B型尿鈉肽檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明提供一種B型尿鈉肽檢測試劑盒，所述試劑盒基于膠體金免疫比濁法，包括試劑R2，所述試劑R2為含有標記了B型尿鈉肽抗體的金納米顆粒的溶液，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.1nm，所述金納米顆粒和抗體質量比為50：20–60。還本發明還提供該試劑盒的制備方法。本發明試劑盒具有靈敏度高，特異性強，穩定性好的特點，反應后不產生沉淀，便于生化儀的清洗，延長了生化儀的使用壽命。
【專利說明】B型尿鈉肽檢測試劑盒及其制備
【技術領域】
[0001]本申請涉及一種基于膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒及其制備。
【背景技術】
[0002]B型尿鈉肽(BNP)是一種心臟神經激素，在血容量增加和壓力負荷增加時反應性的從心室分泌。血漿BNP是近來研究較多的化學因子，BNP水平的升高可反映左室舒張末壓的升高，收縮功能不全和舒張功能減低引起的心力衰竭均有此改變，對于心力衰竭的診斷有很大的意義。同時，BNP升高的水平與心力衰竭的NYHA分級存在正相關性，LVEF降低的患者，LVEF越低，BNP水平升高的越顯著，對于心力衰竭的進展和近期及長期心性預后有很好的預測價值，BNP水平持續升高，心性事件發生率和心性死亡率升高，預后較差，經治療后BNP降低的患者，預后可能會改善。
[0003]B型尿鈉肽的常用檢測有免疫比濁法和酶聯免疫吸附法等。由于酶聯免疫吸附法檢測耗時且操作復雜，已經不能滿足大型醫院快速定量檢測的要求，免疫比濁法隨著全自動生化儀的普及而普及。但傳統免疫比濁法的檢測靈敏度仍然不能達到臨床要求，于是出現了乳膠顆粒增強免疫比濁法。乳膠增強免疫透射比濁法的基本原理是，首先將抗體吸附在一種膠乳顆粒上，當遇到相應的抗原時，抗原抗體結合而出現乳膠凝集。單個乳膠顆粒的大小在入射波長之內，光線可透過，當兩個以上的乳膠顆粒凝集時，可阻礙光線透過，使得透射光減少，其減少程度與抗原的量成正比。此法提高了檢測的靈敏度和準確度，得到了廣泛的應用。然而，乳膠增強免疫比濁法反應后會產生沉淀，不利于生化儀的清洗，干擾試驗結果，且乳膠制造成本較高，導致免疫比濁試劑盒價格和檢測成本偏高。因此又出現了納米顆粒增強的免疫比濁法，如專利CN101680890便公開了一種通過比濁法測量人抑半骯氨酸蛋白酶蛋白C的比濁免疫測定方法和試劑組合，以及中國專利CN101819208中公開了一種利用微球免疫比濁法檢測腦鈉肽試劑盒。專利CN101680890中具體公開了，表面修飾了抗體的由聚苯乙烯、聚氯乙烯、環氧樹脂、聚偏1，1-二氯乙烯、聚-α-萘基甲基丙稀酸酯、聚乙烯萘以及它們相應的共聚物制成的粒徑在80-105nm的有機高分子膠體納米顆粒。本發明研究表明，許多納米顆粒此范圍之內并不滿足試驗的要求，比如:氧化鐵等磁性納米顆粒在40nm以上時由于順磁性和比重等因素而容易聚沉無法達到應有的穩定性；金納米顆粒在粒徑80-150nm的范圍內穩定性太差而不合適等。根據中國專利CN102749454的教導，本發明以直徑為35nm-60nm的膠體金顆粒進行試驗，發現，靈敏度較差，無法滿足臨床中對靈敏度小于Ing/mL的要求，和最低檢測限5ng/mL的要求，且線性范圍不覆蓋臨床中正常生理和病理情況的濃度區間，因此常常造成假陰性的結果；同時還存在反應時間長(平衡時間5-10min)，無法達到快速檢驗的要求。
【發明內容】
[0004]為了克服現有技術存在的錯誤教導，解決現有技術中存在的上述缺陷，本發明提供一種基于膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒。該試劑盒線性范圍寬、靈敏度高，反應快捷，制造成本低，反應后不產生沉淀，方便生化儀清洗。
[0005]根據本發明的一方面，提供一種基于膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒，該試劑盒包括試劑R2，所述試劑R2為含有標記了 B型尿鈉肽抗體的金納米顆粒的溶液，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.lnm,優選67.2nm-72.4nm ;所述金納米顆粒和抗體質量比在 50:20 - 60，優選 50:40-60ο
