專利名稱：耐熱菌的elisa快速檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種耐熱菌的檢測方法，具體是耐熱菌的ELISA快速 檢測方法，屬于食品微生物檢測領域。
背景技術：
ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)為酶聯免疫分析技術 的縮寫，該方法是以免疫學反應為基礎，將抗原、抗體的特異性反應與 酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的分析技術。其 基本原理是①使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫 活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原 或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，被檢樣品(含 有受檢的抗體或抗原)和酶標抗原或抗體與固相載體表面的抗原或抗體 結合。通過洗滌除去未結合的游離反應物，最后，結合在固相載體上的 酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物
被酶催化變為有色產物，產物的量與樣品中受檢物質的量直接相關，使 用酶標儀即可定性或定量分析。
旨i:5f月旨;^ffilf， (y4//qyc/o6ac///us ac/cfoferra^r&)， iJ^^月旨l&自 芽孢桿菌屬(^//c;^/o6""7/"s)的一員，是一種耐熱、嗜酸的細菌，俗稱 耐熱菌。蘋果濃縮汁中的耐熱菌芽孢能經受酸性條件下的巴氏殺菌過程 而存活，在適宜條件下，在果汁中大量繁殖時，產生不良氣味化合物， 同時使果汁產生輕微沉淀或霧狀渾濁，對果汁感官品質有很大影響。盡 管耐熱菌并不致病，也不產生毒素，但其引起的果汁感官性狀劣變，甚至引起果汁腐敗，完全破壞了果汁的食用性和商品價值。所以，國際貿 易中對耐熱菌含量要求很嚴，是蘋果濃縮汁產品的必檢項目，常常成為 蘋果濃縮汁貿易中的技術壁壘，從而為蘋果濃縮汁的生產、貿易和商檢 提出了新的挑戰。
我國鮮蘋果出口量和出口額分別位居世界第一位和第五位，蘋果濃
縮汁出口量居世界第一位，占60%的國際市場份額。然而耐熱菌的超標 是蘋果濃縮汁質量安全的一個常見問題，解決這一問題的關鍵之一是要 有快速、特異、靈敏的檢測技術手段，以便及時反饋到生產線，實施有 效的控制，以保證產品質量與安全。
目前，國內外對蘋果濃縮汁中耐熱菌檢測的通用方法是細菌平皿培 養記數法，檢測周期為4-5天，不能及時有效控制產品質量安全。關于 耐熱菌快速檢測方法，有日本學者建立的RT-PCR檢測方法，國內有陜 西師范大學食品工程與營養科學學院建立的PCR及QC-PCR檢測方法。 基于PCR的耐熱菌檢測方法，雖達到了快速、特異，但對設備和實驗 條件要求高，步驟較繁鎖，推廣應用較困難。
發明內容
本發明的目的是公開一種耐熱菌的ELISA快速檢測方法，解決目前 耐熱菌檢測方法存在的缺陷。 本發明的操作步驟如下
耐熱菌的捕集一耐熱菌預增菌一耐熱菌包被酶標板一封閉酶標板一 加耐熱菌多克隆抗體一加酶標抗體一加底物工作液一酶標儀測定。
本發明將樣品中捕集到的耐熱菌抗原包被在固相載體上，形成固相 抗原，加入封閉液，封閉沒有包被到的酶標板空隙部分，從而降低非特 異性吸附。加入耐熱菌多克隆抗體，其中抗體與固相抗原形成抗原-抗體復合物，再加入酶標抗體，與上述復合物結合，此時加入底物工作液， 復合物上的酶則催化底物而顯色，由于每步之間均有沖洗步驟，因此， 若樣品中不含耐熱菌，則耐熱菌多克隆抗體、酶標抗體將被洗掉，底物
不顯色而呈陰性反應；若樣品中含有耐熱菌，經過預增菌則可以達到所 需檢測濃度，最終使底物顯色而呈陽性反應。本發明簡便、易行，適合 于現場檢測，檢測限可達國際標準，可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不得超 過1個/10mL的檢測標準要求，整個操作過程可以在24小時內完成，可 成功用于果汁中耐熱菌的快速檢測。
具體實施例方式
本發明按以下具體步驟進行
a.耐熱菌的捕集
a.l取10-20g待檢蘋果濃縮汁，以無菌水適度稀釋， a.2用溶劑過濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜孔徑0.45pm，
a. 3耐熱菌被截留于濾膜表面；
b. 耐熱菌預增菌
b.l采用402培養基預增菌14-15h，使培養液中耐熱菌濃度達到5xl04 個/mL以上，
b, 2將增菌后的培養液以10000-12000rpm/min，離心10-15min;
c. 耐熱菌包被酶標板
c.l用0.05mol/L、 pH9.6的碳酸緩沖液制成菌懸液作為包被液，
c2將包被液均勻加到酶標板中，每孔100-150pL,
c.3酶標板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，
c.4用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板，
c.5每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次，c. 6洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；
