一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法
【專利摘要】本發明公開了一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，試樣經提取液提取后低溫高速離心，上清液經液相色譜分離、二極管陣列檢測器檢測，保留時間定性、外標法定量。步驟一：制備標準工作溶液、加標用標準使用液和模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油；步驟二：采用高效液相色譜對步驟一的三種溶液分別進行液相色譜測定；以標準工作溶液中葉綠素銅鈉的濃度x為橫坐標，以對應測得的峰面積y為縱坐標，繪制標準工作溶液回歸曲線，根據曲線得到的線性方程y=ax+b，計算出回歸曲線的斜率a和截距b；步驟三：根據標準曲線方程，計算橄欖油葉綠素銅鈉濃度。本發明的方法采用通用型的液相色譜柱和紫外檢測器對葉綠素銅鈉進行高效液相色譜測定，并能排除其他物質測定的干擾。本發明的方法可以準確測量出橄欖油中葉綠素銅鈉含量，定量準確可靠，且重現性良好。
【專利說明】一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種測定橄欖油中葉綠素銅鈉的方法。
【背景技術】
[0002]橄欖油以其獨特理化指標與保健功能，逐步成為新世紀理想的食用油，富含豐富的單不飽和脂肪酸，即油酸及亞油酸、亞麻酸,還有維生素A、維生素B、維生素D、維生素E、維生素K及抗氧化物等，被認為是迄今所發現的油脂中最適合人體營養的油。
[0003]美國農業部2013年9月發布的報告顯示，2012年10月至2013年9月，美國市場葵花籽油的平均價格是每噸約合人民幣9000元；大豆油每噸的平均價格是約合人民幣6500元；而正品特級初榨橄欖油的價格在每噸3.2萬-3.6萬元人民幣。即便以成本較高的葵花籽油計算，每噸食用油的成本也只有正品特級初榨橄欖油的1/3左右。巨大的利益誘惑下，有些不法商家會在葵花籽油和大豆油等油品中加葉綠素銅鈉冒充橄欖油銷售。由于市場上銷售的很多未充分精煉的初榨橄欖油含有部分葉綠素，看上去都是黃綠色，導致人們以為黃綠色的橄欖油才是純正的橄欖油，這也成了人們選擇橄欖油的一個重要依據。不法商家就利用消費者的這一心理，在大豆油、葵花籽油等低廉油加葉綠素銅鈉冒充橄欖油。2013年，臺灣的味全橄欖油事件就是一起典型的橄欖油摻假事件，引起社會的廣泛重視。
[0004]葉綠素銅鈉，是葉綠素的一類衍生物銅葉綠素的鈉鹽，在食品工業中常做著色劑使用，也就是我們通常所說的色素，常用的還有葉綠素銅鉀。葉綠素是地球上分布最廣的天然色素，主要存在于綠色植物中。由于葉綠素極不穩定，導致葉綠素在食品工業中難以得到應用。故在食品工業中常采用葉綠素銅鈉作為著色劑廣泛使用。除此之外，葉綠素銅鈉還被人們應用在醫藥領域。在我國食品添加劑標準GB2760-2011及GB26406-2011中，葉綠素銅鈉可用于冷凍飲品、蔬菜罐頭、熟制豆類、加工堅果、糖果、烘烤食品、果蔬汁以及配制酒食品中，最大使用量一般不得超過0.5克/千克。但是，葉綠素銅鈉鹽在食品中的應用范圍并不包括食用油，因為人類每天都會攝入大量的食用油，尤其是食用油在高溫烹調過程中會釋出銅及氧化，將會導致人體肝腎受損，危害健康。人體吸收過量，會傷肝腎或造成貧血，長期食用會危害健康。聯合國糧農組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會(JECFA)對葉綠素銅鈉進行安全評估認為，葉綠素銅鈉的半數致死量(LD)50>10000毫克/千克(小鼠經口)，每日允許攝入量(ADI)為0-15毫克/千克。因此，葉綠素銅鈉用于食用油中，無論是否有害，都是違反了食品安全國家標準的規定(GB2760-2011)。2013年臺灣橄欖油摻假事件使得葉綠素銅鈉以及橄欖油摻假問題成為公眾高度關注的領域。
[0005]目前尚無關于葉綠素銅鈉含量的檢測方法及標準，因此迫切需要制定橄欖油中葉綠素銅鈉的標準檢測方法來填補國內外空白，以加強市場上橄欖油的檢驗監管。
[0006]
【發明內容】
[0007]本發明的目的是提供所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:。本發明所述的的技術問題可通過以下步驟得以解決:
1)制備葉綠素銅鈉標準工作溶液、加標用標準使用液以及模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油并提取其中的葉綠素銅鈉，制備葉綠素銅鈉提取液；
2)采用高效液相色譜對I)中的3種溶液進行檢測，采用保留時間定性、峰面積定量；