[0006]具體來講，所述試劑R2為PH值5.0-9.5，優選6.0-8.5的溶液。
[0007]進一步地，所述試劑R2還含有促凝劑、穩定劑、蔗糖和甘油，其中，促凝劑為重量體積比0.4%以內的PEG20000，穩定劑為重量體積比2%以內的BSA，蔗糖的重量體積比為20%以下，甘油的重量體積比為20%以下。
[0008]作為優選，上述R2為含有粒徑為72.4± 1.5nm且標記了 B型尿鈉肽抗體的金納米顆粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5% BSA和重量體積比5%甘油的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液，其中，金納米顆粒和抗體的重量比為50:40-60。
[0009]更進一步地，所述基于膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒還包括起緩沖和穩定作用的試劑Rl，所述試劑Rl為含有重量體積比0.2 % BSA、重量體積比0.1 %的NaN3和重量體積比0.05% Tween20的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液。在本發明的試劑盒中，發明點主要在試劑R2，試劑Rl也可以使用現有免疫比濁法中檢測試劑盒的試劑R1。
[0010]上述試劑R2通過如下方法制備:
[0011]制備金納米顆粒；
[0012]將抗體偶聯到金納米顆粒，得偶聯抗體的納米金顆粒溶液；
[0013]偶聯抗體的納米金顆粒溶液中加入穩定劑和促凝劑；
[0014]2800rpm 離心 2 小時；
[0015]離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比
0.5%BSA和重量體積比5%甘油，pH值7.2的磷酸鹽緩沖液重懸，調整濃度至OD54tlnm為0.2。
[0016]抗體的活性容易受到蛋白酶的分解、高溫變性、滲透壓等影響，可加入穩定劑來穩定抗體的結構和活性。所述穩定劑可以是蛋白質、PEG、糖和可溶性的堿金屬和堿土金屬的無機鹽中的一種或多種；其中，所述蛋白質優選牛血清白蛋白(BSA)或明膠；所述糖可以是單糖、二糖或者多糖，其中，單糖優選甘露糖、半乳糖和/或葡萄糖；二糖優選乳糖和/或蔗糖；多糖優選海藻糖、葡聚糖、甘露糖和葡萄糖中的一種或多種；所述無機鹽優選齒素堿金屬和堿土金屬的無機鹽，更優選氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣中的一種或多種。
[0017]本發明的試劑盒中，試劑R2還可以加入促凝劑，以增加抗原抗體反應速率。
[0018]本發明所提供試劑盒中R2可以是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和HEPES緩沖液中的一種或多種緩沖液體系；優選磷酸鹽緩沖液體系。
[0019]本發明至少實現了如下有益效果:
[0020]本發明試劑盒具有靈敏度高，特異性強，穩定性好的特點，反應時間短，顯色反應時間小于30s，平衡時間小于2min，可用于檢測血清或血漿中B型尿鈉肽含量，適用于臨床全自動生化分析儀。本發明試劑盒檢測B型尿鈉肽的靈敏度可以達到0.2ng/mL，檢測線性范圍達 0.0 ?16.0ng/mLo
[0021]本發明試劑盒反應后不產生沉淀，便于生化儀的清洗，延長了生化儀的使用壽命。[0022]本發明的試劑盒采用膠體金標記抗體，降低了膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒的制造成本，具有較大的市場競爭力。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1:本發明實施例1-7檢測的標準曲線。
[0024]圖2:本發明實施例9-15檢測的標準曲線。
【具體實施方式】
[0025]以下，將詳細說明本發明的具體實施例，以便本領域技術人員能夠更詳細地理解本發明。
[0026]金納米顆粒以類似膠體狀態存在，又稱膠體金。
[0027]本發明所提供基于膠體金免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒中，試劑Rl可以使用現有技術中免疫比濁法的B型尿鈉肽檢測試劑盒中的試劑R1，即已有的商用品。具體來講，試劑Rl可以是含有0.2% BSA (w/v)作為穩定劑、0.1 % NaN3 (w/v)作為防腐劑和0.05%Tween20(w/v)作為促凝劑的，50mM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2),是一種促使腦鈉肽抗原位點暴露促進抗原抗體反應的緩存液。
