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一種散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像的方法及裝置制造方法
【專利摘要】本發明公開一種散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像的方法及裝置，該方法包括光聲熒光激發光源經過斬波器及掃描振鏡后，由顯微物鏡匯聚于樣品上，激發散射光聲信號及熒光共焦信號，分別被散射光聲探測器及光電倍增管檢測，經過振鏡光束掃描之后可重建二維的散射光聲顯微圖像及共焦熒光顯微圖像；本裝置包括激光器、散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器、光電倍增管檢測系統、雙通道并行數據采集系統、帶采集控制軟件及圖像重建軟件的計算機、顯微物鏡、可調濾色裝置、斬波器、二向色鏡、掃描振鏡。本發明散射光聲-共焦雙模同時顯微成像裝置能夠實現高對比度高分辨率的散射光聲及共焦圖像，可廣泛應用于材料檢測，醫學影像等領域。
【專利說明】一種散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像的方法及裝置
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種無損顯微成像領域，特別涉及一種散射光聲-共焦熒光同時顯微成像的方法及裝置。
【背景技術】
[0002]光聲顯微成像技術是近年來發展的一種新型無損顯微成像技術，采用非電離光子，利用脈沖激光誘發-超聲探測的方式進行顯微成像，有效地結合了純光學成像的高分辨率、高對比度和純聲學成像的高穿透深度的優點，可實現微米量級的成像精度及厘米量級的探測深度，具有完全非侵入性、無電離輻射、無損等突出特性，在生物醫學上具有很廣泛的應用前景，如:黑色素瘤的檢測、微血管結構與功能成像、內窺鏡技術、可視化基因表達成像、分子成像、大腦功能成像等醫學成像檢測領域。
[0003]目前,傳統光聲顯微成像技術均是針對樣品自身或標記物吸收所產生的光聲信號的探測。然而，在微觀生物細胞樣品中，并非所有樣品都對某一特定波長脈沖激光有熱吸收，因此，為了實現對無標記弱吸收生物細胞樣品光聲顯微成像，有必要提出一種針對弱吸收生物細胞樣品的光聲探測器一散射光聲檢測技術；充分利用收集樣品的前向散射光子，誘發散射光聲探測器中的吸收壁產生聲信號，實現針對弱吸收強散射生物細胞樣品的光聲探測。
[0004]而共焦熒光顯微成像技術由于其具有很高的分辨率及特有的軸向層析能力，在生物醫學、生物細胞學、神經學等研究領域具有廣泛的應用。它不經可以通過樣品后向散射光獲取無損的光學切片結構圖像，還可以通過熒光標記的方法，獲取樣品的共焦熒光圖像，從而定量定性地分析生物細胞樣品的生物信息。
[0005]將以上兩種技術結合在一起，可實現在細胞水平上同時對同一生物細胞樣品進行散射光聲-共焦熒光雙模成像，互補不足，同時獲取更多生物細胞更多的信息。

【發明內容】

[0006]為克服現有技術存在的缺點和不足，本發明的首要目的在于提供一種散射光聲-共焦熒光雙模同時成像的方法及裝置。
[0007]為實現上述發明目的，本發明采用如下的技術方案:
[0008]—種散射光聲-共焦突光雙模同時成像的方法，包括以下操作步驟:
[0009](I)激發光源I發出的連續激光經過斬波器11調制，透過二向色鏡12進入掃描振鏡13進行二維掃描,再由顯微物鏡8聚焦到樣品的表面，同時激發樣品產生的前向散射光子及后向散射或熒光光子。
[0010](2)樣品產生的前向散射光子由散射光聲探測器收集，經探測器中的吸收腔轉換為相應的散射光聲信號，并經過前置放大器后，由鎖相放大器進行放大處理，再輸送到雙通道并行數據采集系統中采集，再由計算機實現存儲和重建，實現散射光聲顯微成像。
[0011](3)樣品產生的后向共焦散射或熒光光子由顯微物鏡收集，經過二向色鏡后及濾色鏡之后由聚光鏡聚焦到針孔上，透過針孔的散射光或熒光由光電倍增管進行探測，將相應的信號輸送到雙通道并行采集系統中進行數據采集，再由計算機進行存儲及圖像重建，實現共焦熒光顯微成像。
[0012]所述步驟(I)中的激發光源為連續激光器，輸出波長可為400_2500nm。