3)根據標準曲線方程，對橄欖油中葉綠素銅鈉的含量進行準確定量分析。
[0008]所述的一種用高效液相色譜方法對橄欖油中葉綠素銅鈉進行定性、定量分析方法，包括以下步驟:
步驟一:制備標準工作溶液、加標用標準使用液和模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油并提取其中的葉綠素銅鈉，制備葉綠素銅鈉提取液；所述標準工作溶液為由葉綠素銅鈉配備而成的標準工作溶液和橄欖油標準工作溶液；所述模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油由空白橄欖油樣品添加加標用葉綠素銅鈉使用液獲得；所述空白橄欖油樣品為未受葉綠素銅鈉污染的橄欖油；
步驟二:采用高效液相色譜對步驟一的溶液分別進行測定；以標準工作溶液中葉綠素銅鈉的濃度X為橫坐標，以對應的測得的峰面積y為縱坐標，繪制標準工作溶液回歸曲線，根據曲線得到的線性方程y^aA+bi和y2=a2x2+b2，分別計算出回歸曲線的斜率和截距；步驟三:根據公式X= (y-b) /a，計算待測橄欖油中葉綠素銅鈉的濃度；其中y為測得的葉綠素銅鈉(a和b)的峰面積之和。
[0009]所述步驟一中，模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油和空白試液均平行制備兩份，然后進行步驟二和步驟三，若兩次獨立測試結果的絕對差值不超過其算術平均值的20%，則測試準確。
[0010]所述步驟一中，標準工作溶液的制備方法具體為:準備葉綠素銅鈉標準儲備溶液:準確稱取葉綠素銅鈉的標準品0.lg，加入優級純的亞硫酸氫鈉2g，加入15mL超純水溶解混勻后，分別加入50mL甲醇、20mL丙酮，最后用甲醇定容至刻度。該儲備液在4 °〇下密封避光儲存。
[0011]所述步驟一中，模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油的制備方法為:(a)由空白橄欖油添加入加標用葉綠素銅鈉標準使用液作為模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油；(b)加標用葉綠素銅鈉制備:根據葉綠素銅鈉易溶于水不溶于油的特點以及四氫呋喃既溶于甲醇又溶于油的特點，固體標準品用盡可能少的甲醇溶解，再用四氫呋喃定容，即為樣品加標用標準溶液。(c)提取:取2g油樣于15mL離心管中，加入混合提取液5mL，充分混勻，渦旋振提5min ;在40C、10000轉/min離心5min，取ImL的上清液做為測試液，進HPLC分析測試。
[0012]所述的葉綠素銅鈉含量的測定方法，其色譜條件為:
色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱或性能相當者；
柱溫:20-40 0C ；
檢測波長:400-410 nm ；
流動相:有機相和醋酸鹽緩沖液組成；
所述流動相中醋酸鹽緩沖液的濃度為0.1-0.2mol/L, pH為7.0-8.0，有機相為甲醇或 丙酮。
[0013]所述步驟一中，標準工作溶液的制備方法具體為:準備葉綠素銅鈉標準儲備溶液:準確稱取葉綠素銅鈉的標準品并利用合適的溶劑配置標準溶液，并在溶液中加入適量保護劑，避光、4°c保存。
[0014] 有益效果
采用上述技術方案后，本發明具有積極的效果:
由于本發明是采用了保留時間定性、峰面積定量的色譜分離分析技術，從而保證了檢測結果的準確性。本發明的新穎之處在于發明了橄欖油中葉綠素銅鈉的液相色譜檢測方法，保持檢測技術直觀、快速、方便、成熟、廉價等優點。本發明的方法采用普通高效液相色譜，儀器成本低，易于推廣使用，且操作簡單。
[0015]本發明的方法可以廣泛用于葉綠素銅鈉成分的鑒定，在食品安全檢測領域都有廣泛的應用前景。本發明目的在于提供一種橄欖油中摻入的葉綠素銅鈉含量的檢測方法。其他常見食品中葉綠素銅鈉含量的測定都可以采用與此類似的方法完成。
[0016]本專利所申請的葉綠素銅鈉檢測技術，作為一種液相色譜分析檢測技術，具有以下優點:
前處理簡單:只需要將流動相溶液與待測樣品混合均勻后提取即可，不需要復雜的前處理設備，便于推廣；
快速:檢測15分鐘后判讀結果；
靈敏:最低檢出限可達2ppm ；
特異性高:由于在檢測過程采用保留時間定性，結果準確；
價格便宜:本檢測方法采用普通的液相色譜儀器，費用大大低于液相色譜質譜聯用儀器，易于檢測機構推廣。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1:0.05mg/mL的葉綠素銅鈉標準液相色譜圖；(葉綠素b銅鈉:10.67min)、葉綠素 a 銅鈉:13.47min)
圖2:橄欖油空白樣品液相色譜圖；
