維類型判定:如圖4所示，可以看到顏色深淺相區(qū)別的三種肌纖維類型，箭頭8指向著色淡的為紅肌纖維，屬于慢肌纖維的一類，箭頭9指向著色深的為白肌纖維，屬于快白肌纖維的一類，箭頭10指向介于兩種顏色之間的為中間肌纖維，屬于快紅肌纖維的一類，經(jīng)本發(fā)明染色方法，在顏色上有很好的區(qū)分度，現(xiàn)有方法染色的切片，如圖5所示，在顏色上的區(qū)分度沒有本發(fā)明區(qū)分的好。
[0045]再利用光密度值確認(rèn)結(jié)果，確定白肌纖維和紅肌纖維，本發(fā)明用5公、5母，每只鴨連續(xù)10個切片做了平行試驗，根據(jù)Image-Pro Plus 6.0中給出的平均光密度值(Density (mean))進(jìn)行排序，分別得出紅肌纖維光密度值的范圍(163-185)和白肌纖維光密度值的范圍(111-147)，紅肌纖維光密度值要大于白肌纖維，故肌纖維類型的判定依據(jù)是:光密度值小于147值的為白肌纖維，光密度值在147- 163之間的為中間型纖維，光密度值大于163的為紅肌纖維，根據(jù)如上規(guī)則，進(jìn)行對比，分析出肌纖維類型。
[0046]如圖6所示，高郵鴨25胚齡腓腸肌外側(cè)頭不同類型肌纖維的比例:每個個體腓腸肌外側(cè)頭不同類型肌纖維的百分比=該種類型肌纖維的個數(shù)/統(tǒng)計的肌纖維總數(shù)。3代表雄性肌纖維的百分比，4代表雌性肌纖維比百分比，結(jié)果表明，高郵鴨胚胎期25胚齡不同類型肌纖維的比例在性別之間并不存在顯著的差異，腓腸肌外側(cè)頭是一種混合型肌肉，其中白肌纖維比例最高(雌性46.46%，雄性為44.22%)，中間型纖維比例次之(雌性25.60%，雄性為32.39%)，紅肌纖維比例最低(雌性27.94%，雄性為23.39%)。
[0047]實施例三:本發(fā)明開發(fā)出的一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，選取的鴨為普通常見品種的鴨，本發(fā)明的方法適用范圍廣，對任何品種的鴨一般都能有鑒別出來其骨骼肌肌纖維的類型，本實施例選取的是微山麻鴨，鑒別其骨骼肌中肌纖維類型的方法，包括如下步驟，
(I)制作切片:將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切
片;
①樣本采集:選取在相同的日糧水平下飼喂的同日微山麻鴨，采集骨骼肌，具體的為采集腓腸肌外側(cè)頭，固定于硬紙片上，迅速置入液氮充分冷卻的異戊烷中，向左右迅速而輕柔地晃動30s后，移入放有干冰的封閉箱中，放置lh，使組織周圍的異戊烷揮發(fā)干凈，然后移入_80°C超低溫冰箱保存?zhèn)溆茫詣e鑒定后，選留5公5母進(jìn)行試驗。
[0048]②制備冰凍切片:啟動Leica CM3050S冰凍切片機(jī)，設(shè)置切片室溫度-25 V，冰凍頭溫度為-20°C，預(yù)冷0.5h ;取出樣本，放入到冰凍切片室中平衡半小時；取出樣品，每只鴨在腓腸肌外側(cè)頭相同位置取樣，切面與肌纖維走向垂直，修成長0.5 cm、寬0.5 cm、厚0.3cm的組織塊；每個冰凍組織塊各做10張連續(xù)切片，切片厚度為12 μ m,室溫干燥5min后，放入載玻片盒中_20°C保存。
[0049](2)漂洗切片:將(I)步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗Imin ；
(3)切片的第一次孵育處理:經(jīng)(2)步處理的切片置入堿性預(yù)孵育液中，在20?30°C條件下孵育15min，堿性預(yù)孵育液的成份包括氯化鈣、甘氨酸、甲醛、氫氧化鈉；現(xiàn)有方法中將切片漂洗后需要先將切片用甲醛固定，本發(fā)明的方法中省掉了這個步驟，采用在預(yù)孵液中加入甲醛的方法，防止由于固定帶來的后續(xù)要加入的ATP酶活性的降低，從而改進(jìn)了染色效果，同時由于巴比妥納目前很難購買且價格較高，采用在預(yù)孵液中用甘氨酸代替巴比妥納的方法，不僅節(jié)省了試驗成本，又為后續(xù)染色效果的提高提供基礎(chǔ)，堿性預(yù)孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而使經(jīng)后續(xù)步驟后試驗結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定。
