專利名稱：一種干式免疫檢測試紙條及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于臨床醫學診斷領域，具體涉及一種干式免疫檢測檢測試紙條及其制備方法與應用。
背景技術：
現如今干式免疫定量檢測一般由體外免疫層析試劑條進行檢測，試紙條主要是將親和技術、印記技術、免疫標記和層析技術的組合，一般包括樣品墊、濾血膜、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊等四層到五層(四層一般將濾血功能與樣品墊組合)，示蹤粒子(膠體金、熒光等)標記的抗體包被在結合墊上。專利CN102192983A對傳統的免疫層析膜的結合方式進行了改變，變成三膜系統一GE公司旗下Whatman開發的膜Fusion5、硝酸纖維素膜、吸水紙，有效地提高了檢測的靈敏度和特異性。然而，膜Fusion5孔徑較大，抗體難以固定需要制備特殊的STONE用以固定抗體，工藝較為復雜，同時通過專利CN102192983A制備的試紙條層析的時間需要十分鐘，檢測時間長
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供了一種操作簡單、層析迅速、特異性強、檢測結果準確、穩定性強的干式免疫檢測試紙條及其制備方法與應用。本發明通過以下技術方案實現:一種干式免疫檢測試紙條，在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設有相互平行的質控線和檢測線；硝酸纖維素膜左端設有示蹤粒子標記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線I，封閉蛋白線I為封閉蛋白液I包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標記抗體/抗原噴到封閉蛋白線II上形成的線，其中，封閉蛋白線II為封閉蛋白液II包被硝酸纖維素膜形成的線。所述的檢測線上包被有抗體或抗原，檢測線上包被有抗體為針對待測抗原的單抗或多抗，或者為針對待測抗體的抗原的單抗或多抗；檢測線上包被抗原為待測抗原的競爭性抗原。所述的示蹤粒子為膠體金顆粒、熒光顆粒、膠乳顆粒、磁性顆粒中的任意一種。所述的熒光顆粒可以是熒光素(cy5、cy7)、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點中的一種。所述封閉蛋白液I與封閉蛋白液II均包含酪蛋白與BSA。所述的封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:5-2:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。所述的封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:5-1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。本發明公開了一種干式免疫檢測試紙條的制備方法，包括以下步驟:(I)樣品墊的制備:將樣品墊用lOOmmol/L pH7.2 PBS緩沖液浸泡2 4小時，取出后25°C干燥8小時。(2)硝酸纖維素膜的處理:
A、檢測線的制備:將待測物質相對應的抗原/抗體用20mmol/LpH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測線；
B、質控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度,0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端
3.5cm處劃質控線，該線與檢測線平行，與檢測線間隔5_，然后在干燥箱內20°C鼓風干燥12h ；
C、封閉蛋白線的制備:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm ；
