一種蜜環菌濃縮液的質量控制方法
【專利摘要】本發明涉及一種蜜環菌濃縮液的質量控制方法，包括性狀檢查、化學類成分鑒別、密度、pH值、水中不溶物、微生物限度，以及肽含量測定，同時采用更高濃縮狀態進行儲藏運輸，該方法經復核驗證能夠從多方面評價蜜環菌濃縮液的質量。
【專利說明】一種蜜環菌濃縮液的質量控制方法
【技術領域】：
[0001] 本發明屬于醫藥領域，具體涉及蜜環菌濃縮液的質量控制方法。
【背景技術】：
[0002] 蜜環菌濃縮液為白蘑科真菌蜜環菌Armillariamellea(Vahl.exFr)Quel.人工 液體發酵的培養液，經濃縮濾過的液體。近年來經大量的研究實驗證明，蜜環菌的菌絲體和 發酵液都具有與天麻相似的藥理作用和臨床療效（郭順星，等.蜜環菌的化學成分及應用 研究[J].微生物學通報，1996. 23 (4):239.)。藥理研究表明，蜜環菌濃縮液主要具有鎮靜 催眠、抗驚厥、保護心腦血管、改善眩暈綜合癥、增強免疫等作用。蜜環菌濃縮液為中成藥腦 心舒口服液中主要原料，其為白蘑科真菌蜜環菌Armillariamellea(Vahl.exFr)Quel.人 工液體發酵的培養液，經濃縮濾過的液體，在市場上可以買到，在《中藥大辭典》榛磨項下有 具體描述，比如如下的生產方法：
[0003] 1、菌種培養
[0004] 1. 1、母種（試管種）培養
[0005]取蜜環菌Armillariamellea(Vahl.exFr.)Quel.保藏菌株，用PDA培養基（馬 鈴薯200g煮熟過濾，蔗糖20g，硫酸鎂0. 75g，磷酸二氫鉀0. 75g，瓊脂20g，配置1000ml)培 養。滅菌條件：110°C，0. 1MP，滅菌30分鐘。培養溫度26-28°C，培養周期7-10天。
[0006] 1. 2、搖床擴大培養（液體菌種培養）
[0007] 取培養好的母種（試管種），轉接于三角瓶液體搖床培養，培養基為PDA培養基不 加瓊脂，500ml三角瓶裝量250-300ml。接種（母種）后于搖床上llOn/m振蕩培養。滅菌 條件：110°C，0. 1MP，滅菌30分鐘。培養溫度26-28°C，培養周期3-4天。
[0008] 1. 3、種子罐培養
[0009] 培養好的三角瓶液體菌種轉接于種子罐進行發酵培養，培養基同液體菌種培養 基。滅菌條件：110°c，0. 1MP，2小時。培養溫度26-28°C，培養周期4-6天。
[0010] 1.4、發酵
[0011] 培養基：麥麩200g，玉米粉10g，蔗糖20g，酵母粉10g，水lOOOg。將60%體積的 培養基置發酵罐中，滅菌，將種子罐菌種轉接于發酵罐內進行發酵培養，待發酵液變為紫褐 色，由稠變稀，部分菌絲開始自溶，菌絲顆粒變碎，pH值降至5. 2 -5. 6,罐內亮度開始減弱， 即可出罐。滅菌條件：121°C，0. 1MP，2小時。培養溫度26-28°C，培養周期6-7天。
[0012] 2、濾過
[0013] 培養好的發酵液，板框壓濾。
[0014] 3、濃縮
[0015] 將上述濾液置真空減壓濃縮罐內，減壓濃縮至相對密度1. 18 (20°C)。
[0016] 但蜜環菌濃縮液作為藥物使用目前尚無法定標準。
[0017] 蜜環菌濃縮液屬于成分復雜的復合成分原料，其檢測方法的準確性，精密性，方便 性是非常重要的，為此，本發明人進行了大量的研究，最終發現一種有效的蜜環菌濃縮液的 檢測方法。
【發明內容】
：
[0018] 本發明的目的在于提供蜜環菌濃縮液的質量控制方法，以解決目前沒有標準的狀 況。
[0019] 為此，本發明提供一種有效的蜜環菌濃縮液的檢測方法，所述方法包括以下步 驟：
[0020] 蜜環菌濃縮液性狀的觀察，蜜環菌濃縮液的鑒別，蜜環菌濃縮液的檢查，對蜜環菌 濃縮液含有的成分進行含量測定，因此，本發明的方法主要的步驟是：
[0021] 蜜環菌濃縮液性狀的觀察，步驟是：
[0022] 本品為棕黃至棕褐色澄清液體，味微酸、苦、微甜。
[0023] 蜜環菌濃縮液的鑒別，步驟是：
[0024] 鑒別1 :取本品數滴于濾紙上，噴以茚三酮試液，烘干后顯藍紫色或紫紅色斑點。
[0025] 鑒別2 :取本品約I.0ml，加水10ml，搖勻，取2ml，加5%α-萘酚乙醇液數滴，搖 勻，沿壁加入濃硫酸lml，在兩液面交界處顯紫紅色環。
[0026] 鑒別3:取本品約15ml，置分液漏斗中，加乙醚分兩次萃取，合并萃取液，揮干。殘 渣加乙醇Iml使溶解，做為供試品溶液。取5-羥甲基糖醛對照品適量，制成lmg/ml的對照 品溶液，以上兩溶液各IOul分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60-90°C)_乙酸乙 酯-氯仿（2 :2 :1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm下檢視。供試品色譜中，在與對照 品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。