d. 封閉酶標板
d.l封閉液為5% - 8%的脫脂奶粉，
d.2將封閉液均勻的加到酶標板各孔中，每孔200-300^iL， d.3在37。C溫箱中孵育2-3 h， d.4洗板
d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 d.4.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
d. 4.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；
e. 加耐熱菌多克隆抗體
e.l耐熱菌多克隆抗體為免疫大白兔得到的多克隆抗體， e.2免疫程序為
e.2.1給大白兔耳靜脈注射耐熱菌，注射的耐熱菌濃度為1X108- 1 Xl(f個/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量為0.5 mL， 以后每次注射量比上一次增加0.5 mL
e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分離血清即為耐熱菌多 克隆抗血清
e.2.3將耐熱菌多克隆抗血清經過鹽析、DEAE-纖維素層析純化即得 耐熱菌多克隆抗體，
e.3耐熱菌多克隆抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 1600，
e.4將稀釋的耐熱菌多克隆抗體加到酶標板各孔中，每孔 跳150nL，
e.5在37。C溫箱中孵育1-2 h，
e.6洗板e.6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 e.6.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
e. 6.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；
f. 加酶標抗體
f.l酶標抗體為酶標山羊抗兔抗體，
f.2酶標抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 20000,
[3將稀釋的酶標抗體加到酶標板各孔中，每孔加100-150^iL，
f.4 37。C溫箱中孵育1-2 h，
f.5洗板
f.5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板 f.5.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次
f. 5.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；
g. 加底物工作液
g.l底物工作液配方如下
g.1.1取25.7mL 0.2mol/LNa2HP04和24.3mL O.lmol/L擰檬酸液放入 lOOmL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度即為底物緩沖液
g丄2精確稱取0.02g3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺粉末，溶于20mL無水 乙醇，即為3,3' ，5，5'-四甲基聯苯胺母液
g丄3底物緩沖液與3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺母液按1:1的比例混合， 每毫升混合液再加入2mL 30%h2o2即為底物工作液，
&2將底物工作液加到酶標板各孔中，每孔加100-150pL，
g.3反應15-20 min，
g.4加終止液終止反應
g.4.1終止液為2mol/L的硫酸g. 4.2酶標板每孔各加50-75^L;
h. 酶標儀測定
h.l將終止反應的酶標板放入酶標儀， h.2在波長為450nrn處測定OD值，
h.3以樣品孔OD值-陰性孔OD值順性孔OD值22.1為陽性判斷標
準
h.3.1樣品孔為加經捕集并經預增菌處理的樣品液，以及耐熱菌多克 隆抗體、酶標抗體、底物工作液及終止液的酶標孔
h.3.2陽性樣為加耐熱菌抗原，以及耐熱菌多克隆抗體、酶標抗體、 底物工作液及終止液的酶標孔
h.3.3陰性孔為不加耐熱菌抗原，而加耐熱菌多克隆抗體、酶標抗體、 底物工作液及終止液的酶標孔。
權利要求
1.耐熱菌的ELISA快速檢測方法，其特征是按以下操作步驟進行耐熱菌的捕集；耐熱菌預增菌；耐熱菌包被酶標板；封閉酶標板；加耐熱菌多克隆抗體；加酶標抗體；加底物工作液；酶標儀測定。