[0050](4)切片的第二次孵育處理:經(jīng)(3)步處理的切片利用Tris洗液漂洗后，在濾紙上將切片上的液體吸干，置入ATP孵育液中，在溫度為37°C的培養(yǎng)箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、氯化鈣、ATP ;用甘氨酸取代了現(xiàn)有使用的巴比妥納，不僅使試驗成本降低了，經(jīng)過試驗證明，使用甘氨酸孵育處理后，染色效果更佳，染色后的切片肌肉纖維顏色深淺明顯，利用顯微鏡觀察也可分辨出肌肉纖維的類型，ATP孵育液成份作出改變，預(yù)孵育的溫度、時間這些條件都是經(jīng)過試驗得出孵育效果最好的參數(shù)，不斷重復(fù)整個方法的步驟，用各種溫度和時間參數(shù)去試驗，最終得到的溫度和時間是能使肌肉保持原有的活性，從而為后續(xù)染色步驟打下良好的基礎(chǔ)，去除掉一些影響因素，保證染色后的切片各種類型的肌纖維顏色深淺清晰、可辨識。
[0051](5)切片的染色處理:①經(jīng)上步處理的切片用質(zhì)量濃度為13.3g/L氯化鈣洗液洗滌4次，每次I?2min ;②將切片用濾紙吸干后浸潰在質(zhì)量濃度為2%的氯化鈷溶液中3min ；
③用純水沖洗切片4次，每次I?2min ;④再將切片浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的硫化銨溶液中3?4min ;⑤用流水沖洗切片3min后，純水再清洗一次；⑥最后依次用體積百分濃度為50%、70%、96%、100%的乙醇溶液將切片脫水，用二甲苯透明后中性樹膠封片；
由于上述孵育液的改變，染色處理隨之做出相應(yīng)的改變，但方法步驟并沒有增加，試驗難度也沒有增加，卻得到了更好的染色效果。
[0052](6)經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照，利用Image Pro-plus
6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。在染色后采用ImagePro-plus 6.0版本軟件分析圖片，不僅圖片辨識度更清晰了，同時取代了原始的人工手動測量，使得測量速度大大提高，同時也避免了人工操作所帶來的誤差，保證了測量的準(zhǔn)確性。
[0053]步驟6、觀察與拍照:正置顯微鏡目鏡10倍，物鏡10倍或20倍下觀察切片，每組切片選取1- 2個完整肌束，每只鴨共取6 - 7個肌束，約500個肌纖維。
[0054]用Image-Pro Plus 6.0分析軟件分析圖片:軟件安裝后，F(xiàn)ile菜單中選open打開圖片；在工具欄中點“放大鏡”工具對需要統(tǒng)計的肌束進(jìn)行放大后，點對話框右上角的放大標(biāo)識，圖片放大后可點對話框上下滾動條滾動圖片。點工具欄中NEW ADI按鈕，再選擇多邊形AOI工具，出現(xiàn)對話框，點擊“Trace”尋跡工具，通過在細(xì)胞邊緣多次點擊左鍵圈住細(xì)胞，單擊右鍵完成選擇，點擊工具欄中多重AOI工具按鈕，選中“add”完成第I個肌細(xì)胞的選擇。圈第2個肌細(xì)胞時，需要再點擊NEW ADI按鈕，在細(xì)胞邊緣多次點擊左鍵圈第2個肌細(xì)胞，單擊右鍵完成選擇，依次點擊直至選完整個肌束中的所有肌細(xì)胞。在measure菜單中選擇count/size,在出現(xiàn)的對話框中選擇Measure菜單中的select measurement,選擇area、Density (mean)和Diameter (mean)3個參數(shù)后，點擊OK,完成參數(shù)選擇。count/size對話框中選擇Edit 菜單中的 convert AOI (S) to object (S),選擇 View菜單中的MeasurementsDate,結(jié)果顯不在Measurements Date對話框中。count/size對話框中選擇File菜單中Export date即可將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel中。
[0055]步驟(2)和(4)中Tris洗液的配制方法為，在20?30°C條件下，將Tris堿、質(zhì)量濃度為19.98g/L氯化鈣溶液、質(zhì)量百分比濃度>37%的鹽酸、純水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量為，Tris堿的質(zhì)量濃度為12g/L，氯化鈣的體積百分比為10%，純水的體積百分比為90%，添加鹽酸的量為直至Tris洗液的PH值為7.3時停止。后續(xù)預(yù)孵育液在成份上做出了變化，在方法步驟中，每個處理開始之前或結(jié)束之后都要用Tris漂洗，因此漂洗液的成份配合后續(xù)的步驟，不會帶來其它干擾因素。
