用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法
【專利摘要】一種用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于：包括以下步驟：1）配制實驗試劑，2）細胞接種，3）電子煙煙液體染毒，4）中性紅染色，5）結果與分析。本發明針對大多數電子煙煙液樣本密度大的特點，確立了采用質量稱重配制電子煙染毒溶液的方法。通過細胞接種密度的優化步驟，篩查了最佳接種密度下最適用于電子煙煙液毒性評價的細胞系BEAS-2B細胞。并通過電子煙煙液染毒濃度的優化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應曲線。本測定方法還具有快速簡便、靈敏性高的優點。
【專利說明】用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及電子煙煙液體外細胞毒性的測定，具體說是基于中性紅染料分析電子煙煙液染毒后細胞存活率的定量測定方法。
【背景技術】
[0002]隨著人們對“吸煙有害健康”的了解，各國政府均在現行法律規定范圍內積極采取和實行有效的立法、行政或其他措施，禁止在公共場所吸煙。2005年，中國簽署了世界衛生組織《煙草控制框架公約》。2012年，中國政府發布《中國煙草控制規劃(2012-2015年)》，提出創造無煙環境，實施公共場所全面禁煙。室內禁煙措施導致電子煙等新型產品在各國市場上得到迅速增長，消費群體不斷擴大。電子煙又名電子尼古丁傳送系統。世界衛生組織對電子尼古丁傳送系統的官方定義為:電子尼古丁傳送系統是一種消費產品，能夠向肺傳輸尼古丁。電子煙一般都由三部分構成:煙桿、霧化器、煙液。近年來，電子煙以“保健”，“戒煙”，“清肺”等為宣傳口號，以網絡為主要營銷途徑，在中國地區銷量大增。某些電子煙產品還宣稱其比傳統卷煙的危害性更小。然而目前對電子煙的毒性評價研究較少，相關研究僅使用3-(4，5- 二甲基噻唑-2)-2，5- 二苯基四氮唑溴鹽法(MTT法)對電子煙煙液或煙霧的細胞毒性進行評價，結果表明不同電子煙煙液的細胞毒性相差很大。
[0003]檢測化合物細胞毒性可通過多種生物學終點進行，例如通過測定酸性磷酸酶或其他蛋白活性來計算細胞數量、測定細胞代謝活性(例如MTT法)以及檢測細胞膜的完整性等生物學終點進行評價。根據不同檢測原理開展細胞毒性評價，可從不同角度揭示化合物細胞毒性的作用機理。
[0004]中性紅吸收試驗是廣泛接受的用來評價藥物、化妝品、工業化工原料及環境污染物對不同細胞的毒性的體外細胞毒性測試方法。在眾多細胞毒性測試方法中，中性紅試驗是最為靈敏的評價卷煙煙氣冷凝物細胞毒性的方法。然而，該方法是否可用于評價電子煙煙液細胞毒性還未見文獻報道。
【發明內容】
[0005]本發明基于中性紅細胞毒性試驗的原理，根據電子煙煙液細胞毒性的特點，通過篩選適用于電子煙煙液細胞毒性評價的細胞系，優化染毒濃度，建立的一種電子煙煙液體外細胞毒性的測定方法，該方法具有檢測通量高，靈敏度高，定量準確等優勢。
[0006]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
一種用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，包括以下步驟:
O溶液的制備:
(1)中性紅染液:0.2 g中性紅加雙蒸水至100 ml，過濾除菌并用細胞培養基稀釋至50μ g/ml ；
(2)中性紅萃取液:冰醋酸:無水乙醇:水=1: 50: 49 ;
(3)陽性對照:十二烷基硫酸鈉(SDS)(200 μ g/ml, 100%細胞致死率濃度)； (4)電子煙煙液染毒溶液:由于電子煙煙液的主要組成成分包括丙二醇、丙三醇等保潤齊U，導致電子煙煙液溶液密度較大，無法準確移取體積進行染毒溶液的配制。因此，本發明中使用精度不小于萬分之一的分析天平對電子煙煙彈液進行準確稱量，然后使用細胞培養基溶液稀釋配制。
[0007]2)細胞樣本的處理:
(I)細胞接種:本方法適用的細胞種類為人肺正常上皮細胞BEAS-2B細胞。向96孔板的每孔中加入100 μ L的BEAS-2B細胞懸液。
