孕酮完全抗原的制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種孕酮完全抗原的制備方法及其應用,本發明通過碳二亞胺法(EDC)將活化的11α-羥孕酮(11α-OH-P4),與卵清白蛋白(OVA),選用進行偶聯,制備免疫抗原。最后將制備的免疫抗原通過免疫小鼠制備抗血清,并確定檢測抗原的最佳包被濃度。
【專利說明】孕酮完全抗原的制備方法及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物領域,具體涉及一種孕酮完全抗原的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 由于孕酮是一種小分子物質,不具備免疫原性,無法令其注入機體后產生抗體。常 用的方法是利用偶聯劑做為媒介,通過半抗原和載體蛋白的偶聯制備完全抗原。偶聯方法 的不同和載體蛋白的選擇對完全抗原的免疫活性具有一定的影響。
【發明內容】
[0003] 為解決上述問題,本發明提供了一種孕酮完全抗原的制備方法及其應用。
[0004] 為實現上述目的,本發明采取的技術方案為:
[0005] 孕酮完全抗原的制備方法,包括如下步驟:
[0006] S1、將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中,在95°C水 浴鍋中水浴90min后,95°C烘干,轉化為黃色結晶109. 3mg。
[0007] S2、在0· 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4_HS(ll α -羥基孕酮半琥珀 酸酯);
[0008] S3、再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0· OlmL DMF 中;
[0009] S4、將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后,室溫下振蕩90min ;
[0010] S5、取A、B兩份7mL PBS溶液,在A溶液中加入95. 2mg BSA,在B溶液中加入95. 2mg OVA后,分別加入S4所得溶液中,4°C下攪拌過夜;;
[0011] S6、將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中,在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 時,在2. 2L去離子水中透析5小時,三次,最后放入pH = 7. 0的PBS溶液,中透析過夜;
[0012] S7、取出透析袋內液體,低溫離心機4?,lOOOOrpm離心30min,棄去沉淀,取上清 液;
[0013] S8、將S7所得上清液真空冷凍干燥,制備出P4_BSA偶聯物和P4-〇VA偶聯物。
[0014] 作為優選,所述的步驟S5中PBS溶液的PH為7。
[0015] 本發明還公開了上述方法所制備的孕酮完全抗原的應用。
[0016] 本發明通過碳二亞胺法(EDC)將活化的11α-羥孕酮(11α-〇H-P4),與卵清白蛋 白(0VA),選用進行偶聯,制備免疫抗原。最后將制備的免疫抗原通過免疫小鼠制備抗血清, 并確定檢測抗原的最佳包被濃度。
【具體實施方式】
[0017] 為了使本發明的目的及優點更加清楚明白,以下結合實施例對本發明進行進一步 詳細說明。應當理解,此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明,并不用于限定本發 明。
[0018] 本具體實施提供了一種孕酮完全抗原的制備方法,包括如下步驟:
[0019] S1、將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中,在95°C水 浴鍋中水浴90min后,95°C烘干,轉化為黃色結晶109. 3mg。
[0020] S2、在(λ 5mL DMF中溶解30mg S1所得的11 a -〇H-P4-HS (11 α -羥基孕酮半琥珀 酸酯);
[0021] S3、再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0· OlmL DMF 中;
[0022] S4、將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后,室溫下振蕩90min ;
[0023] S5、取A、B兩份7mL PBS溶液(PH = 7),在A溶液中加入95. 2mg BSA,在B溶液中 加入95. 2mg OVA后,分別加入S4所得溶液中,4°C下攪拌過夜;;
[0024] S6、將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中,在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小 時,在2. 2L去離子水中透析5小時,三次,最后放入pH = 7. 0的PBS溶液,中透析過夜;
[0025] S7、取出透析袋內液體,低溫離心機4?,lOOOOrpm離心30min,棄去沉淀,取上清 液;
[0026] S8、將S7所得上清液真空冷凍干燥,制備出P4_BSA偶聯物和P4-〇VA偶聯物。
[0027] 本發明還公開了上述方法所制備的孕酮完全抗原的應用。
[0028] 實施例
[0029] 制備抗血清