2. 根據權利要求1所述的耐熱菌的ELISA快速檢測方法，其特 征是按以下具體操作步驟進行2. a耐熱菌的捕集2. a.l取10-20g待檢蘋果濃縮汁，以無菌水適度稀釋， 2. a.2用溶劑過濾器過濾捕集耐熱菌，濾膜孔徑0.45Mm, 2. a.3耐熱菌被截留于濾膜表面； 2. b耐熱菌預增菌2. b.l采用402培養基預增菌14-15h，使培養液中耐熱菌濃度達 到5xl()4個/mL以上，2.b.2將增菌后的培養液以10000-12000 rpm/min，離心10-15min; 2. c耐熱菌包被酶標板2.c.1用0.05mol/L、pH9.6的碳酸緩沖液制成菌懸液作為包被液，,2. c2將包被液均勻加到酶標板中，每孔100-150nL，2. c.3酶標板在55-6(TC烘箱中2-3 h烘干，2. c.4用0.01mol/L, pH7.4的PBS-吐溫20洗板，2. c.5每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次，2. c.6洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；2. d封閉酶標板2. d.l封閉液為5% - 8%的脫脂奶粉，2.(1.2將封閉液均勻的加到酶標板各孔中，每孔200-300nL， 2. d.3在37t)溫箱中孵育2-3 h， 2. d,4洗板2. d.4.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 2. d.4.2每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次 2. d.4.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠； 2. e加耐熱菌多克隆抗體2. e.l耐熱菌多克隆抗體為免疫大白兔得到的多克隆抗體， 2. e,2免疫程序為2. e.2.1給大白兔耳靜脈注射耐熱菌，注射的耐熱菌濃度為IX 108-lX109々/mL，每隔4天注射一次，共注射6次，第一次注射量 為0.5mL，以后每次注射量比上一次增加0.5mL2. e.2.2免疫注射6次后，于第22-25天取血，分離血清即為耐 熱菌多克隆抗血清2. e.2.3將耐熱菌多克隆抗血清經過鹽析、DEAE-纖維素層析純 化即得耐熱菌多克隆抗體，2. e.3耐熱菌多克隆抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 1600，(2. e.4將稀釋的耐熱菌多克隆抗體加到酶標板各孔中，每孔 跡150nL，2. e.5在37"C溫箱中孵育l-2h， 2. e.6洗板2. e.6.1用0.01mol/L、 pH7.4的PBS-吐溫20洗板 2. e.6.2每隔l分鐘洗板一次，共洗板5-6次 2. e.6.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠； 2. f加酶標抗體;2. f.l酶標抗體為酶標山羊抗兔抗體，2. f.2酶標抗體與PBS-吐溫20的稀釋比例為1 : 20000，2. f3將稀釋的酶標抗體加到酶標板各孔中，每孔加100-150pL，2. f.4 37。C溫箱中孵育1-2 h，2. f.5洗板2. ￡5.1用0.01mol/L， pH7.4的PBS-吐溫20洗板;2. f.5.2每隔1分鐘洗板一次，共洗板5-6次2. f.5.3洗完之后，倒扣酶標板，輕輕拍掉懸浮液珠；2. g加底物工作;2. g.l底物工作液配方如下2. g丄1取25.7mL 0.2mol/L Na2HP04和24.3mL 0. lmol/L擰檬酸 液放入100mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度即為底物緩沖液2. g丄2精確稱取0.02g 3，3' ，5,5'-四甲基聯苯胺粉末，溶于20mL 無水乙醇，即為3，3'，5，5'-四甲基聯苯胺母液2.g丄3底物緩沖液與3，3' ,5,5'-四甲基聯苯胺母液按1:1的比例 混合，每毫升混合液再加入2pL 30%H2O2即為底物工作液，( 2. g,2將底物工作液加到酶標板各孔中，每孔加100-150^L，2. g.3反應15-20 min，2. g，4加終止液終止反應2. g.4.1終止液為2mol/L的硫酸2. g.4.2酶標板每孔各加50-75^L;2. h酶標儀測定2. h.l將終止反應的酶標板放入酶標儀， 2. ^2在波長為45011111處測定00值，2.h.3以樣品孔OD值-陰性孔OD值/陰性孔OD值^2.1為陽性 判斷標準2. h.3.1樣品孔為加經捕集并經預增菌處理的樣品液，以及耐熱 菌多克隆抗體、酶標抗體、底物工作液及終止液的酶標孔2. h.3.2陽性樣為加耐熱菌抗原，以及耐熱菌多克隆抗體、酶標 抗體、底物工作液及終止液的酶標孔2. h.3.3陰性孔為不加耐熱菌抗原，而加耐熱菌多克隆抗體、酶 標抗體、底物工作液及終止液的酶標孔。
全文摘要
本發明涉及一種耐熱菌的ELISA快速檢測方法，目前采用的細菌平皿培養記數法，檢測周期長，PCR及QC-PCR檢測方法步驟較繁鎖。本發明解決了目前耐熱菌檢測方法存在的缺陷。操作步驟為耐熱菌捕集→預增菌→包被酶標板→封閉酶標板→加耐熱菌多克隆抗體→加酶標抗體→加底物工作液→酶標儀測定。由于每步均有沖洗步驟，因此若樣品中不含耐熱菌，則耐熱菌多克隆抗體、酶標抗體被洗掉；若樣品中含有耐熱菌，經過預增菌可達到所需檢測濃度，最終使底物顯色而呈陽性反應。本發明簡便易行，檢測限達國際標準，可滿足蘋果濃縮汁中耐熱菌不超過1個/10mL的檢測標準，操作過程可在24小時內完成，達到快速檢測的效果。
文檔編號G01N33/569GK101566632SQ20091002289
公開日2009年10月28日 申請日期2009年6月10日 優先權日2009年6月10日
發明者余朝舟, 李建科, 峰 王 申請人:陜西師范大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