[0028]以下各實施例僅制備試劑R2。
[0029]實施例1
[0030]本實施例試劑R2的制備分為三步，首先制備膠體金溶液，然后將抗體偶聯到金納米顆粒上，最后和緩沖鹽、促凝劑和防腐劑等混溶成完整的體系。
[0031]具體過程如下:
[0032]I) 50nm的膠體金的制備按如下步驟:
[0033]在清洗干凈的IOOOml圓底燒瓶中放入磁力攪拌子I枚，加入500ml超純水；
[0034]加入5ml濃度為1% (w/v)氯金酸，600rpm左右高速攪拌，并加熱至溶液沸騰，然后迅速將6ml濃度為1% (w/v)檸檬酸鈉溶液快速加入到燒瓶中，保持加熱和劇烈攪拌lOmin，溶液顏色先變黑色，然后逐漸變紫紅色；
[0035]關閉加熱開關并繼續攪拌lOmin，然后停止攪拌冷卻至室溫，用超純水恢復到原體積 500ml ；
[0036]使用透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒的大小，對1000粒進行統計后直徑約為50.4±1.2nm,超濾除掉小分子后備用。
[0037]2)將抗體偶聯到金納米顆粒上，具體過程如下:
[0038]將待標記的抗體移入透析袋內，在IOmM的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)中透析，以除去抗體溶液中的其他小分子物質；
[0039]透析后的抗體轉移到離心管內，15000rpm離心60min，收集上清；
[0040]在紫外-可見分光度計上測量溶液OD26tol吸收值，計算出溶液中抗體的濃度，并用IOmM磷酸鹽緩沖液將抗體稀釋至lmg/ml(w/v)；
[0041]取10支1.5毫升的離心管，加入I毫升制備好的膠體金溶液；
[0042]用10 %的碳酸鉀溶液將離心管內的膠體金溶液調至pH9 ；
[0043]將l、2、4、8、10、20、40、60、80、100ul的抗體分別加到上述10支離心管中，震蕩30分鐘，此時每支試管中金納米顆粒和抗體的質量比分別為50:1,50:2,50:4,50:8、50:10、50:20,50:40,50:60、50:80、50:100 ；
[0044]向上述溶液中加入IOOul濃度為10%的NaCl溶液，混勻，靜置2h后觀察各管，發現在金納米顆粒和抗體的質量比達到50:100時，有顏色改變和少量的沉淀析出，這表明當比例達50:100時,是標記蛋白的最大需求量,金納米顆粒和抗體的質量比小于50:100無顏色改變和無沉淀析出，；
[0045]根據以上結果，將500ml膠體金溶液加入三角瓶中，邊攪拌邊用10%的碳酸鉀調整溶液的PH值至9 ;
[0046]將小于50ml的抗體加入到上述溶液中，繼續攪拌30分鐘，在此過程中抗體同納米顆粒在庫侖力和范德華力的作用下，突破膠體顆粒表面的水化層實現接觸，在靜電力和范德瓦爾德力的相互作用，膠體顆粒同蛋白質分子實現偶聯；
[0047]3)試劑R2的配制按如下步驟進行:
[0048]在偶聯后的膠體金溶液中加入一定量的BSA作為穩定劑，終濃度為1% (w/v)，攪拌5min使之完全溶解；
[0049]在上述溶液中加入一定量的PEG20000，終濃度為0.2% (w/v)，攪拌10分鐘；
[0050]將上述溶液移至離心管中，用2800rpm離心2h，棄上清，保留沉淀；
[0051]用濃度為20%蔗糖作為穩定劑、0.2% PEG20000作為促凝劑、0.5% BSA作為穩定劑、和5%甘油作為穩定劑的IOmmol的磷酸鹽緩沖液(pH7.2)重懸沉淀物，調整濃度至OD540nm 為 0.2 ;
[0052]得到R2溶液，分裝備用。
[0053]實施例2
[0054]實施例2與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例2制備的膠體金顆粒粒徑為55nm。
[0055]制備55nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.6ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為56.2±1.5nm。
[0056]實施例3