圖3:在圖2所用的橄欖油空白樣品添加50ppm葉綠素銅鈉后測定的液相色譜圖。
[0018]
【具體實施方式】
[0019]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細說明，但本發明并不局限于具體實施例。
[0020]某品牌橄欖油中葉綠素銅鈉量的測定
1、材料:橄欖油、葉綠素銅鈉標準品、甲醇、丙酮等色譜純有機溶劑、超純水、一次性離心管。
[0021]2、方法
2.1、制備葉綠素銅鈉標準工作溶液、加標用葉綠素銅鈉使用溶液:
標準工作溶液的制備方法具體為:(a)準備葉綠素銅鈉標準儲備溶液:準確稱取葉綠素銅鈉的標準品(含量≥99%) 0.1g (精確到0.1mg),置于100 mL棕色容量瓶中，加入優級純的亞硫酸氫鈉2g,加入15mL超純水溶解混勻后,分別加入50mL甲醇、20mL丙酮,最后用甲醇定容至刻度，該儲備液在4 °C下密封避光儲存；(b)準備加標用標準使用液:根據葉綠素銅鈉易溶于水不溶于油的特點以及四氫呋喃既溶于甲醇又溶于油的特點，固體標準品用盡可能少的甲醇溶解，再用四氫呋喃定容，即為樣品加標用標準溶液；用四氫呋喃按照所需的稀釋液濃度大小進行稀釋，再按照所需的加標濃度的大小進行樣品加標。
[0022]2.2、模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油的制備及葉綠素銅鈉的提取方法為:(a)用空白橄欖油加入加標用葉綠素銅鈉標準使用液獲得摻入葉綠素銅鈉橄欖油模擬物；(b)準確稱取橄欖油樣品或前述(a)中得到橄欖油模擬物2g于15mL離心管中，精確至0.01g ;(c)提取:向離心管中加入混合提取液5mL,充分混勻，潤旋振提5min ;在4°C、10000轉/min離心5min，取ImL的上清液做為測試液，進HPLC分析測試。
[0023]2.3、液相條件: a)色譜柱
中檢維康 ODS C18 分析柱，250 mmX 3.9 mm , 10 Mm。
[0024]b)流動相
流動相A:甲醇:0.lmol/L醋酸銨(PH=7.5):丙酮=65:20:15 ；
流動相B:甲醇:丙酮=60:40 ；
梯度洗脫
流動相 A:0-15min: 100% — 0% ；
15-18min: 0% ；
18-18.5min: 0% — 100% ;
18.5-20min: 100%。
[0025]進樣量:10μ L ；
柱溫:35 °C ；
流速:1.0 mL/min ；
檢測波長:λ =404 nm ；
2.4、標準曲線的繪制:分別移取標準儲備溶液用流動相配制成濃度分別為l.0yg/mL, 5.0 μ g/L，10.0 μ g/L，50.0 μ g/L，100.0 μ g/L 的標準工作溶液，取 10 μ L 注入高效液相色譜儀，按色譜條件進行測定，以色譜峰的峰面積為縱坐標，與其對應的濃度為橫坐標作圖，繪制標準工作曲線。標準曲線方程分別為:葉綠素a銅鈉:yi = 47.09Xl+9.79 ;葉綠素b 銅鈉:y2 = 29.17x2+5.21 ;相關系數分別為 r2 = 0.9999 和 r2 = 0.9999.根據公式計算待測橄欖油中葉綠素銅鈉濃度以及添加加標用葉綠素銅鈉標準使用液的橄欖油中葉綠素銅鈉濃度。
[0026]2.5、計算結果及方法的重復性試驗以及精密度和回收率 經計算，所測樣品橄欖油中未檢出葉綠素銅鈉。
[0027]采用添加回收法，對不含葉綠素銅鈉的橄欖油也即對空白試液分別添加葉綠素銅鈉為2.00 yg/L、25.0 μ g/L,50.0 μ g/L水平進行測定，每個水平平行測定6次，進行回收率和精密度計算，回收率和精密度試驗結果詳見表1。
[0028]表1葉綠素銅鈉在模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油中添加回收率和精密度
I添加濃度II添加濃度2I添加濃度3
添加濃度(μ g/L) 2.00~25.050.0
測定值(μ g/L)1.98~24.549.0
回收率99.0%%~θ%98.0%_
相對標準偏差2.5%~%1.9%— 由表I可以看出，本方法的回收率和精密度良好。方法對橄欖油模擬物測定的回收率在98.0%?99.0% ;精密度在10%以下；兩次獨立測試結果的絕對差值不超過其算術平均值的20% ;定量準確可靠，且重現性良好。
[0029]以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，并不用于限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)制備葉綠素銅鈉標準工作溶液、加標用標準使用液以及模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油并提取其中的葉綠素銅鈉，制備葉綠素銅鈉提取液； 2)采用高效液相色譜對待測溶液進行檢測，采用保留時間定性、峰面積定量； 3)根據標準曲線方程，對橄欖油中葉綠素銅鈉的含量進行準確定量分析。
