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中藥肝炎靈注射液及其原料藥材的指紋圖譜檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了中藥肝炎靈注射液及其原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，該方法包括供試品溶液的制備、對照指紋圖譜的建立和供試液指紋圖譜的測定。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的流動相組成，檢測波長、色譜柱，柱溫等分析條件，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，本發(fā)明提供的中藥肝炎靈注射液及其原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，可以全面、客觀、準(zhǔn)確的檢測和評價肝炎靈注射液的質(zhì)量，可以為肝炎靈注射液從源頭上保證原料藥材的安全，有效，為保證臨床療效具有重要意義。
【專利說明】檢測和評價肝炎靈注射液質(zhì)量的指紋圖譜
匕術(shù)的不足，提供一種肝炎靈注射液及其原筆觀、全面、準(zhǔn)確的評價肝炎靈注射液的質(zhì)量和保證臨床療效具有重要意義。
曼明采取的技術(shù)方案為:
&，包括以下步驟:
I稀釋后，用微孔濾膜濾過，得到供試品溶
的對照指紋圖譜:取10批以上肝炎靈注射(肝炎靈注射液的指紋圖譜，以這些指紋圖肝炎靈注射液對照指紋圖譜；
I紋圖譜:取步驟(1)肝炎靈注射液供試品品溶液的指紋圖譜；:圖譜和步驟(2)得到的對照指紋圖譜用相相:體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃，柱溫30°C，檢測波長為205nm。
[0014]本發(fā)明提供的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，包括以下步驟:
[0015](I)供試品溶液制備:取山豆根藥材進(jìn)行適當(dāng)處理，得到供試品溶液；
[0016](2)高效液相色譜法測定山豆根藥材的對照指紋圖譜:取10批以上山豆根藥材供試品在適當(dāng)?shù)纳V條件下進(jìn)樣，測得各批次山豆根藥材的指紋圖譜，以這些指紋圖譜為基礎(chǔ)，用相似度軟件計(jì)算獲得共有模式作為山豆根藥材對照指紋圖譜；
[0017](3)高效液相色譜法測定供試品溶液指紋圖譜:將待測山豆根藥材供試品溶液按步驟(4)相同的色譜條件進(jìn)樣，測得供試品溶液的指紋圖譜；
[0018](4)將步驟(3)得到的供試品溶液指紋圖譜和步驟(2)得到的對照指紋圖譜用相似度軟件評價。
[0019]以上所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，步驟(1)所述的供試品溶液制備方法為:取山豆根藥材粉末(過三號篩)0.5g，置圓底燒瓶中，精密加水50ml，稱定重量，置電熱套中加熱煮沸4小時，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，用濾紙濾過后，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，即得。
[0020]以上所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，步驟(2)和步驟(3)所述的色譜條件為:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃為流動相，柱溫30~40°C，檢測波長為200~220nm。
[0021]作為優(yōu)選方案，以上所述的`中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢
測方法，步驟(2 )和步驟(3 )所述的色譜條件為:以規(guī)格為5 μ m，SUPELCO Discovcry^
25cmX4.6mm為色譜柱，以體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃為流動相，柱溫30°C，檢測波長為205nm。
[0022]本發(fā)明所述的中藥肝炎靈注射液指紋圖譜檢測方法在評價肝炎靈注射液成品質(zhì)量中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材指紋圖譜檢測方法在評價肝炎靈注射液原料藥材質(zhì)量中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明將供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜經(jīng)計(jì)算機(jī)相似度評價軟件(選用中國藥典委推薦的“中藥指紋圖譜計(jì)算機(jī)輔助相似度評價軟件2004A版”)計(jì)算，獲得指紋圖譜相似度數(shù)值，依據(jù)相似度數(shù)值，應(yīng)用于肝炎靈注射液的質(zhì)量控制，以指紋圖譜相似度應(yīng)大于