[0056]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液的配制方法為，在20?30°C條件下，將氯化鈣、甘氨酸、質(zhì)量百分比濃度為37%的甲醛、質(zhì)量濃度為4g/L的氫氧化鈉混合即可，各成份在預(yù)孵育液的量為，氯化鈣的質(zhì)量濃度為9g/L，甘氨酸的質(zhì)量濃度為7g/L，甲醛的體積百分比為9%，純水的體積百分比為90%，添加氫氧化鈉的量為直至堿性預(yù)孵育液PH值為10.39?10.41時停止。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的堿性預(yù)孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20?30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。
[0057]步驟(4)中ATP孵育液的配制方法為，①在20?30°C條件下，將質(zhì)量濃度為
7.51g/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、19.98g/L氯化鈣溶液、純水按照2:1:7的體積比混合；
②將上步的混合液加熱至37°C;③再在避光的條件下加入ATP，使混合液的PH值為9.59?
9.61。在使用甘氨酸替換了現(xiàn)有的成份做出了新的ATP孵育液時，與之相混合的各成份混合在一起效果好，所用的配合劑、量都是經(jīng)過試驗得到最終能夠?qū)η衅旧⑷旧Ч枚脕淼模瑢h(huán)境溫度定為20?30度，避免了因為溫度差影響配制試劑的最終PH值，從而確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。
[0058]步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液、步驟(4)中的ATP孵育液保存的溫度均為-15?-25°C。本發(fā)明的堿性預(yù)孵育液、ATP孵育液可以在-15?_25°C保存，使用前解凍即可，免去每次染色前新鮮配制的繁瑣，并且在兩周內(nèi)使用對染色效果并無影響。
[0059]本實施例的試驗結(jié)果為，在顯微鏡下可以清楚的對肌纖維類型判定:如圖7所示，可以看到顏色深淺相區(qū)別的三種肌纖維類型，箭頭11指向著色淡的為紅肌纖維，屬于慢肌纖維的一類，箭頭12指向著色深的為白肌纖維，屬于快白肌纖維的一類，箭頭13指向介于兩種顏色之間的為中間肌纖維，屬于快紅肌纖維的一類，經(jīng)本發(fā)明染色方法，在顏色上有很好的區(qū)分度，現(xiàn)有方法染色的切片，如圖8所示，在顏色上的區(qū)分度沒有本發(fā)明區(qū)分的好。
[0060]再利用光密度值確認(rèn)結(jié)果，確定白肌纖維和紅肌纖維，本發(fā)明用5公、5母，每只鴨連續(xù)10個切片做了平行試驗，根據(jù)Image-Pro Plus 6.0中給出的平均光密度值(Density (mean))進(jìn)行排序，分別得出紅肌纖維光密度值的范圍(160-180)和白肌纖維光密度值的范圍(105-135)，紅肌纖維光密度值要大于白肌纖維，故肌纖維類型的判定依據(jù)是:光密度值小于135值的為白肌纖維，光密度值在135-160之間的為中間型纖維，光密度值大于160的為紅肌纖維，根據(jù)如上規(guī)則，進(jìn)行對比，分析出肌纖維類型。
[0061]如圖9所示，14代表的是雄性纖維百分比，15代表的是雌性纖維百分比，微山麻鴨25胚齡腓腸肌外側(cè)頭不同類型肌纖維的比例:每個個體腓腸肌外側(cè)頭不同類型肌纖維的百分比=該種類型肌纖維的個數(shù)/統(tǒng)計的肌纖維總數(shù)。結(jié)果表明，微山麻鴨胚胎期25胚齡不同類型肌纖維的比例在性別之間并不存在顯著的差異，腓腸肌外側(cè)頭是一種混合型肌肉，其中白肌纖維比例(雌性51.83%，雄性為47.58%)，中間型纖維(雌性22.70%，雄性為25.56%)，紅肌纖維(雌性23.30%，雄性為26.86%)。