[0027] 蜜環菌濃縮液的檢查，步驟是：
[0028] 縮液的檢查，步驟是：
[0029] 相對密度：具體操作均符合《中國藥典》通則項下相關要求，本品的相對密度應為 1. 030 ?1. 035(20?)，
[0030]pH值：具體操作符合《中國藥典》2010年版一部附錄WG，pH值應為4. 0?5. 5，
[0031] 水中不溶物：精密量取本品10ml，置恒重的離心管中，以4000rpm的轉速離心15 分鐘后，棄去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中國藥典》201年版一部附錄），減失重 量大于0. 5%，不得過3. 0%，微生物限度：照中國藥典2010年版一部附錄XIIIC檢查，應符 合規定。
[0032] 對蜜環菌濃縮液含有的成分進行含量測定，步驟是：
[0033] 以牛血清白蛋白為對照，測定樣品中肽的含量。測定方法為：
[0034] 對照品溶液制備：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0.3mg的溶液，即得。
[0035]標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0.01111(0號管）、0.11111、0.21111、0.41111、 0. 6ml、0. 8ml、I. 0ml，分別置具塞試管中，各加水至I. 0ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室 溫放置10分鐘后，加入福林試液（1 - 16)4. 0ml，（福林試液（1 - 16)S卩：取福林試液儲備 液Iml加水至16ml制成的溶液，其中所述福林試液儲備液配制方法如下：取鎢酸鈉10g、 鑰酸鈉2. 5g，加水70ml、85 %磷酸5ml與鹽酸10ml，置200ml燒瓶中，緩緩加熱回流10小 時，放冷，再加硫酸鋰15g、水5ml和溴滴定液1滴煮沸約15分鐘，至溴除盡，放冷至室溫， 加水使成l〇〇ml。濾過,濾液作為貯備液。置棕色瓶中，于冰箱中保存），搖勻，于55°C水浴 中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫。以O管為空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄V A)，在650nm波長處測定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
[0036]測定法：精密稱取本品1. 0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得稀 釋液，精密量取稀釋液I. 〇ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林 試液（取儲備液1 - 16,儲備液制法同前）4. 0ml，搖勻，于55°C水浴中保溫5分鐘，取出， 放冷至室溫，以0管為空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄VA)，在650nm波長處 測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含牛血清白蛋白的重量，計算，即得。
[0037] 本品含肽以牛血清白蛋白計，不得少于0. 2%。
[0038] 本發明進一步提供一種蜜環菌濃縮液的質量控制方法，即對蜜環菌濃縮液的質量 進行檢測，制定質量標準，并使用本發明方法進行檢測。上述的一種蜜環菌濃縮液的質量 控制方法，其特征在于，鑒別的多糖、氨基酸、5_羥甲基糠醛的方法可以采取液相、薄層、理 化反應方法。上述的一種蜜環菌濃縮液的質量控制方法，其特征在于，待檢樣品取樣量為 2. 5g〇
[0039] 本發明蜜環菌濃縮液的測定方法是經過篩選獲得的，篩選過程如下：
[0040] 1、性狀：根據長期生產樣品的外觀、色澤、氣味的實際情況，性狀規定為"本品為棕 黃至棕褐色澄清液體，味微酸、苦、微甜"。
[0041] 2、鑒別項，主要包括3個鑒別內容，其中，
[0042] 鑒別（1)取本品數滴于濾紙上，噴以茚三酮試液，烘干后顯藍紫色或紫紅色斑點。 此鑒別為氨基酸的化學反應，茚三酮反應。茚三酮反應分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形 成C02、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮同 另一個水合茚三酮分子和氨縮合生成有色物質。
[0043] 鑒別⑵取本品約I. 0ml，加水10ml，搖勻，取2ml，加5%α-萘酚乙醇液數滴，搖 勻，沿壁加入濃硫酸lml，在兩液面交界處顯紫紅色環。此鑒別為多糖的化學反應鑒別。它 的原理是：糖類在濃酸作用下所形成的糠醛及其衍生物可以與α-萘酚作用，形成紅紫色 復合物。由于在糖溶液與濃硫酸兩液面間出現紅紫色的環，因此又稱紫環反應。此反應就 是糖的Molisch(莫立許）反應（α-萘酚反應）。此方法是鑒定糖類最常用的顏色反應。