[0013]所述步驟(2)中的散射光聲探測器響應頻率為20?3000Hz，由樣品室、吸收壁、微通道、耦合腔及聲傳感器構造而成。
[0014]所述步驟(2)中的散射光聲信號由樣品的前向散射光子誘導散射光聲探測器中的吸收壁所激發。
[0015]所述前向散射光聲信號的輸出經過前置放大器，后經過鎖相放大器進行放大處理，再輸送到數據采集系統中進行采集。
[0016]所述步驟(3)的共焦熒光信號由激光器所發出的激光，通過斬波器進行調制，然后通過二向色鏡進入掃描振鏡及顯微物鏡聚焦于樣品上所激發。
[0017]所述的后向散射光和熒光經過振鏡和二向色鏡后，通過濾色片，由聚光鏡聚焦于針孔上后由光電倍增管檢測。
[0018]本發明還提供一種散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像的裝置，該裝置包括激發光源激光器、斬波器、二向色鏡、二維掃描振鏡、顯微物鏡、散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器、雙通道并行采集卡、濾色鏡、聚光鏡、針孔及光電倍增管和帶有采集控制、圖像重建軟件的計算機。
[0019]所述激發光激光器、斬波器、二維掃描振鏡、光電倍增管、散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器、雙通道并行采集卡與帶有采集控制、圖像重建軟件的計算機依次電氣相連。
[0020]所述顯微物鏡的為平場物鏡，其放大倍數與成像質量有關，倍數越高則質量越好。最小橫向分辨率可達?0.3 μ m。
[0021]所述二維掃描振鏡為高精度閉環伺服振鏡，角分辨率可達15微弧度。
[0022]所述的光聲探測器，包括光源、樣品室和聲傳感器；該樣品室的四周側壁的內壁涂覆有吸光材料層；光源設置在樣品室底面一側的外部照射樣品室，該聲傳感器與樣品室的側壁連通。
[0023]進一步，所述的光聲探測器還包括一對聲波進行放大的耦合腔，該耦合腔的輸入端與樣品室的側壁連通，輸出端與聲傳感器連接。
[0024]進一步，所述的光聲探測器還包括一導聲通道，該導聲通道的一端與樣品室的側壁連通，另一端與耦合腔的輸入端連通。
[0025]進一步，所述的光聲探測器的所述吸光材料層為黑色氧化鐵層。
[0026]進一步，所述的光聲探測器的所述聲傳感器為壓電式聲傳感器，包括壓電薄膜和外圍電路，該壓電薄膜設置在耦合腔的輸出端以將聲波信號轉換為電壓信號，該外圍電路的輸入端分別連接該壓電薄膜的兩極，并對其產生的電壓信號進行放大和濾波。該壓電薄膜為PVDF薄膜。
[0027]進一步，所述的光聲探測器的外圍電路包括依序串接的電荷放大器、帶通濾波器、電壓放大器以及低通濾波器。
[0028]與現有技術相比，本發明具有如下優點:[0029](I)本發明在同一激光光源作用下同時激發樣品散射光聲和共焦突光信號,二者被散射光聲探測器和光電倍增管同時接收，通過雙通道并行采集系統同時采集，實現了散射光聲和共焦熒光的同時雙模顯微成像。對比單一成像模式，該裝置能同時提供樣品的散射光聲圖像及共焦熒光圖像，提供樣品更多的信息參數。
[0030](2)本發明采用的散射光聲探測器，克服傳統光聲顯微成像技術無法對弱吸收樣品實現光聲顯微成像的缺點，實現對弱吸收樣品免標記的散射光聲顯微成像，有效地同時利用了樣品的前向散射光子及后向散射熒光光子，具有更高的檢測靈敏度及更大的應用范圍。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像裝置的結構示意圖。
[0032]圖2是圖1所示的結構中的散射光聲探測器的結構示意圖。
[0033]圖3是圖2中的外圍電路的電路圖。
[0034]圖4為采用本發明所述的散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像裝置同時得到的口腔上表皮細胞的散射光聲顯微圖像。
[0035]圖5為采用本發明所述的散射光聲-共焦熒光雙模同時顯微成像裝置中同時得到的口腔上表皮細胞的共焦顯微圖像。
[0036]圖6為口腔上表皮細胞的普通光聲顯微圖像。
[0037]圖7為口腔上表皮細胞的光學顯微圖像。
【具體實施方式】