[0030] 選取6-8周齡雄性BALB/c小鼠10只,用自制P4-BSA免疫抗原進行多次免疫。首 次免疫:取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA與等量FCA完全乳化后,對每只小鼠腹腔注射,免疫時間 14d ;二次免疫:取1. 0mg/mL50 μ LP4-BSA與等量FIA完全乳化,對每只小鼠腹腔注射,免疫 時間14d ;加強免疫:取1. 0mg/mL50l·! LP4-BSA,對每只小鼠腹腔注射,免疫時間10d。最后 將小鼠挖眼采集血液樣品,經離心分離血清,抗血清性質的鑒定。
[0031] 間接ELISA試驗
[0032] ①將預先配置的抗原包被液稀釋檢測抗原,每個孔中加入100 μ L,37°C條件下靜 置30min后,置于4°C冰箱12h ;
[0033] ②每孔加入預先配置的封閉液200 μ L,37°C恒溫箱溫育2h ;
[0034] ③每孔加入預先配置的洗滌液100-200 μ L,如此反復洗滌3次;每次洗滌3分鐘 左右;
[0035] ④將加入已用PBS稀釋的血清,每孔加100μ L,37°C下濕盒靜置lh ;
[0036] ⑤洗滌方法同上;
[0037] ⑥將已用PBS稀釋的(1 : 2000)HRP-酶標二抗每孔中加入lOOyL,在37°C下濕 盒靜置反應lh ;
[0038] ⑦洗滌方法同上;
[0039] ⑧將每孔中加入100μ L底物,在37°C下避光靜置lh ;
[0040] ⑨將每孔中加入50 μ L終止液;
[0041] ⑩將酶標板用酶標儀讀出每孔0D490nm值(重復測定3次取平均值)。
[0042] 抗原P4_0VA最適包被濃度
[0043] 包被的抗原P4_0VA最佳稀釋濃度利用方陣滴定法測定,即最適包被濃度。橫 向用抗血清包被(分別以A-F命名),按照1 : 4·0Χ103、1 : 8·0Χ103、1 : 1.6X104、 1 : 3. 2X104、1 : 6. 4Χ104和1 : 1.28Χ105的稀釋濃度包被與酶標板中。縱向(分別以 a-g 命名)用檢測抗原 P4-〇VA 按 1 : LOXlO^l : 2·0Χ101、1 : tOXlO^l : 8.0X101、 1 : 1.6X102、1 : 3. 2X102、1 : 1.28X 103的稀釋濃度包被與酶標板中,要在ELISA試驗中 設橫向h和i則分別為陰性對照和空白對照。操作方法同間接ELISA試驗,結果以0D 49(lnm 值最接近于1. 0的判定為P4_〇VA最適包被濃度。
[0044] 抗血清與完全抗原中孕酮殘基的特異性
[0045] 將最適包被濃度的抗原P4_0VA與OVA分別包被于酶標板中,用封閉液封閉后,將 50 μ LP4-BSA加入12個酶標板孔中。將25 μ g/ml孕酮標準品放入甲醇中稀釋(按照1 : 10 做為開始倍比,做12個梯度),振蕩混勻20min,之后每孔加入50 μ L在上述12個酶標板孔 中。將PBS緩沖液同無孕酮的甲醇混合為對照。按照間接ELISA試驗方法進行操作,測定 每孔00490_值。
[0046] 抗血清與游離的孕酮的特異性
[0047] 將最適包被濃度的抗原P4_0VA包被于酶標板中,用封閉液封閉后,將倍比抗血清 和空白對照(PBS緩沖液)按照間接ELISA試驗方法進行操作,測定每孔0D 49(lnm值后,分別 計算OVA孔與空白對照孔的比值和P4-〇VA孔與OVA孔的比值。
[0048] 抗原P4-0VA最適包被濃度測定結果
[0049] 通過方陣法進行抗原P4_0VA最適包被濃度的鑒定。結果顯示(表1) :P4-〇VA包 被濃度越高,〇D45tol值越高。通過觀察發現0D45(lnm值為1. 0孔為抗原P4-〇VA的包被濃度為 1 : 160,抗血清的稀釋濃度為1 : 32000,故將其作為最適包被濃度。
[0050] 表1抗原p4-ova最適包被濃度
[0051]
【權利要求】
1. 孕酮完全抗原的制備方法,其特征在于,包括如下步驟: 51、 將lOOmgll α -〇H-P4與30mg半琥珀酸酯化物溶于5mL無水吡啶中,在95°C水浴鍋 中水浴90min后,95°C烘干,轉化為黃色結晶109. 3mg。 52、 在 0· 5mL DMF 中溶解 30mg S1 所得的 11 a -〇H-P4-HS ; 53、 再將 8. 94mg NHS 和 16. 02mg DCC 分別溶于 0. OlmL DMF 中; 54、 將上述S2所得溶液加入S3所得溶液中后,室溫下振蕩90min ; 55、 取A、B兩份7mL PBS溶液,在A溶液中加入95.2mg BSA,在B溶液中加入95.2mg OVA后,分別加入S4所得溶液中,4°C下攪拌過夜;; 56、 將S5所得A、B液體分別裝入透析袋中,在0. lmol/L NaHC032. 2L中透析4. 5小時, 在2. 2L去離子水中透析5小時,三次,最后放入pH = 7. 0的PBS溶液,中透析過夜; 57、 取出透析袋內液體,低溫離心機4?,lOOOOrpm離心30min,棄去沉淀,取上清液; 58、 將S7所得上清液真空冷凍干燥,制備出P4-BSA偶聯物和P4-〇VA偶聯物。
2. 根據權利要求1所述的孕酮完全抗原的制備,其特征在于,所述的步驟S5中PBS溶 液的PH為7。
3. 如權利要求1所制備的孕酮完全抗原的應用。
【文檔編號】G01N33/74GK104086648SQ201410229282
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】夏成, 吳凌, 徐闖, 舒適, 許楚楚, 肖鑫煥, 沈泰玉, 張洪友, 包軍 申請人:黑龍江八一農墾大學