一種降低電化學傳感器背景信號的方法及應用其的傳感器的制造方法
【專利摘要】本發明涉及一種降低電化學傳感器背景信號的方法及應用其的傳感器，屬于生物分析【技術領域】。本發明通過在傳感器構建或檢測過程中形成類似于自然界中常見的“荷葉效應”，將尺寸較小的分子信號探針固定到納米金顆粒表面合成尺寸較大的納米探針，從而在傳感過程中形成與荷葉表面類似的納米結構，有效防止了信號探針插入電極表面上的DNA單分子層的分子間隙而引起的吸附，使得電化學傳感器背景信號基本清除。結果表明，在檢測可卡因和三磷酸腺苷時，采用納米探針后兩者的背景信號幾乎完全清除，相應地大大提高了檢測的靈敏度，兩者的檢測靈敏度分別為6nM和5nM，分別提高了2000倍和1000倍；而在檢測Hg2+時，其信號殘留也從原來的30％下降到了6％以下。
【專利說明】一種降低電化學傳感器背景信號的方法及應用其的傳感器
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種降低電化學傳感器背景信號的方法及其應用，屬于生物分析【技術領域】。
【背景技術】
[0002]基于固相基質的傳感器，如微陣列，試紙條，平面波導系統和電極等因具有高通量，測量簡單，便攜和自動化、微型化兼容性好等優點而被廣泛應用于基礎研究和實際檢測。但此類傳感器也存在不少技術上的難題而限制了它們的應用。最普遍和嚴重的問題是在固相基質表面信號探針的非特異性吸附引起強的背景信號而造成傳感器的檢測靈敏度下降。自組裝分子層鈍化表面(Sens Actuators B Chem.2008,129 (I), 225-230.)高分子聚合物(Anal.Chem.2005，77 (23)，7758-7762.)，DNA 探針(Ahal.Chem.2011,83(17),6464-6467.)和其他封閉試劑是常用的減少傳感器表面吸附的方法。但在很多情況下這些方法并不能有效降低背景信號。因此發展一種通用而又十分簡單有效地清除電化學傳感器背景信號的方法仍是對廣大科研人員的挑戰。
[0003]納米金顆粒是一種直徑在I?lOOnm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性的納米材料。因為具有高的比表面積，良好的生物相容性和電催化活性等獨特性質而被廣泛應用于生物傳感器中進行分子識別和信號放大等。
【發明內容】
[0004]荷葉具有自清潔的效果，研究表明這種“荷葉效應”是由于荷葉表面具有納米結構，納米柱之間的距離遠遠小于水珠的直徑，使得水珠無法進入納米柱間從而無法沾污荷葉的表面。本發明將小尺寸的分子信號探針通過Au-S鍵固定到納米金顆粒表面合成納米探針，這樣就可以在傳感過程中形成與荷葉表面類似的納米結構，達到清除(降低)電化學背景信號的目的。具體地說:分子探針固定到納米金表面后其直徑將超過13nm以上，而按常規方法組裝的電化學傳感器自組裝單分子層探針間距離為4?8nm。此時納米探針的尺寸超過單分子層探針間距離，在組裝或傳感過程中將形成與荷葉相似的仿生納米結構，達至IJ類似“荷葉效應”的自清潔效應，以清除電極表面的非特異性吸附而大幅提高傳感器檢測性能。
[0005]本發明的主要內容是通過將分子探針固定到納米金表面合成為納米探針，構建對電化學傳感器電極表面非特異性吸附進行自清潔的方法及展示其應用，本發明提供一種降低電化學傳感器背景信號的方法，其中，該方法包括如下步驟:步驟一:將化學修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；步驟二:將分子信號探針通過化學自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針。
[0006]進一步，根據所述的方法，其中，所述捕獲探針或所述分子信號探針為較短鏈的探針。[0007]進一步，根據所述的方法，其中，步驟一如下:1 μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有IOOyM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0MNaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過夜自組裝，組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl,pH = 7.0)備用。
[0008]進一步，根據所述的方法，其中，步驟二如下:將標記電化學氧化還原基團的分子信號探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應20min。使用NAP_5column過柱純化,然后通過在260nm處紫外可見吸收峰值對分子信號探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使 NaCl 終濃度為 0.3M，振蕩 16h 后，9000rpm 離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C下備用。