[0057]實施例3與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例3制備的膠體金顆粒粒徑為62.2nm。
[0058]制備62.2nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.4ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為62.2±1.lnm。
[0059]實施例4
[0060]實施例4與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例4制備的膠體金顆粒粒徑為67nm。
[0061]制備67nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.2ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為67.2±1.5nm。
[0062]實施例5
[0063]實施例5與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例5制備的膠體金顆粒粒徑為72nm。
[0064]制備72nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為5.1ml0透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為72.4±1.5nm。
[0065]實施例6
[0066]實施例6與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例6制備的膠體金顆粒粒徑為79nm。
[0067]制備79nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為4.9ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為79.l±1.6nm。
[0068]實施例7
[0069]實施例7與實施例1的差別僅在于，通過調整所加入還原劑的量，使得實施例7制備的膠體金顆粒粒徑為83nm。
[0070]制備83nm顆粒加入還原劑1%檸檬酸鈉為4.7ml。透射電鏡觀察制得的膠體金顆粒，直徑約為83.5±1.6nm。
[0071]實施例8
[0072]基于膠體金免疫比濁的B型尿鈉肽檢測試劑盒的臨床使用效果測定:
[0073](I)本發明試劑盒的測試條件及參數如下
[0074]a)測定步驟:先加入240ul試劑R1，然后加入3ul樣本，37°C孵育5min后加入60ul試劑R2，在540nm波長測量吸光度，三秒后讀取第一點數據，反應5分鐘后讀取另一點，得到吸光度值的差值。
[0075]b)計算方法:6點定標法，以樣條函數為計算模式。根據吸光度與參考血清的值做工作曲線，樣品含量可根據其吸光度值在工作曲線上算出。
[0076](2)檢測標準曲線
[0077]通過本發明的方法，采用日立7180型自動分析儀檢測6種不同含量的B型尿鈉肽參考品，根據結果做標準曲線，X軸表示B型尿鈉肽的含量，Y軸表示吸光度差值。
[0078](3)通過上述的方法對上述實施例中制備的7個試劑盒測定標準曲線，分析最優粒徑。結果如下:
[0079]金納米顆粒大小為50.4nm 時，y = -0.0004x+l.5896，R2 = 0.2993 ；
[0080]金納米顆粒大小為56.2nm 時，y = -0.0029x+l.5936，R2 = 0.5812 ；
[0081]金納米顆粒大小為62.2nm 時，y = -0.0676x+l.5744，R2 = 0.9309 ；
[0082]金納米顆粒大小為67.2nm 時，y = -0.0646x+l.5668，R2 = 0.9729 ；
[0083]金納米顆粒大小為72.4nm 時，y = -0.0698x+l.5942，R2 = 0.9889 ；
[0084]金納米顆粒大小為79.1nm 時，y = -0.066χ+1.4889，R2 = 0.9119 ；
[0085]金納米顆粒大小為83.5nm 時，y = -0.0519x+0.9958，R2 = 0.3743。
[0086](4)對上述結果，進行靈敏度、線性相關系數、線性范圍和穩定性分析。
[0087]靈敏度定義為測試體系對不同濃度的標準樣品測試值的差異，差異越大表明約靈敏，沒有差異則表明體系過于穩定，不能引起比濁改變。靈敏度可以通過擬合后的標準曲線的斜率的絕對值表征。