[0038]下面結合實施例及附圖對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。
[0039]散射光聲-共焦同時雙模顯微成像裝置圖如圖1所示:
[0040]該裝置包括了連續光激光器1、散射光聲探測器2、前置放大器3、鎖相放大器4、針孔及光電倍增管5、雙通道并行數據采集系統6、帶采集控制及圖像重建軟件的計算機7、顯微物鏡8、聚光鏡9、濾色鏡10、斬波器11、二向色鏡12、二維掃描振鏡13。其中發光激光器
1、斬波器11、二維掃描振鏡13、光電倍增管5、散射光聲探測器2、前置放大器3、鎖相放大器
4、雙通道并行采集卡4與帶有采集控制、圖像重建軟件的計算機7依次電氣相連。
[0041]請參閱圖2，其是所述的散射光聲探測器2的結構示意圖。該光聲探測器包括樣品室214、導聲通道216、耦合腔218和聲傳感器219，該樣品室214的內壁涂覆有一高吸收系數的吸光材料層215。待檢測的目標樣品A設置在蓋玻片213上，并被放置在樣品室214底部中心處的窗口上，從顯微鏡8來的光源照射目標樣品A后對其檢測。該樣品室214、導聲通道216和耦合腔218依序連通，該聲傳感器219連接于該耦合腔218的一端，并與前置放大器3連接。該樣品室214、導聲通道216、耦合腔218和聲傳感器219設置在一基體箱內整合成一個整體。
[0042]該樣品室214為封閉的腔室，其為對稱結構。在本實施例中，該樣品室14為圓柱體，其側面的內壁涂覆高吸收系數的吸光材料層215，用以吸收光子產生聲波。而在該樣品室的上下底面不涂覆吸光材料層，以避免將未透過樣品的彈道光吸收轉換為聲波。該吸光材料層的材料可以為:氧化鐵、炭黑、松煙怠、石墨、苯胺黑、硫化苯胺黑等。在本實施例中，該吸光材料層215為黑色的氧化鐵層，其厚度在0.05mm?0.3mm之間。
[0043]該導聲通道216為極細的條形通道，其連通該樣品腔214的側壁和耦合腔218，采用非吸聲的材料制成，使在樣品腔214產生的聲波沿導聲通道216傳導至耦合腔218。在本實施例中，該導聲通道216為圓柱形通道，其孔徑在0.2mm?0.5_之間。需說明的是，該導聲通道僅為傳導聲音的通道，不是本發明必要的結構。
[0044]該耦合腔218同樣為封閉的腔室，采用非吸聲的材料制成，在本實施例中，該耦合腔為圓柱形結構。該耦合腔218的體積與導聲通道216的體積相匹配，根據亥姆赫茲共振原理，聲波在該耦合腔218內經多次反射產生共振，使聲波的振幅達到最大，從而可使聲傳感器219更加容易感測該聲波信號。
[0045]該聲傳感器219包括壓電薄膜2192和外圍電路2194。該壓電薄膜2192在本實施例中為高靈敏度的PVDF (聚偏二氟乙烯)壓電薄膜，用以感應聲波。在本實施例中，該壓電薄膜2192與聲波的振動方向垂直設置，可最大程度的感測聲波。在本實施例中，該外圍電路2194包括電荷放大器21942、帶通濾波器21944、電壓放大器21946以及低通濾波器21948。該外圍電路具有輸入端11、12以及輸出端01、02。其中，輸入端11、12分別連接壓電薄膜的兩極，輸出端01、02以連接外部的圖像處理裝置(圖未示)。耦合腔218放大的聲波使該壓電薄膜2192產生相應頻率的振動，由于存在正向壓電效應，該壓電薄膜2192將機械能轉換為電信號，就產生與聲波頻率相同的電壓。然后通過外圍電路2194濾波并將電壓放大，最后通過圖像處理裝置顯示圖像。
[0046]具體地，請參閱圖3，該電荷放大器21942包括運算放大器Al、電阻R1、電阻R2、電阻R3、電容Cl以及電容C2。所述運算放大器Al的正相輸入端通過電阻Rl與外圍電路的輸入端Il串接；所述運算放大器的反相輸入端與該外圍電路的輸入端12電連接；所述電阻R2的兩端分別與運算放大器Al的正相輸入端與反向輸入端電連接；所述電容Cl與該電阻R2并聯；所述電阻R3的兩端分別與運算放大器Al的正相輸入端與輸出端電連接；所述電容C2與該電阻43并聯。運算放大器Al的輸出端作為電荷放大器的輸出端。電荷放大器是一種輸出電壓與輸入電荷量成正比的前置放大器，利用電容作反饋元件的深度負反饋的高增益運放。壓電式傳感器本身內阻抗很高，輸出電信號很微弱，通常先把傳感器信號先輸入到高輸入阻抗的前置放大器中，經過阻抗交換以后，方可用一般的放大檢波電路再將信號輸入到指示儀表或記錄器中。