[0009]進一步，根據所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針5:HS- (CH2) 6-AGACAAGGAAAA ;所述分子信號探針為探針 6:HS- (CH2) 6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG- (CH2) 6-MB。
[0010]進一步，根據所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針7:HS- (CH2) 6-A5ACCTGGGGGAGTAT ;所述分子信號探針為探針 8:HS_ (CH2) 6_A5TGCGGAGGAAGGT_ (CH2) 6-MB。
[0011]進一步，根據所述的方法，其中，所述捕獲探針為探針9 =T15-(CH2)6-SH;所述分子信號探針為探針 10:Fc-(CH2)6-A2tl-(CH2) 6-SH。
[0012]本發明還提供一種電化學傳感器，其中，將所述的納米探針溶于IOmM PB,0.2MNaCl, pH7.0的緩沖溶液中為電解液，納米金的終濃度為5nM，以所述的固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系。
[0013]本發明還提供一種電化學傳感器，其中，將包被了所述的探針10的納米金用雜交液(1/15M PB, 0.3M NaCl,pH7.4)稀釋成2nM，與組裝了所述探針9的金電極在25°C下撫育3h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。
[0014]本發明中利用納米探針清除電極表面非特異性吸附來降低電化學傳感器背景信號的方法如下:
[0015](I)將化學修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；
[0016]I μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有100 μ M三[2_羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0M NaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過夜自組裝。組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl，pH = 7.0)備用。
[0017](2)將分子信號探針通過化學自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針；
[0018]將標記電化學氧化還原基團的分子信號探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應20min。使用NAP-5column過柱純化，然后通過在260nm處紫外可見吸收峰值對分子信號探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時。老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使NaCl終濃度為0.3M，振蕩16h后，9000rpm離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C
下備用。
[0019](3)傳感器的構建與靶標的電化學檢測。
[0020]本發明中清除(降低)電化學傳感器背景信號方法分別在信號增加檢測平臺(A)和信號減小檢測平臺(B)上應用，具體操作分別包括如下步驟:
[0021](A)可卡因和三磷酸腺苷的檢測:將納米探針溶于緩沖溶液中(IOmM PB,0.2MNaCl, pH7.0)為電解液，納米金的終濃度為5nM，以固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系，往電解液加入一定濃度的可卡因或者三磷酸腺苷，待體系平衡5分鐘后，進行方波伏安(SWV)分析。根據SWV的電信號強度的變化實現對可卡因或者三磷酸腺苷的檢測。
[0022](B)Hg2+的檢測:將包被了標記二茂鐵的全A鏈的納米金用雜交液(1/15M PB,0.3MNaCl，pH7.4)稀釋成2nM，與組裝好全T寡核苷酸鏈的金電極在25°C下撫育3h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。檢測Hg2+時，將一定濃度的Hg2+配置在雜交液中，將組裝好的傳感器浸泡于其中，于25°C下撫育30min，再用雜交液沖洗三次。進行方波伏安(SWV)分析。根據SWV的電信號強度的變化實現對Hg2+的檢測。
[0023]本發明的基于納米探針來減小電化學傳感器電極表面非特異性吸附，從而降低背景信號的方法具有如下的技術效果:
[0024]1、本發明基于納米探針來降低背景信號的方法簡單、易行。
[0025]2、本發明的方法可以基本清除電化學信號增加檢測平臺的背景信號，大幅提高檢測的靈敏度。
[0026]3、本發明的方法可以大幅清除電化學信號減小檢測平臺的背景信號，提高檢測的相對信號變化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0027]圖1A—圖1S，是利用納米探針清除傳感器電極表面非特異性吸附的原理圖。
