一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ase-hplc方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ASE-HPLC方法；該方法首先對ASE的萃取溶劑、萃取溫度進行優化，先將待檢土樣進行萃取，得到土壤樣品中每種有機酸譜圖；再配制7種有機酸標準品溶液，并得到每種有機酸標準樣品譜圖；最后采用外標法計算待檢土壤中有機酸的含量；本發明方法提取測定土壤中的有機酸，相對于傳統提取方法具有很大的優越性，具有操作簡單快捷(無需人工過濾、全自動化操作誤差小)，提取時間短，提取效率高，加標回收率在86.33％—95.41％之間。因此，本發明方法是一種簡便、快速、高效測定土壤中有機酸的含量的新方法。
【專利說明】 一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ASE-HPLC方法
(—)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ASE-HPLC方法，屬于果樹栽培領域。
(二)【背景技術】
[0002]引起蘋果連作(重茬)障礙的原因復雜，其中以有害微生物和化感物質的作用更加明顯，化感物質主要包括酚酸、有機酸、生物堿等，它們可直接毒害根系或作為土壤有害微生物的碳源而間接誘導蘋果連作障礙的發生。因此，研究連作土壤中某類化感物質的含量和性質對防控蘋果連作障礙有重要的生產指導意義。已有研究結果表明，土壤中的有機酸類物質對蘋果連作障礙有影響，所以，充分提取并準確測定土壤中的有機酸含量，進而有針對性地采取措施，為最終達到減輕蘋果連作障礙的目的提供保障。但現有提取測定土壤中有機酸的方法如超聲提取法、振蕩法等，存在提取效率低、溶劑消耗量大、提取周期長、重復性差、操作復雜等缺點。綜上，建立一種簡便、快速和高效測定連作蘋果園土壤有機酸含量的新方法，對推進蘋果園連作障礙的研究具有重要意義。
(三)
【發明內容】
[0003]為了解決上述問題，本發明提供了一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ASE-HPLC方法；具體是一種利用加速溶劑萃取儀(accelerated solvent extract1n, ASE)和高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography, HPLC)為核心技術的連作蘋果園土壤有機酸提取測定方法一ASE-HPLC法。該方法首先對ASE的萃取溶劑、萃取溫度進行優化，并對HPLC的流動相和流動相pH值進行調整，最終建立了一種簡便、快速、高效測定土壤中有機酸含量的新方法一ASE-HPLC法。
[0004]本發明通過以下步驟實現:
[0005](I)準確稱取過12目篩子的連作果園鮮土樣l_20g，用20_30g石英砂混勻，將混合均勻的樣品裝入萃取池中，按以下條件萃取:以濃度為0.2%的磷酸溶液為萃取溶劑，壓力10.3Mpa，溫度60°C，靜態萃取時間6min，沖洗體積60%，吹掃時間200s，靜態循環2次。萃取完成后將萃取液在40°C條件下用旋轉蒸發儀蒸干，用2ml濃度為0.2%的磷酸溶液將蒸干后的萃取液溶解后離心；離心后上清液上高效液相色譜儀進行測定得到土壤樣品中每種有機酸譜圖。
[0006](2)有機酸標樣的配制:使用超純水分別配制草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸7種有機酸標準品溶液，有機酸標準品溶液的濃度分別為:草酸:51.Smg/ml、酒石酸:301.5mg/ml、蘋果酸:104.9mg/ml、乳酸:108.5mg/ml、梓檬酸:309.7mg/ml、乙酸:173.4mg/ml和琥珀酸:108.6mg/ml，將有機酸標準品上高效液相色譜儀分別得到每種有機酸標準樣品譜圖。
[0007](3)步驟 I)和步驟 2)中色譜條件為:色譜柱:Symmetry C18 (5 μ m, 250mmX 4.6mm),柱溫30°C，流動相A:10mmol/l的磷酸二氫銨，流動相B:甲醇(流動相A:B = 98:2，二者混合液用濃磷酸調節pH至2.4-2.5),流速:0.9ml ?mirT1 ;進樣方式及進樣體積:自動進樣，10 μ I ;檢測波長:210nm。
[0008](4)采用外標法計算待檢土壤中有機酸的含量=C樣品=(A樣品/A標樣)X (V土樣/m土樣)XC標樣X 1/50