[0044] 鑒別⑶取本品約15ml，置分液漏斗中，加乙醚分兩次萃取，合并萃取液，揮干。殘 渣加乙醇Iml使溶解，做為供試品溶液。取5-羥甲基糖醛對照品適量，制成lmg/ml的對照 品溶液，以上兩溶液各IOul分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60-90°C)_乙酸乙 酯-氯仿（2:2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm下檢視。供試品色譜中，在與對照 品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。
[0045] 3、檢查項，主要包括：相對密度、pH值、水中不溶物、微生物限度等實驗。具體操作 均應符合《中國藥典》通則項下相關要求。
[0046] 相對密度：本品的相對密度（中國藥典2010年版一部，附錄WA)，應為L030? I. 035(20〇C) 〇
[0047] 表1近3年樣品相對密度檢驗結果
[0048]
【權利要求】
1. 一種蜜環菌濃縮液的檢測方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：蜜環菌濃縮 液性狀的觀察，蜜環菌濃縮液的鑒別，蜜環菌濃縮液的檢查，對蜜環菌濃縮液含有的成分進 行含量測定。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，蜜環菌濃縮液性狀的觀察，步 驟是：本品為棕黃至棕褐色澄清液體，味微酸、苦、微甜。
3. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，蜜環菌濃縮液的鑒別，步驟是： 鑒別1 :取本品數滴于濾紙上，噴以茚三酮試液，烘干后顯藍紫色或紫紅色斑點， 鑒別2 :取本品約I. Oml，加水10ml，搖勻，取2ml，加5% a -萘酚乙醇液數滴，搖勻，沿 壁加入濃硫酸Iml,在兩液面交界處顯紫紅色環， 鑒別3 :取本品約15ml，置分液漏斗中，加乙醚分兩次萃取，合并萃取液，揮干，殘渣加 乙醇Iml使溶解，做為供試品溶液，取5-羥甲基糖醛對照品適量，制成lmg/ml的對照品溶 液，以上兩溶液各IOul分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60-90°C )_乙酸乙酯-氯 仿（2 :2 :1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜 相應的位置上顯相同顏色的斑點。
4. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，蜜環菌濃縮液的檢查，步驟是： 相對密度：具體操作均符合《中國藥典》通則項下相關要求，本品的相對密度應為 1. 030 ?1. 035(201：)， pH值：具體操作符合《中國藥典》2010年版一部附錄W G，pH值應為4. 0?5. 5， 水中不溶物：精密量取本品l〇ml，置恒重的離心管中，以4000rpm的轉速離心15分鐘 后，棄去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中國藥典》201年版一部附錄），減失重量大 于0. 5%，不得過3. 0%，微生物限度：照中國藥典2010年版一部附錄XIII C檢查，應符合規 定。
5. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，對蜜環菌濃縮液含有的成分進 行含量測定，步驟是： 對照品溶液制備：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0. 3mg的溶液，即得， 標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0. Oml (0號管）、0. lml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、 0. 8ml、I. 0ml，分別置具塞試管中，各加水至I. 0ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室溫放置 10分鐘后，加入福林試液（取儲備液1 - 16) 4. 0ml，搖勻，于55°C水浴中保溫5分鐘，取出， 放冷至室溫，以0管為空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄V A)，在650nm波長處測 定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線， 測定法：精密稱取本品1.0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得稀釋 液，精密量取稀釋液I. 