[0028]圖2A-圖22，是本發明一個實施例中組裝不同長度探針和組裝不同密度的探針電極表面非特異性吸附前后的阻抗表征圖。圖2A中a，b，c分別是探針1，2和3組裝到電極上之后的阻抗譜圖；a'，b' ’c'是上述申極分別與探針4撫育后的陽抗譜圖。圖2S中a，b，c分別是組裝了低密度，中等密度，高密度的探針I的金電極的阻抗譜圖；上述電極分別與探針4撫育后的阻抗譜圖。
[0029]圖3A-圖32，是本發明一個實施例中利用納米探針的方法清除可卡因電化學傳感器的背景信號以優化其檢測性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
[0030]圖4A-圖42，是本發明一個實施例中利用納米探針的方法清除三磷酸腺苷電化學傳感器的背景信號以優化其檢測性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
[0031]圖5A-圖5S，是本發明一個實施例中利用納米探針的方法清除Hg2+電化學傳感器的信號殘留以優化其檢測性能的原理圖和SWV圖及工作曲線。
【具體實施方式】[0032]表1:本發明中使用的核酸探針序列。
[0033]
【權利要求】
1.一種降低電化學傳感器背景信號的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟:步驟一:將化學修飾的捕獲探針固定到金電極的表面；步驟二:將分子信號探針通過化學自組裝固定到納米金顆粒表面合成納米探針。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針或所述分子信號探針為較短鏈的探針。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟一如下:1μ M的末端巰基修飾的捕獲探針在含有IOOyM三[2-羧乙基]膦(TCEP)的緩沖溶液中(IOmM磷酸鹽緩沖溶液(PB)，1.0M NaCl, pH = 7.0)室溫下還原lh，將干凈的裸金電極浸泡到其中，室溫下過夜自組裝，組裝后的電極用超純水沖洗三遍，然后將電極放到含ImM巰基己醇(MCH)的水溶液中封閉30分鐘，再用超純水沖洗三遍，吹干后放置于緩沖溶液中(IOmM PB, 1.0M NaCl, pH = 7.0)備用。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟二如下:將標記電化學氧化還原基團的分子信號探針，溶入到50mM 二硫蘇糖醇(DTT)，體積比2%三乙胺(TEA)的水溶液中，室溫下反應20min。使用NAP-5column過柱純化,然后通過在260nm處紫外可見吸收峰值對分子信號探針定量，加入到粒徑為13nm的9nM納米金溶液(分子信號探針與納米金摩爾比例為100: I)，在室溫下靜置老化16小時，老化后在分子雜交儀中振蕩下分多次加入氯化鈉緩沖溶液(IOmM PB, IM NaCl，pH = 7.4)，使 NaCl 終濃度為 0.3M,振蕩 16h 后，9000rpm 離心20min，用IOmM PB (pH = 7.4)洗滌三次，置于4°C下備用。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針5:HS- (CH2) 6-AGACAAGGAAAA ;所述分子信號探針為探針 6:HS- (CH2) 6-A5TCCTTCAATGAAGTGGGTCG- (CH2) 6-MB。
6.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針7:HS- (CH2) 6-A5ACCTGGGGGAGTAT ;所述分子信號探針為探針 8:HS_ (CH2) 6_A5TGCGGAGGAAGGT_ (CH2) 6-MB。
7.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特征在于，所述捕獲探針為探針9:T15-(CH2)6-SH ;所述分子信號探針為探針 10 =Fc-(CH2)6-A2tl-(CH2) 6-SH。
8.一種電化學傳感器，其特征在于，將權利要求1所述的納米探針溶于IOmM PB, 0.2MNaCl，pH7.0的緩沖溶液中為電解液，納米金的終濃度為5nM，以權利要求1所述的固定捕獲探針的金電極作為工作電極組成三電極體系。
9.一種電化學傳感器，其特征在于，將包被了權利要求7中所述的探針10的納米金用雜交液(1/15M PB, 0.3M NaCl，pH7.4)稀釋成2nM，與組裝了權利要求7中所述探針9的金電極在25°C下撫育3h，再用雜交液沖洗三次，即制得傳感器。
【文檔編號】G01N27/416GK103983679SQ201410238990
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月30日 優先權日:2014年5月30日
【發明者】婁新徽, 趙滔, 劉然, 何苗 申請人:首都師范大學, 清華大學
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