[0009]其中，(I) Ciw =有機酸標準品溶液的濃度
[0010](2) A標樣=有機酸標準品的液相峰面積[0011 ] (3) A#s = 土壤樣品中有機酸的液相峰面積
[0012](4)m土樣=土壤的質量 20g
[0013](5) V土樣=土壤溶液濃縮體積2ml
[0014](6)有機酸標準品的稀釋倍數為50
[0015](7) C#s是指待檢土壤中有機酸的含量
[0016]研究結果表明本發明方法可實現對土壤樣品有機酸的提取，且提取效果較好，并能實現對有機酸各組分的高效液相檢測，沒有出現色譜峰干擾情況。
[0017]有益結果:本發明方法提取測定土壤中的有機酸，相對于傳統提取方法具有很大的優越性，具有操作簡 單快捷(無需人工過濾、全自動化操作誤差小)，提取時間短，提取效率高，加標回收率在86.33% — 95.41%之間。因此，本發明方法是一種簡便、快速、高效測定土壤中有機酸的含量的新方法。
(四)【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為不同萃取溫度下的土壤有機酸提取量
[0019]圖1表明，當溫度達到65°C以上(包括65°C)時，草酸的提取量為O，參考其余有機酸提取量隨溫度的變化規律，得出60°C是提取有機酸的最佳溫度。
[0020]圖2為磷酸溶液的濃度對有機酸提取量的影響
[0021]圖2表明，隨著磷酸溶液濃度的增加，各種有機酸的提取量增加。但是，由于酸對萃取儀器具有一定的損害作用，因而在既能保護儀器，又能將有機酸提取效率最大化的前提下，最終選取0.2%的磷酸溶液進行提取。
[0022]圖3為7種有機酸標準品測定譜圖
[0023]圖3表明，通過更改流動相組分和流動相pH在檢測波長為21nm條件下能夠使各個有機酸標樣的峰達到較好的基線分離。
[0024]圖4為不同提取方法對有機酸提取量的影響
[0025]圖4表明，提取有機酸的3種方法中，本發明方法的提取效率顯著高于超聲提取法和振蕩提取法，其中本發明方法提取測定的酒石酸含量分別為超聲提取法和振蕩提取法的
6.57倍和3.17倍，草酸含量分別為超聲提取法和振蕩提取法的2.67倍和6.71倍，說明本發明方法提取測定土壤中的有機酸，相對于傳統提取方法具有很大的優越性，本發明方法是一種簡便、快速、高效測定土壤中有機酸的含量的新方法。
(五)【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]首先對ASE的萃取溶劑、萃取溫度參數進行優化，采用不同的提取溫度(30、40、50、60、65、70和80°C )進行提取試驗。結果表明，當溫度達到65°C以上(包括65°C)時，草酸的提取量為O，參考其余有機酸提取量隨溫度的變化規律，得出60°C是提取有機酸的最佳溫度(圖1)。通過預實驗結果表明磷酸溶液對土壤有機酸的提取效果優于去離子水，因此我們選取了 0.10%,0.15%和0.20% 3種濃度的磷酸溶液對土壤中的有機酸進行提取。結果表明隨著磷酸溶液濃度的增加，各種有機酸的提取量增加(圖2)。但是，由于酸對萃取儀器具有一定的損害作用，因而在既能保護儀器，又能將有機酸提取效率最大化的前提下，最終選取0.2%的磷酸溶液進行提取。
[0028]實施例2
[0029]準確稱取過12目篩子的連作果園鮮土樣20g，石英砂25g(石英砂的加入量以能充分分散土樣為宜)，在研缽中混勻。在10ml萃取池底部墊上I片玻璃纖維素濾膜，將混合均勻的樣品裝入萃取池中。按以下條件萃取:以0.2%的磷酸溶液為萃取劑，壓力10.3Mpa，溫度60°C，靜態萃取時間6min，沖洗體積60% (沖洗液用量為萃取池體積的60% )，吹掃時間200s，靜態循環2次。萃取完成后將萃取液轉移至圓底燒瓶中，在40°C條件下，用旋轉蒸發儀蒸干(蒸至水滴全部消失為宜)。用0.2%的磷酸溶液2ml溶解，轉移至2ml離心管中。以10500r/min的轉速離心，過0.22 μ m濾膜，濾液上液相進行測定。
[0030]有機酸標樣的配制:使用超純水分別配制草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸7種有機酸標準品溶液，有機酸標準品溶液的濃度分別為草酸:51.8mg/ml，酒石酸:301.5mg/ml,蘋果酸:104.9mg/ml,乳酸:108.5mg/ml,梓檬酸:309.7mg/ml,乙酸:173.4mg/ml和琥拍酸:108.6mg/ml,以孔徑0.22 μ m的濾膜過濾,液相測定得到標準樣品譜圖(圖3)。