D、示蹤粒子標記抗體/抗原包被線的制備:采用封閉蛋白液II劃線于硝酸纖維素膜左端1.5mm處,包被量為1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示蹤粒子標記的抗體/抗原在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存。(3)吸水墊的制備:吸水紙裁剪成30*2.7cm每條。(4)組裝:塑料底襯，樣品墊和吸水 紙為本領域通用的部件。將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上，將貼好的中間物用斬切機切成一定寬度的試紙條。本發明公開了一種干式免疫檢測試紙條的應用，所述的干式免疫檢測試紙條通過雙抗夾心法或者競爭法原理定量測定待測物質，適用于所有的采用雙抗夾心或競爭法模式的心肌類、腎臟類、腫瘤類、傳染病類等疾病的診斷。本發明通過采用包被于硝酸纖維素膜上的示蹤粒子標記抗體包被線，且采用封閉蛋白線的方式取代常用的包被示蹤粒子標記抗體的結合墊，一方面層析時間只需45s-60s，檢測時間大大縮短、特異性與穩定性加強、檢測結果更加準確，另一方面，還大大節約了材料，節省了成本。
圖1:本發明干式免疫檢測試紙條結構示意 圖2:C反應蛋白膠體金檢測試紙條的標準曲線；
圖3:胱抑素C熒光檢測試紙的標準曲線；
圖4:甲胎蛋白熒光檢測試紙的標準曲線；
其中，圖1:1、樣品墊；2、吸水墊；3、硝酸纖維素膜；4、檢測線；5、質控線；6、包被線；7、封閉蛋白線I。
具體實施例方式通過以下具體實施例對本發明作進一步闡述，以下實施例僅用于說明，而不用于限制本發明的保護范圍。實施例1 C反應蛋白膠體金檢測試紙的制備與使用 1、C反應蛋白膠體金檢測試紙的制備
(I)膠體金一抗體復合物的制備
a、制備生物素化C反應蛋白(CRP)單克隆抗體復合物:先用6-氨基己糖與生物素連接制得長臂生物素，按照每毫升鼠抗人CRP單克隆抗體加80 μ g生物素加入進行反應lh，生成長臂生物素N-羥基丁二酰胺酯，即為生物素化CRP單克隆抗體復合物，通過1% BSA pH7.5透析出去游離生物素；
b、制備膠體金標記親和素:用1%碳酸鉀溶液調節膠體金pH值至7.5，按照IOyg鏈親和素/ml膠體金的量加入鏈親和素溶液充分混勻，置于25°C水浴反應30分鐘后再加入5%BSA，封閉20分鐘后，離心取沉淀，用BSA恢復其終濃度為1%，4°C保存備用；
C、膠體金一抗體復合物的制備:按50yg CRP單抗-生物素/ml膠體金的量將抗體-生物素加入膠體金中，37°C攪拌反應40分鐘，加入5%BSA，封閉攪拌20分鐘，6000r/min離心20分鐘，棄上清，沉淀以金標抗體保存液恢復體積，4°C保存。(2)封閉蛋白液的制備
封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:5的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度3%的溶液。封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度5%的溶液。(3)免疫層析試紙條的組裝 a、硝酸纖維素膜的處理 檢測線的制備:將鼠抗人C反應蛋白單克隆抗體用20mmol/L pH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測線。質控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度，0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端3.5cm處劃質控線，該線與檢測線平行，與檢測線間隔5_，然后在干燥箱內20°C鼓風干燥 12h。封閉蛋白線:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm。膠體金抗體包被線:采用封閉蛋白液II包被上述處理的硝酸纖維素膜，包被于膜左端1.5mm處，包被量為1.3ul/cm，置于25°C干燥2h，然后用膠體金一抗體復合物在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存。b、樣品墊的制備
將樣品墊用lOOmmol/L PBS緩沖液浸泡2 4小時，取出后25°C干燥8小時。C、吸水墊的制備 吸水紙裁剪成30*2.7cm每條。d、組裝
塑料底襯、樣品墊和吸水紙為本領域通用的部件。將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上(如附圖1)。將貼好的中間物用斬切機切成5.6cm寬一條的試紙條。2、CRP膠體金檢測試紙條的使用 (I)定性檢測
把待檢樣品滴加在本試紙條的樣品墊上，45s-60s后即可出現定性結果:若在試紙的質控線和檢測線的位置處分別出現一條紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應的抗原即為陽性樣品；若僅在試紙的質控線位置處出現紫紅色的條帶，表明待檢液中含有相應的抗原在檢測下限以下即為陰性樣品；若在試紙的質控線和檢測線的位置處都無紫紅色的條帶出現，表明該檢測結果為無效結果。(2)定量檢測 a、標準曲線的繪制