[0008](2)電子煙煙液染毒:細胞培養24 h后，吸去培養液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設置為陰性對照組、8個不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽性對照組。陰性對照組每孔加入100 μ I細胞培養基、電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I電子煙染毒溶液、陽性對照組每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I稀釋培養液作為溶劑背景對照，于37 °C、5% CO2條件下培養24 h。
[0009](3)中性紅染色:電子煙煙液染毒24 h后，吸去培養液，每孔加入100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入IOOul中性紅提取液。室溫下快速振蕩15?20 min，使用酶標儀檢測540 nm波長處的吸光值。
[0010](4)結果與分析:計算相對吸光值，相對吸光值代表細胞存活率。相對吸光值C=
A540/ A54ci陰性對照
注:所用SDS陽性對照為100%細胞致死濃度，故A54cihwm應小于等于0.3。
[0011]由于電子煙煙液的細胞毒性較低，應選擇對其染毒響應更靈敏的細胞系作為測試細胞系，本發明中對CHO細胞，A549細胞，BEAS-2B細胞進行篩選。圖1所示為CHO細胞，A549細胞，BEAS-2B細胞最佳接種密度條件優化。如圖可知，當CHO細胞，A549細胞的接種密度等于或大于20000個/孔時，細胞生長達到平臺期，這表明細胞接種密度過高，已出現抑制作用，細胞無法繼續增殖和生長。當細胞接種密度為10000個/孔時，細胞處于指數增長期且響應信號最大，因此，CHO細胞和A549細胞的最佳接種密度為10000個/孔。對于BEAS-2B細胞，接種密度等于或大于40000個/孔時，細胞生長達到平臺期，這表明細胞接種密度過高，已出現抑制作用，細胞無法繼續增殖和生長。當細胞接種密度為20000個/孔時，細胞處于指數增長期且響應信號最大，因此，BEAS-2B細胞的最佳接種密度為20000個/孔。
[0012]本發明采用最佳接種密度下的三種細胞系對電子煙產品I的煙液細胞毒性進行測定。圖2所示為采用CHO細胞，A549細胞，BEAS-2B細胞三種細胞系進行電子煙煙液細胞毒性評價時，電子煙煙液染毒濃度與中性紅吸收值的劑量效應關系，根據公式計算得到其半數抑制率IC50值分別為15.2mg/ml, 31.4 mg/ml, 46.7 mg/ml,由此可知，BEAS-2B細胞對電子煙煙液細胞毒性測定更靈敏，本發明中選擇BEAS-2B細胞為電子煙煙液細胞毒性測定所用細胞株。
[0013]由圖2可知，當選擇BEAS-2B細胞為測試細胞株時，當染毒濃度為5mg/ml至60mg/ml時，電子煙煙液對細胞的細胞毒性由小變大，有很好的劑量效應關系，因此考察電子煙煙液細胞毒性濃度的染毒區間應包含5mg/ml至60 mg/ml范圍。
[0014]本發明根據電子煙煙液的特性，建立了一種基于中性紅試驗分析電子煙煙液染毒后細胞存活率的定量測定方法，本發明具有以下特點:(1)針對大多數電子煙煙液樣本密度大的特點，確立了采用質量稱重配制電子煙染毒溶液的方法。(2)通過不同細胞系的篩選，接種密度的優化步驟，選擇更適用于電子煙煙液細胞毒性評價的BEAS-2B細胞。(3)并通過電子煙煙液染毒濃度的優化，確定了最佳染毒濃度，以獲得最佳劑量效應曲線。此外，本測定方法還具有操作快速簡便、靈敏性高、結果穩定的優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1.細胞接種密度優化。
[0016]圖2.不同細胞系檢測電子煙樣品I煙液細胞毒性的劑量-效應關系。
[0017]圖3.BEAS-2B細胞檢測電子煙樣品2煙液細胞毒性的劑量-效應關系。
【具體實施方式】
[0018]本發明以下結合實施例做進一步描述，但并不是限制本發明。