[0031]使用Waters高效液相色譜儀進行測定。對液相色譜條件進行適當調整，通過更改流動相組分和流動相pH使各個有機酸標樣的峰達到基線分離(圖3)。色譜柱:SymmetryC18 (5 μ m, 250mmX4.6mm),柱溫 30°C (美國 Waters 公司),流動相 A:10mmol/l 的磷酸二氫銨，流動相B:甲醇(流動相A:流動相B體積比=98:2，二者混合液用濃度為85%的濃磷酸調節pH至2.4-2.5),流速:0.9ml.mirT1 ;進樣方式及進樣體積:自動進樣，10 μ I ;檢測波長:210nm。
[0032]本發明的檢測結果是采用外標法來計算有機酸的含量，以濃度為0.2%的磷酸作為萃取溶劑，以測得待檢土樣中草酸含量(即草酸濃度)為6.125ug/g的計算過程為例:
[0033]計算公式為:C草酸樣品=(A樣品/A標樣)X(V土樣/m土樣)X C標樣X 1/50
[0034]其中，(I)C標樣=草酸標準品的濃度為5.18mg/ml
[0035](2)A標樣=草酸標準品的液相峰面積為20955038
[0036](3) A#s = 土壤樣品中草酸的液相峰面積為12388958
[0037](4)m土樣=土壤的質量 20g
[0038](5) V土樣=土壤溶液濃縮體積2ml
[0039](6)草酸標準品的稀釋倍數為50
[0040]實施例3
[0041]對同一份連作果園鮮土樣分別利用超聲提取法、振蕩提取法和本發明方法進行有機酸的提取測定。由圖4可以看出，在提取有機酸的上述3種方法中，本發明方法的提取效率顯著高于超聲提取法和振蕩提取法，其中本發明方法提取測定的酒石酸含量分別為超聲提取法和振蕩提取法的6.57倍和3.17倍，草酸含量分別為超聲提取法和振蕩提取法的
2.67倍和6.71倍，說明本發明方法提取測定土壤中的有機酸，相對于傳統提取方法具有很大的優越性，具有操作簡單快捷(無需人工過濾、全自動化操作誤差小)，提取時間短，提取效率高，加標回收率在86.33%—95.41%之間(見表1)。因此，本發明方法是一種簡便、快速、高效測定土壤中有機酸的含量的新方法。
[0042]表1ASE提取土壤中的酒石酸、檸檬酸和蘋果酸的加標回收率
[0043]
【權利要求】
1.一種快速提取測定土壤低分子量有機酸的ASE-HPLC方法，其特征在于包括以下步驟: 1)準確稱取過12目篩子的連作果園鮮土樣l_20g，用20-30g石英砂混勻，將混合均勻的樣品裝入萃取池中，按以下條件萃取:以濃度為0.2%的磷酸溶液為萃取溶劑，壓力10.3Mpa，溫度60°C，靜態萃取時間6min，沖洗體積60%，吹掃時間200s，靜態循環2次；萃取完成后將萃取液在40°C條件下用旋轉蒸發儀蒸干，用2ml濃度為0.2%的磷酸溶液將蒸干后的萃取液溶解后離心；離心后上清液上高效液相色譜儀進行測定得到土壤樣品中每種有機酸譜圖； 2)有機酸標樣的配制:使用超純水分別配制草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸和琥珀酸7種有機酸標準品溶液，有機酸標準品溶液的濃度分別為:草酸:51.8mg/ml、酒石酸:301.5mg/ml、蘋果酸:104.9mg/ml、乳酸:108.5mg/ml、梓檬酸:309.7mg/ml、乙酸:173.4mg/ml和琥珀酸:108.6mg/ml，將有機酸標準品上高效液相色譜儀分別得到每種有機酸標準樣品譜圖； 3)步驟I)和步驟2)中色譜條件為:色譜柱:SymmetryC18 (5 μ m, 250mmX4.6mm)，柱溫30°C，流動相A: 10mmol/l的磷酸二氫銨；流動相B:甲醇；流動相A:流動相B體積比=98:2，二者混合液用濃磷酸調節pH值至2.4-2.5，流速:0.9ml ^mirT1 ；自動進樣，進樣量10 μ I ;檢測波長:21nm ； 4)采用外標法計算待檢土壤中有機酸的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK104034824SQ201410313406
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年7月2日 優先權日:2014年7月2日
【發明者】毛志泉, 尹承苗, 李俊芝, 王功帥, 張先富 申請人:山東農業大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
