一種可用于全血檢測的快捷去除紅細胞的方法
【專利摘要】本發明涉及醫藥衛生領域，提供了一種簡單且快速的有效分離血紅細胞的方法。該方法結合免疫凝集與磁性分離技術，通過羊抗人血紅細胞抗體與血紅細胞形成抗原-抗體復合物，再與包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球發生免疫吸附從而產生更為強烈的凝集反應，進而磁性分離達到去除紅細胞的目的。該發明通過簡單快速的方法去除樣本中的紅細胞，可應用于全自動和半自動化學發光儀，以便于實現普通試劑盒的全血檢測。
【專利說明】-種可用于全血檢測的快捷去除紅細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥衛生領域，提供了一種簡單且快速有效分離血紅細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 目前臨床上血清分離的方法為采血后，采血管靜置30分鐘,通過離心將紅細胞、 白細胞、血小板與血清分開。由于離心過程中產生一定的離心力，這種離心力會導致血紅細 胞堆積從而導致細胞的破裂造成溶血。離心是一個復雜的過程，尤其是在樣本量大的時候， 即使是熟練的操作人員很難保證操作每份樣本的均一性。相關文獻報道，由離心分離操作 不當導致的溶血，占溶血現象的41. 2%。
[0003] 紅細胞會干擾常規試劑盒中免疫磁珠捕獲抗原的性能，這也是諸多常規的化學發 光試劑無法檢測全血樣本的原因，此外紅細胞的破裂會造成大量的血紅蛋白、高濃度離子 或酶釋放，會引起測量誤差，從而極大降低了標本檢測的準確性。在檢測過程中，溶血現象 會增加假性的比例。
[0004] 此外，常規的血紅細胞分離手段耗時較長，且操作復雜，一旦樣本量增大將會帶來 極大的人工成本。此外，某些項目的分子標志物半衰期非常短，僅為十幾分鐘，此時快速的 檢測，可以更準確、真實的反應待測分子的含量；在心肌梗塞患者中，更會體現精短的測量 時間帶來的優勢，有利于為患者爭取寶貴的時間以便在第一時間內進行治療。
[0005] 例如在PCT的檢測過程中發現它在細菌感染時升高，并且其升高程度與感染 嚴重程度、病情預后密切相關。近年來隨著研究的深入，發現在細菌感染初期，已經有 PCT低水平的升高，文獻報道，健康人體內PCT的含量不超過0.05ng/ml ;PCT含量介于 0. 05-0. 25ng/ml之間時預示著有輕微感染不推薦使用抗生素治療，需做進一步觀察；當 PCT含量大于0. 25ng/ml且小于0. 5ng/ml時有局部感染，推薦使用抗生素。常規檢測全血 樣本雖然在強陽性樣本存在的情況下有不錯的相關性，但是斜率遠小于1，表明了其準確度 不夠，在0.05ng/ml以下的濃度時會產生很大程度上的假陽性。因此對醫生的判斷造成了 干擾。該發明的全血處理試劑盒處理后檢測全血樣本中PCT含量的相關性和斜率均要優于 常規測試，這一現象尤其在< 0. 5ng/ml的低值處尤為明顯，這給醫生對病人提供治療方案 起到了積極作用。本發明提供的這種利用免疫反應及磁性分離快速去除紅細胞的方法，操 作簡單，可大幅縮短紅細胞去除的時間，并大大減少了溶血現象的發生，且可應用于全自動 和半自動化學發光儀，配合相應的體外診斷試劑盒進行全血樣本的檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是為克服現有技術的上述不足，提供了一種利用免疫反應及磁性分 離快速去除紅細胞的方法。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種樣本處理試劑盒，可以解決傳統的化學發光試劑無 法實現全血檢測的問題。
[0008] 為解決上述問題，本發明采用以下技術方案予以實現：
[0009] -種利用免疫反應及磁性分離快速去除紅細胞的方法。其通過羊抗人血紅細胞抗 體與血紅細胞發生抗原抗體反應形成紅細胞-羊抗人血紅細胞抗體復合體產生凝集，這種 復合體被包被有鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球捕獲，進而通過磁性分離達到去除 紅細胞的目的。該發明可應用于全自動和半自動化學發光儀，以便于實現化學發光法體外 診斷試劑盒檢測全血樣本。
[0010] 所述的羊抗人血紅細胞的抗體為可特異性識別血紅細胞的單抗。
[0011] 所述的鼠抗羊Fc端的單克隆抗體為可特異性識別羊多抗的Fc端的鼠單克隆抗 體。
[0012] 所述用于包被鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球，是指粒徑在0. 2-50 μ m之 間，表面修飾羧基、氨基、氯甲基等化學功能基團的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
[0013] 一種全血處理試劑盒，包括A液：含羊抗人血紅細胞抗體的緩沖液；B液：共價偶 聯了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微球懸浮液。