〇ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林試 液（取儲備液1 - 16) 4. Oml，搖勻，于55°C水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫，以0管為 空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄V A)，在650nm波長處測定吸收度，從標準曲線 上讀出供試品溶液中含牛血清白蛋白的重量，計算，即得。
6. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，鑒別的多糖、氨基酸、5-羥甲基 糠醛的方法可以采取液相、薄層、理化反應方法。
7. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中，待檢樣品取樣量為2. 5g。
8. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，其中， 蜜環菌濃縮液性狀的觀察，步驟是：本品為棕黃至棕褐色澄清液體，味微酸、苦、微甜； 其中，蜜環菌濃縮液的鑒別，步驟是： 鑒別1:取本品數滴于濾紙上，噴以茚三酮試液，烘干后顯藍紫色或紫紅色斑點， 鑒別2 :取本品約1.0ml，加水10ml，搖勻，取2ml，加5% a-萘酚乙醇液數滴，搖勻，沿 壁加入濃硫酸Iml,在兩液面交界處顯紫紅色環， 鑒別3 :取本品約15ml，置分液漏斗中，加乙醚分兩次萃取，合并萃取液，揮干，殘渣加 乙醇Iml使溶解，做為供試品溶液，取5-羥甲基糖醛對照品適量，制成lmg/ml的對照品溶 液，以上兩溶液各IOul分別點于同一硅膠GF254板上，以石油醚（60-90°C )_乙酸乙酯-氯 仿（2 :2:1)為展開劑，展開，取出，晾干，置254nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜 相應的位置上顯相同顏色的斑點； 其中，蜜環菌濃縮液的檢查，步驟是： 相對密度：具體操作均符合《中國藥典》通則項下相關要求，本品的相對密度應為 1. 030 ?1. 035(201：)， pH值：具體操作符合《中國藥典》2010年版一部附錄W G，pH值應為4. 0?5. 5， 水中不溶物：精密量取本品l〇ml，置恒重的離心管中，以4000rpm的轉速離心15分鐘 后，棄去上清液，沉淀在105°C干燥至恒重（按《中國藥典》201年版一部附錄），減失重量大 于0. 5%，不得過3. 0%，微生物限度：照中國藥典2010年版一部附錄XIII C檢查，應符合規 定； 其中，對蜜環菌濃縮液含有的成分進行含量測定，步驟是： 對照品溶液制備：取牛血清白蛋白加水制成每Iml含0. 3mg的溶液，即得， 標準曲線的制備：精密量取對照品溶液0. Oml (0號管）、0. lml、0. 2ml、0. 4ml、0. 6ml、 0. 8ml、l. 0ml，分別置具塞試管中，各加水至I. 0ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室溫放置 10分鐘后，加入福林試液（取儲備液1 - 16) 4. 0ml，搖勻，于55°C水浴中保溫5分鐘，取出， 放冷至室溫，以0管為空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄V A)，在650nm波長處測 定吸收度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線， 測定法：精密稱取本品約1. 0-5. 0g，置IOOml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得稀釋 液，精密量取稀釋液I. 〇ml，再加堿性銅試液I. 0ml，搖勻，室溫放置10分鐘后，加入福林試 液（取儲備液1 - 16) 4. Oml，搖勻，于55°C水浴中保溫5分鐘，取出，放冷至室溫，以0管為 空白，照分光光度法（《中國藥典》一部附錄V A)，在650nm波長處測定吸收度，從標準曲線 上讀出供試品溶液中含牛血清白蛋白的重量，計算，即得。
【文檔編號】G01N33/68GK104316699SQ201410502761
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】周美娟, 胡浩武, 杜育華, 袁桂平, 梅玲華, 耿炤, 姜偉 申請人:江西匯仁藥業有限公司, 上海中創醫藥科技有限公司
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