[0047]該帶通濾波器21944包括運算放大器A2、電阻R4、電阻R5、電阻R6、電容C3以及電容C4。所述運算放大器Al的輸出端依次通過電阻R4、電容C4與運算放大器A2的正相輸入端串接；所述運算放大器A2的負相輸入端與外圍電路的輸入端12電連接；所述電阻R5兩端分別與電阻R4與電容C4之間的電連接點以及外圍電路的輸入端12電連接；所述電阻R6的兩端分別與運算放大器A2的正相輸入端以及輸出端電連接；所述電容C4的兩端分別與電阻R4與電容C4之間的電連接點以及運算放大器A2的輸出端電連接。運算放大器A2的輸出端作為帶通濾波器的輸出端。該帶通濾波器用于過濾電信號中的中頻段的信號。
[0048]該電壓放大器21946包括運算放大器A3、電阻R7、電阻R8與電阻R9 ;運算放大器A2的輸出端通過電阻R7與運算放大器A3的正相輸入端串接；電阻R8的兩端分別與運算放大器A3的負相輸入端以及外圍電路的負相輸入端電連接；所述電阻R9的兩端分別與運算放大器A3的正相輸入端以及輸出端電連接。所述運算放大器A3的輸出端作為電壓反大器的輸出端。
[0049]該低通濾波器21948包括運算放大器A4、電阻R10、電阻R11、電阻R12、電阻R13以及電容C5。運算放大器A3的輸出端依次通過電阻RlO以及電阻R12與運算放大器A4的正相輸入端串接；電阻Rll的兩端分別與電阻RlO和電阻R12之間的電連接點以及外圍電路的輸入端12電連接；電阻R13的兩端分別與運算放大器A4的負相輸入端以及外圍電路的輸入端12電連接；電阻R14的兩端分別與運算放大器A4的正相輸入端以及輸出端電連接；電容C5與電阻R14并聯。運算放大器A4的輸出端作為低通濾波器的輸出端，同時也為外圍電路的輸出端01。該低通濾波器用于過濾電信號中的低頻信號。
[0050]本發明的光聲探測器對強弱光吸收的目標樣品均可檢測，其工作原理如下:
[0051]光源產生的沖光束經過顯微物鏡形成聚焦光束，然后透過蓋玻片會聚在目標樣品A的某一點上。
[0052]當目標樣品A為強光吸收的樣品時，光束被目標樣品A吸收，目標樣品A作為吸收樣品快速吸收光束能量，目標樣品A內的組織受熱膨脹，產生聲波。由于樣品室14內壁上的吸光材料層215僅對光進行吸收，因此目標樣品A產生的聲波在樣品室214中不會受到該吸光材料層215的影響。樣品A產生的聲波經過導聲通道216后在耦合腔218內被放大，然后通過聲傳感器219轉換為電信號。
[0053]當目標樣品A為弱光吸收或不吸收光線時，光束通過目標樣品A時被散射，從而光束改變了行徑的方向。不同角度的散射光攜帶了該目標樣品A的對應位置的結構信息。光束通過目標樣品A時被散射后，打在樣品室14的側壁涂覆的吸光材料層215上，吸光材料層215吸收光子后轉換成對應的聲波；而光束未通過目標樣品A的部分直射至樣品室214的上底面，由于樣品室214的底面未涂覆吸光材料，因此，光束未通過目標樣品A的彈道光部分不會被轉換成聲波。樣品A散射后,經吸光材料產生的聲波經過導聲通道216在I禹合腔218內被放大,然后通過聲傳感器219轉換為電信號。
[0054]激發光源I發出的連續激光經過斬波器11調制，透過二向色鏡12進入掃描振鏡13進行二維掃描，再由顯微物鏡8聚焦到散射光聲探測器2的樣品腔214內樣品的表面，同時激發樣品產生的前向散射光子及后向散射或熒光光子。樣品產生的前向散射光子由散射光聲探測器2收集，經探測器中的吸收腔轉換為相應的散射光聲信號，并經過前置放大器3后，由鎖相放大器4進行放大處理，再輸送到雙通道并行數據采集系統6中采集，再由計算機7實現存儲和重建,實現散射光聲顯微成像。樣品產生的后向共焦散射或突光光子由顯微物鏡8收集，經過二向色鏡12后及濾色鏡10之后由聚光鏡9聚焦到針孔上，透過針孔的散射光或熒光由光電倍增管5進行探測，將相應的信號輸送到雙通道并行采集系統6中采集，再由計算機7進行存儲及圖像重建，實現共焦顯微成像。實驗結果如圖4、5、6、7所示，實驗結果顯示:本發明可同時獲取樣品更多的成像參量。