[0062]上述技術(shù)方案僅體現(xiàn)了本發(fā)明技術(shù)方案的優(yōu)選技術(shù)方案，本【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員對其中某些部分所可能做出的一些變動均體現(xiàn)了本發(fā)明的原理，屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟，(I)制作切片:將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻，采用冷凍切片法制作出切片； (2)漂洗切片:將(I)步制作好的切片置于載玻片上，在室溫條件下，自然晾干至切片發(fā)白，利用Tris洗液漂洗兩次，每次漂洗Imin ； (3)切片的第一次孵育處理:經(jīng)(2)步處理的切片置入堿性預(yù)孵育液中，在20?30°C條件下孵育15min，堿性預(yù)孵育液的成份包括氯化鈣、甘氨酸、甲醛、氫氧化鈉； (4)切片的第二次孵育處理:經(jīng)(3)步處理的切片利用Tris洗液漂洗后，在濾紙上將切片上的液體吸干，置入ATP孵育液中，在溫度為37°C的培養(yǎng)箱中孵育60min，ATP孵育液的成份包括甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、氯化鈣、ATP ； (5)切片的染色處理:①經(jīng)上步處理的切片用質(zhì)量濃度為13.3g/L氯化鈣溶液洗滌4次，每次I?2min ;②將切片用濾紙吸干后浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的氯化鈷溶液中3min ;③用純水沖洗切片4次，每次I?2min ;④再將切片浸潰在質(zhì)量百分濃度為2%的硫化銨溶液中3?4min ;⑤用流水沖洗切片3min后,純水再清洗一次；⑥最后依次用體積百分濃度為50%、70%、96%、100%的乙醇溶液將切片脫水，用二甲苯透明后中性樹膠封片； (6)經(jīng)上步染色處理后的切片用照相顯微鏡觀察并拍照,利用ImagePro-plus 6.0軟件測得的不同光密度值即可判定鴨骨骼肌中肌纖維的類型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，步驟(I)將鴨的骨骼肌肉利用液氮-異戊烷體系冷卻后，再移入放有干冰的封閉箱中冷凍lh。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，步驟(2)和(4)中Tris洗液的配制方法為，在20?30°C條件下，將Tris堿、質(zhì)量濃度為19.98g/L氯化鈣溶液、質(zhì)量百分比濃度> 37%的鹽酸、純水混合即可，各成份在Tris洗液中的含量為，Tris堿的質(zhì)量濃度為10?13g/L，氯化鈣溶液的體積百分比為8?12%，純水的體積百分比為88?92%，添加鹽酸的量為直至Tris洗液的PH值為7.3?7.4時停止。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液的配制方法為，在20?30°C條件下，將氯化鈣、甘氨酸、質(zhì)量百分比濃度為37%的甲醛、質(zhì)量濃度為4g/L的氫氧化鈉混合即可，各成份在預(yù)孵育液的量為，氯化鈣的質(zhì)量濃度為8?12g/L，甘氨酸的質(zhì)量濃度為5?8g/L，甲醛的體積百分比為8?12%，純水的體積百分比為88?92%，添加氫氧化鈉的量為直至堿性預(yù)孵育液PH值為10.39?10.41時停止。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，步驟(4)中ATP孵育液的配制方法為，①在20?30°C條件下，將質(zhì)量濃度為7.51g/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、19.98g/L氯化鈣溶液、純水按照2:1:7的體積比混合；②將上步的混合液加熱至370C ;③再在避光的條件下加入ATP，使混合液的PH值為9.59?9.61。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述鑒別鴨骨骼肌中肌纖維類型的方法，其特征在于，步驟(3)中的堿性預(yù)孵育液、步驟(4)中的ATP孵育液保存的溫度均為-15?-25°C。
【文檔編號】G01N21/84GK103512885SQ201310472219
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】李慧芳, 束婧婷, 朱文奇, 單艷菊, 宋衛(wèi)濤, 徐文娟, 胡艷, 朱春紅, 陶志云, 宋遲, 章雙杰, 章明, 劉宏祥, 姬改革 申請人:江蘇省家禽科學(xué)研究所, 江蘇騰達(dá)源農(nóng)牧有限公司