制備好的CRP膠體金檢測試紙條樣品墊上加入不同濃度CRP抗原標準品(取六個不同濃度，分別為0.5、1、3、10、100、200mg/L，每個濃度設3個重復)，60 s后，通過南京基蛋生物科技有限公司的FIA8100系列免疫定量分析儀讀取信號，實驗結果及分析見表1:
表1 CRP標準品檢測結果
權利要求
1.一種干式免疫檢測試紙條，其特征在于，在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設有相互平行的質控線和檢測線；硝酸纖維素膜左端設有示蹤粒子標記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線I，封閉蛋白線I為封閉蛋白液I包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標記抗體/抗原噴到封閉蛋白線II上形成的線，其中，封閉蛋白線II為封閉蛋白液II包被硝酸纖維素膜形成的線。
2.根據權利要求1所述的一種干式免疫檢測試紙條，其特征在于所述的示蹤粒子為膠體金顆粒、熒光顆粒、膠乳顆粒、磁性顆粒中的任意一種。
3.根據權利要求1所述的一種干式免疫檢測試紙條，其特征在于所述的檢測線上包被有抗體或抗原。
4.一種干式免疫檢測試紙條的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)樣品墊的制備:將樣品墊用100mmol/LPBS緩沖液浸泡2 4小時，取出后25°C干燥8小時； (2)硝酸纖維素膜的處理: A、檢測線的制備:將待測物質相對應的抗原/抗體用20mmol/LpH7.2的PB緩沖液稀釋到2.0mg/ml的濃度，0.8ul/cm在離硝酸纖維素膜右端4.0cm處劃線得到檢測線； B、質控線的制備:將兔抗鼠IgG抗體按4mg/ml的濃度,0.8ul/cm在硝酸纖維素膜右端 3.5cm處劃質控線，該線與檢測線平行，與檢測線間隔5_，然后在干燥箱內20°C鼓風干燥12h ； C、封閉蛋白線的制備:將封閉蛋白液I包被于硝酸纖維素膜左端6mm處，包被量為1.5ul/cm ； D、示蹤粒子標記抗體/抗原包被線的制備:采用封閉蛋白液II劃線于硝酸纖維素膜左端1.5mm處,包被量為1.3ul/cm,置于25°C干燥2h,然后用示蹤粒子標記的抗體/抗原在封閉蛋白II的位置劃線置于25°C干燥4h，密封干燥保存； (3)吸水墊的制備:吸水紙裁剪成30*2.7cm每條； (4)組裝:將上述硝酸纖維素膜、吸水墊、樣品墊粘貼在塑料底襯上，將貼好的中間物用斬切機切成一定寬度的試紙條。
5.根據權利要求4所述的一種干式免疫檢測試紙條的制備方法，其特征在于所述封閉蛋白液I與封閉蛋白液II均包含酪蛋白與BSA。
6.根據權利要求4或5所述的一種干式免疫檢測試紙條的制備方法，其特征在于所述的封閉蛋白液I的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:5-2:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。
7.根據權利要求4或5所述的一種干式免疫檢測試紙條的制備方法，其特征在于所述的封閉蛋白液II的制備方法:用三蒸水溶解質量比為1:5-1:1的酪蛋白與BSA，然后配置成濃度不高于15%的溶液。
8.一種干式免疫檢測試紙條應用于雙抗夾心法或者競爭法原理的免疫定量檢測。
全文摘要
本發明涉及一種干式免疫檢測試紙條及其制備方法與應用。該試紙條在塑料底襯上從左到右依次粘有樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水墊，硝酸纖維素膜右端設有相互平行的質控線和檢測線；硝酸纖維素膜左端設有示蹤粒子標記抗體/抗原包被線和封閉蛋白線Ⅰ，封閉蛋白線Ⅰ為封閉蛋白液Ⅰ包被硝酸纖維素膜形成的線，抗體/抗原包被線為示蹤粒子標記抗體/抗原噴到封閉蛋白線Ⅱ上形成的線，其中，封閉蛋白線Ⅱ為封閉蛋白液Ⅱ包被硝酸纖維素膜形成的線。該試紙條應用于雙抗夾心法或者競爭法原理的免疫檢測，操作簡單、層析迅速、特異性強、檢測結果準確、穩定性強。
文檔編號G01N33/558GK103226143SQ20131011715
公開日2013年7月31日 申請日期2013年4月7日 優先權日2013年4月7日
發明者蘇恩本, 王勇, 焦麗蓉 申請人:南京基蛋生物科技有限公司
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