[0055]以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護范圍應當以權利要求所限定的范圍為準。對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和范圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種散射光聲-共焦雙模同時成像方法，其特征在于包括以下步驟: (1)激發光源發出的連續激光經過斬波器調制，透過二向色鏡進入掃描振鏡進行二維掃描，再由顯微物鏡聚焦到樣品的表面，同時激發樣品產生的前向散射光子及后向散射或突光光子； (2)樣品產生的前向散射光子由散射光聲探測器收集，經探測器中的吸收腔轉換為相應的散射光聲信號，并經過前置放大器后，由鎖相放大器進行放大處理，再輸送到雙通道并行數據采集系統中采集，再由計算機實現存儲和重建，實現散射光聲顯微成像； (3)樣品產生的后向共焦散射或熒光光子由顯微物鏡收集，經過二向色鏡后及濾色鏡之后由聚光鏡聚焦到針孔上，透過針孔的散射光或熒光由光電倍增管進行探測，將相應的信號輸送到雙通道并行采集系統中進行數據采集，再由計算機進行存儲及圖像重建，實現共焦熒光顯微成像。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(1)中的激發光源為連續激光器，輸出波長可為400~2500nm。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的散射光聲探測器響應頻率為20~3000Hz，由樣品室、吸收壁、微通道、耦合腔及聲傳感器構造而成。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中的散射光聲信號由樣品的前向散射光子誘導 散射光聲探測器中的吸收壁所激發。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)的共焦熒光信號由激光器所發出的激光，通過斬波器進行調制，然后通過二向色鏡進入掃描振鏡及顯微物鏡聚焦于樣品上所激發。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的后向散射光和熒光經過振鏡和二向色鏡后，通過濾色片，由聚光鏡聚焦于針孔上后由光電倍增管檢測。
7.一種散射光聲-共焦雙模同時成像的裝置，其特征在于:該裝置包括散射光聲顯微成像系統和共焦熒光顯微成像系統； 所述的散射光聲顯微成像系統包括順序連接的激光器、斬波器、二維掃描振鏡、顯微物鏡、散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器、雙通道數據采集系統及計算機； 所述的共焦熒光顯微成像系統包括順序連接的激光器、二向色鏡、二維掃描振鏡、顯微物鏡、熒光濾色片、聚光鏡，針孔及光電倍增光探測器、雙通道數據采集卡及計算機； 所述激發光激光器、斬波器、二維掃描振鏡、光電倍增管、散射光聲探測器、前置放大器、鎖相放大器、雙通道并行采集卡與帶有采集控制、圖像重建軟件的計算機依次電氣相連。
8.根據權利要求7所述的一種散射光聲-共焦雙模同時成像的裝置，其特征在于:所述的散射光聲探測器，包括光源、樣品室和聲傳感器；該樣品室的四周側壁的內壁涂覆有吸光材料層；光源設置在樣品室底面一側的外部照射樣品室，該聲傳感器與樣品室的側壁連通。
9.根據權利要求8所述的一種散射光聲-共焦雙模同時成像的裝置，其特征在于:所述的散射光聲探測器，還包括一對聲波進行放大的耦合腔，該耦合腔的輸入端與樣品室的側壁連通，輸出端與聲傳感器連接；所述的散射光聲探測器，還包括一導聲通道，該導聲通道的一端與樣品室的側壁連通，另一端與耦合腔的輸入端連通；所述聲傳感器為壓電式聲傳感器，包括壓電薄膜和外圍電路。
10.根據權利要求9所述的一種散射光聲-共焦雙模同時成像的裝置，其特征在于:該壓電薄膜設置在耦合腔的輸出端以將聲波信號轉換為電壓信號，該外圍電路的輸入端分別連接該壓電薄膜的兩極，并對其產生的電壓信號進行放大和濾波；所述的外圍電路包括依序串接的電荷放大器、帶通濾波器、電壓放大器以及低通濾波器。
【文檔編號】G01N21/17GK103983578SQ201410223402
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月23日 優先權日:2014年5月23日
【發明者】吳泳波, 唐志列, 吳麗如, 黃敏芳 申請人:華南師范大學