[0014] 所述的A液中儲存抗體緩沖液的組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN 3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0015] 所述的B液中儲存磁珠的緩沖液組分為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖 液等pH在5-9之間的緩沖液，其中氯化鈉的含量在lmM-300mM之間，防腐劑為P300、NaN3、 硫柳萊中的一種或者幾種，保護蛋白為BSA、0VA、釀蛋白中的一種或者幾種。
[0016] 上述檢測試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0017] 1)配制 20mM PBS緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1% 的P300,5mg/ml BSA，pH7. 4， 構成抗體的儲存液。
[0018] 2)配制 50mM Tris 緩沖液，其中含氯化鈉 150mM，0. 1 % 的 P300,5mg/ml BSA， pH7. 6,構成磁珠儲存液。
[0019] 3)制備共價偶聯了鼠抗羊Fc端的單克隆抗體的磁性微粒：用活化緩沖液活化納 米粒表面化學基團，活化完成后使用偶聯緩沖液清洗磁性微粒，加入相當于磁性微粒質量 的1/20的單克隆抗體，反應后使用封閉緩沖液封閉納米粒上空余的活化基團，既得鼠抗羊 Fc磁性微粒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為常規方法檢測全血樣本PCT含量
[0021] 圖2為使用本發明方法檢測全血樣本PCT含量
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步的描述，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。
[0023] 實施例
[0024] 1.實驗目的：
[0025] 驗證本發明所闡述的快捷去除紅細胞的方法輔助化學發光體外診斷試劑盒檢測 全血樣本中的應用。
[0026] 2.實驗器材和試劑：
[0027] 化學發光儀（深圳新產業maglumi)，恒溫水浴鍋（HH-60,常州國華電器有限公 司），微量移液器（Thermo公司），磁性分離架（天津倍思樂色譜技術開發中心）。PCT校 準品（Audit 公司），PBS-T 緩沖液（KH2P04 3. 35g/L，Na2HP04-12H20 17. 9g/L，KC1 0· 2g/L， NaC18. 77g/L，Tween-20 (λ 5g/L，ρΗ7· 2)，PCT 校準品稀釋液為含 20%牛血清的 PBS-T 緩沖 液，PCT檢測試劑盒（深圳新產業），全血處理試劑盒的制備同說明書中闡述的制備方法。
[0028] 3.實驗步驟：
[0029] 3. 1收集50份已知PCT濃度的血液樣本，其中含20份陽性血液標本和30份陰性 血液標本。
[0030] 3. 2. 1常規PCT試劑盒檢測全血樣本
[0031] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，按照PCT檢測試劑盒說 明書中的要求進行操作。
[0032] 3. 2. 2樣本經過該發明的全血處理試劑盒處理后檢測
[0033] 溫和的顛倒樣本使樣本里面的全血混勻，取100微升樣本，加入40微升A液，充分 混勻，37°C溫育1分鐘；加入10微升B液，充分混勻，37°C溫育5分鐘，進行磁性分離，將上 清吸出，按照PCT檢測試劑盒說明書中的要求操作該上清。
【權利要求】
1. 一種有效分離血紅細胞的方法，該方法可快速有效的去除血液樣本中的紅細胞，并 減少溶血現象的發生。
2. 根據權利要求1所述的分離血紅細胞的方法，其特征在于涉及到免疫凝集、免疫吸 附及磁性分尚技術。
3. 根據權利要求2所述的免疫凝集，其特征在于羊抗人血紅細胞抗體與紅細胞發生抗 原抗體反應形成紅細胞-羊抗人血紅細胞抗體復合體，產生凝集。
4. 根據權利要求2所述的免疫吸附和磁性分離技術，其特征在于包被有鼠抗羊Fc端單 克隆抗體的磁性微球捕獲免疫凝集之后的復合體，在外加磁場的作用下將復合體從血漿中 分離出來。
5. 根據權利要求4所述的磁性微球，其特征在于直徑為0. 2-50 μ m，表面修飾羧基、氨 基、氯甲基等化學功能基團的聚苯乙烯或者二氧化硅超順磁性微粒。
6. 根據權利要求1所述的快捷去除紅細胞的方法，其特征在于可大幅縮短紅細胞去除 時間，并可與全自動及半自動化學發光儀配合，實現普通試劑盒的全血檢測。
【文檔編號】G01N33/577GK104111333SQ201310571230
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2013年11月13日 優先權日:2013年11月13日
【發明者】葉森 申請人:葉森
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