[0088]線性相關系數即相關性方程的R值，表明試驗測試結果和擬合曲線的重合度，R值越高，表明線性越好。
[0089]線性范圍即測試對應的結果中呈線性關系的區間，線性范圍寬有利于測試更大范圍濃度的樣品。[0090]穩定性是指在該體系中膠體金穩定存在、不發生團聚或沉淀的程度，一般來講顆粒越大越容易聚沉，引起濁度的改變，顆粒越小越穩定，對待測試劑濃度變化不敏感，即靈敏度差。將待測試劑放置在40°C的環境中，以穩定性時間的時間長短來表示穩定性的好壞，測試時間是12月。
[0091]通過上述四個參數的對比，我們可以從中選出最適合的粒徑范圍，將各種金顆粒尺寸條件下的結果匯總于表1。
[0092]表1
[0093]
【權利要求】
1.一種B型尿鈉肽檢測試劑盒，所述試劑盒基于膠體金免疫比濁法，包括試劑R2，所述試劑R2為含有標記了 B型尿鈉肽抗體的金納米顆粒的溶液，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為62.2nm-79.lnm，所述金納米顆粒和抗體質量比為50:20 - 60。
2.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒的粒徑為67.2nm-72.4nm。
3.權利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述金納米顆粒和抗體質量比為50:40-60。
4.權利要求2或3任意一項所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為PH值5.0-9.5的溶液。
5.權利要求4所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為PH值6.0-8.5的溶液。
6.權利要求5所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2還含有促凝劑、穩定劑、蔗糖和甘油，其中，所述穩定劑為蛋白質、PEG、糖和可溶性的堿金屬和堿土金屬的無機鹽中的一種或多種；所述蛋白質為牛血清白蛋白或明膠；所述糖為單糖、二糖或者多糖；所述無機鹽為鹵素堿金屬和堿土金屬的無機鹽；試劑R2為是磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液和HEPES緩沖液中的一種或多種的組合。
7.權利要求6所述試劑盒，其特征在于，所述促凝劑為重量體積比0.4%以內的PEG20000,所述穩定劑為重量體積比2%以內的牛血清白蛋白，所述蔗糖的重量體積比為20 %以下，所述甘油的重量體積比為20 %以下。
8.權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑R2為含有粒徑為72.4± 1.5nm且標記了 B型尿鈉肽抗體的金納米顆粒、重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5% BSA和重量體積比5%甘油，pH7.2的磷酸鹽緩沖液，其中，金納米顆粒和抗體的重量比為50:40-60。
9.權利要求7所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括試劑R1，所述試劑Rl為含有重量體積比0.2 % BSA、重量體積比0.1 %的NaN3和重量體積比0.05 % Tween20的，pH7.2的磷酸鹽緩沖液。
10.制備權利要求1-9任意一項所述試劑盒的方法，其特征在于，所述方法包括: 制備金納米顆粒； 將抗體偶聯到金納米顆粒，得偶聯抗體的納米金顆粒溶液； 偶聯抗體的納米金顆粒溶液中加入穩定劑和促凝劑； 2800rpm離心2小時； 離心沉淀用含重量體積比20%蔗糖、重量體積比0.2% PEG20000、重量體積比0.5%BSA和重量體積比5%甘油，pH值7.2的磷酸鹽緩沖液重懸，調整濃度至OD54tol為0.2。
【文檔編號】G01N33/531GK103995137SQ201410193223
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】侯淑霞, 王萬霞 申請人:北京玖佳宜科技有限公司
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