2.根據權利要求1中所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于該檢測方法包括以下步驟: 步驟一:制備標準工作溶液、加標用標準使用液和模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油:所述標準工作溶液為由葉綠素銅鈉配備而成的標準工作溶液和橄欖油標準工作溶液；所述模擬摻入葉綠素銅鈉的橄欖油由空白橄欖油樣品添加加標用葉綠素銅鈉使用液獲得；所述空白橄欖油樣品為未受葉綠素銅鈉污染的橄欖油； 步驟二:采用高效液相色譜對步驟一的溶液分別進行測定；分別以標準工作溶液中葉綠素a銅鈉的濃度X1為橫坐標，以對應的測得的峰面積yi為縱坐標；葉綠素b銅鈉的濃度X2為橫坐標，以對應的測得的峰面積72為縱坐標，繪制標準工作溶液回歸曲線，根據曲線得至Li的線性方程Y1=S1Xjb1和y2=a2x2+b2,分別計算出回歸曲線的斜率a” a2和截距Vb2 ； 步驟三:根據公式X1= Cy^b) /a和X2= (y2-b) /a計算葉綠素a銅鈉和葉綠素b銅鈉濃度X1和x2，葉綠素銅鈉濃度X=XjX2 ;其中Y1和y2分別為測得的摻入葉綠素銅鈉橄欖油中葉綠素a銅鈉和葉綠素b銅鈉的峰面積。
3.根據權利要求1或2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于色譜條件為: 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱或性能相當者； 柱溫:20-40°C ； 檢測波長:400-410 nm ； 流動相:有機相和醋酸鹽緩沖液組成； 所述流動相中醋酸鹽緩沖液的濃度為0.1-0.2mol/L, pH為7.0-8.0，有機相為甲醇或丙酮。
4.根據權利要求1或2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述步驟一中，標準工作溶液的制備方法具體為:準備葉綠素銅鈉標準儲備溶液:準確稱取葉綠素銅鈉的標準品并利用合適的溶劑配置標準溶液，并在溶液中加入適量保護劑，避光、4°C保存。
5.根據權利要求1或2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述步驟一中，模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油的制備及葉綠素銅鈉的提取方法為:(a)將加標用葉綠素銅鈉標準使用液加入到空白橄欖油中得到摻入葉綠素銅鈉橄欖油模擬物；(b)取l_2g模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油于離心管中，加入混合提取液5-10mL，充分混勻，渦旋振提5-10min ;在4°C、10000轉/min離心5min，取上清液做為測試液，進HPLC分析測試。
6.根據權利要求2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述步驟一中，模擬摻入葉綠素銅鈉橄欖油和空白試液均平行制備兩份，然后進行步驟二和步驟三，若兩次獨立測試結果的絕對差值不超過其算術平均值的20%，則測試準確。
7.根據權利要求1或2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述步驟一中，橄欖油加標用標準工作溶液的制備方法為:固體標準品用少許甲醇溶解，再用四氫呋喃定容，即為樣品加標用標準溶液；用四氫呋喃按照所需的稀釋液濃度大小進行稀釋，再按照所需的加標濃 度的大小進行樣品加標。
8.權利要求3所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述保護劑為亞硫酸氫鈉；配置標準品所用試劑為純水和有機相的混合液。
9.權利要求1或2所述的一種橄欖油中葉綠素銅鈉的測定方法，其特征在于:所述葉綠素銅鈉的含量為葉綠素a銅鈉和葉綠素b銅鈉含量的加和。
【文檔編號】G01N30/02GK103969373SQ201410229192
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月28日 優先權日:2014年5月28日
【發明者】婁婷婷, 葛寶坤, 陳其勇, 章驊, 趙孔祥 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