[0019]為考察電子煙樣品2煙液染毒對BEAS-2B細胞的毒性影響。經擴增培養的BEAS-2B細胞進行胰酶消化以后，制備細胞懸液(2X IO5個/ml)。96孔板(除最外周36個孔)中每孔加入100 μ I細胞懸液，于37 °C、5% CO2條件下培養24 h。細胞培養24 h后，吸去培養液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設置為陰性對照、8個不同劑量(5 mg/ml,10mg/ml, 15 mg/ml, 20mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml)的電子煙煙液染毒和陽性對照處理。96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I稀釋培養液作為溶液背景對照，于37 °C、5% CO2條件下培養24 h。電子煙煙液染毒染毒24 h后，吸去培養液，每孔加Λ100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養3 h。3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200 μ IPBS洗2次，加入I ml中性紅提取液。室溫下快速振蕩15?20 min,使用酶標儀檢測540 nm波長處的吸光值。圖3所示為電子煙煙液染毒所得到的劑量效應曲線，如圖3可知，電子煙煙液染毒濃度與中性紅檢測吸光度值有很好的劑量效應關系，可通過公式計算IC50值。
【權利要求】
1.一種用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于:包括以下步驟: 1)溶液的制備: (1)中性紅染液:0.2 g中性紅加雙蒸水至100 ml，過濾除菌并用細胞培養基稀釋至50μ g/ml ； (2)中性紅萃取液:冰醋酸:無水乙醇:水=1: 50: 49 ; (3)陽性對照:十二烷基硫酸鈉(SDS)，200μ g/ml, 100%細胞致死率濃度； (4)電子煙煙液染毒溶液:使用分析天平對電子煙煙彈液進行準確稱量，然后使用細胞培養基溶液稀釋配制； 2)細胞樣本的處理: (1)細胞接種:選用人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞，向96孔板的每孔中加入100μ L的BEAS-2B細胞懸液； (2)電子煙煙液染毒:細胞培養24h后，吸去培養液，96孔板(除最外周36孔)每列6孔為一組分別設置為陰性對照組、8個不同劑量的電子煙煙液染毒組和陽性對照組，陰性對照組每孔加入100 μ I細胞 培養基、電子煙煙液染毒組每孔加入100 μ I電子煙染毒溶液、陽性對照組每孔加入200 μ g/ml的SDS溶液，96孔板的最外周36個孔中每孔加入100 μ I稀釋培養液作為溶劑背景對照，于37 °C、5% CO2條件下培養24 h ； (3)中性紅染色:電子煙煙液染毒24h后，吸去培養液，每孔加入100 μ I中性紅染液，于37 °C、5% CO2條件下培養3 h，3 h后取出96孔板，吸去中性紅染液，每孔加入200μ IPBS洗2次，加入IOOul中性紅萃取液，室溫下快速振蕩15-20 min,使用酶標儀檢測540nm波長處的吸光煙液值； (4)結果與分析:計算相對吸光值，相對吸光值代表細胞存活率，相對吸光值C=A540/^540陰性對照； 此外，所用SDS陽性對照為100%細胞致死濃度，故A54cih1wm應小于等于0.3。
2.根據權利要求1所述的用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于:人正常肺上皮細胞BEAS-2B細胞最佳接種密度為20000個/孔。
3.根據權利要求1所述的用于電子煙煙液細胞毒性評價的中性紅吸收測定方法，其特征在于:電子煙煙液細胞毒性濃度的染毒區間應包含5mg/ml至60 mg/ml范圍。
【文檔編號】G01N21/31GK103808681SQ201410094933
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】劉彤, 陳歡, 韓書磊, 吳帥賓, 付立偉, 張小濤, 石龍凱, 侯宏衛, 胡清源 申請人:國家煙草質量監督檢驗中心
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