0.90為檢驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；應(yīng)用于肝炎靈注射液原料藥材山豆根的質(zhì)量控制，以指紋圖譜相似度應(yīng)大于0.85為檢驗(yàn)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明提供的肝炎靈注射液及其原料藥材的指紋圖譜檢測方法用于生產(chǎn)檢驗(yàn)質(zhì)量控制，所得產(chǎn)品具有較高的質(zhì)量穩(wěn)定性，可確保產(chǎn)品安全有效。
[0025]采用本發(fā)明優(yōu)選方案提供的中藥肝炎靈注射液指紋圖譜檢測方法檢測出有4個共有峰，以3號峰為標(biāo)記，有明顯的吸收峰，為苦參堿化合物，可作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。
[0026]采用本發(fā)明優(yōu)選方案提供的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根指紋圖譜檢測方法檢測出有5個共有峰，以3號峰為標(biāo)記，有明顯的吸收峰，為苦參堿化合物，可作為標(biāo)準(zhǔn)參照物。
[0027]本發(fā)明提供的肝炎靈注射液原料藥材的指紋圖譜檢測方法，選擇與肝炎靈注射液指紋圖譜測定方法相同的檢測條件進(jìn)行藥材指紋圖譜考察，便于更好的考察藥材指紋圖譜與制劑指紋圖譜的相關(guān)性，也有利于比較各藥材產(chǎn)地的差異，為保證肝炎靈注射液的安全穩(wěn)定的原料藥材來源提供保證。
[0028]本發(fā)明提供的肝炎靈注射液及其原料藥材指紋圖譜檢測方法的最佳條件篩選過程:
[0029]1、儀器與試劑
[0030]儀器:AgilentllOO液相色譜儀。
[0031]試劑:乙腈、四氫呋喃，色譜純；其他試劑均為分析純。
[0032]對照品:苦參堿、氧化苦參堿，由中國藥品生物制品檢定所提供。
[0033]2、流動相種類的篩選
[0034]①乙腈-無水乙醇-水(80:10:10，磷酸調(diào)ρΗ2.0)；
[0035]②乙腈-0.2mol/L 磷酸二氫鈉(23:77)；
[0036]③甲醇-水-三乙胺(50:50:0.05);
[0037]④甲醇-水-三乙胺(50:50:0.2);
[0038]⑤乙腈-0.0257mol/L 硫酸銨-SDS (40:60:0.6)硫酸調(diào) ρΗ3.0
[0039]⑥0.2%十二烷基硫酸鈉(10%磷酸調(diào)ρΗ3.0)-四氫呋喃(4:1)
[0040]采用上述流動相進(jìn)行測定，其中①、②、③需在氨基柱上進(jìn)行測定，雖可取得較好的分離效果，但保留時間不穩(wěn)定，經(jīng)軟件計(jì)算，相似度結(jié)果不理想、⑤的流動相為文獻(xiàn)報道測定苦參堿含量的方法，經(jīng)試驗(yàn)，分離效果不理想，不能將山豆根中的生物堿類成分分離完全，影響監(jiān)測的準(zhǔn)確性，并不適合用于建立指紋圖譜。因此，本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)反復(fù)摸索流動相組成，最終確定⑥0.2%十二烷基硫酸鈉(10%磷酸調(diào)ρΗ3.0)-四氫呋喃(4:1)為流動相，采用該流動相組成，各色譜峰分離很好，保留時間適宜，達(dá)到指紋圖譜信息最大化原則，且重現(xiàn)性合穩(wěn)定性優(yōu)。
[0041]3、檢測波長的選擇
[0042]苦參堿對照品溶液在200?400nm波長范圍內(nèi)無明顯吸收峰，經(jīng)對比實(shí)驗(yàn)表明，在205?220nm處，尤其是在205nm處，肝炎靈注射液各成分具有明顯的吸收峰，因此，本發(fā)明優(yōu)選205nm作為測定波長，可得到理想的色譜圖。
[0043]4、柱溫的選擇
[0044]本發(fā)明分別在25°C、30°C、35°C和40°C柱溫下分析肝炎靈注射液，對比各柱溫下的色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在30-40°C柱溫條件下，色譜峰能夠分離，在30°C柱溫條件下，色譜峰分離情況最好，柱壓也較低，因此，將30°C為最佳柱溫條件。
[0045]5、色譜柱的選擇
[0046]本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)篩選了不同的色譜柱，采用以下型號的色譜柱進(jìn)行測定:
[0047]①氨基柱:1nertsilNH25u250mmX4.6mmCat #:22871SN:3K150166
[0048]②Alltech C18 柱，5 μ m，4.6mmX 250mm
[0049]③SUPELCO Discovery 6: 25cmX 4.6mm，5 μ m，Col: 50497154938-02
[0050]④CAPCELL PAK C18M.G5u250mmX4.6mmCat.No:90104Col.N0.03169
[0051 ]⑤ Agilent Z0RBAX*80A Extend — C184.6X250mm5uPN:770450-902SN:USHR003183[0052]⑥SUPELCO Discovcry ^ 25cmX 4.6mm, 5 μ m, Col: 50497163280-05
[0053]⑦SUPELCO Discovery?: 25cmX4.6mm，5 μ m，Col: 50497163486-01
[0054]因本品有效成分為生物堿類成分，文獻(xiàn)報道可采用氨基柱測定其含量。經(jīng)實(shí)驗(yàn)，氨基柱雖然可取得較好的分離效果，但保留時間不穩(wěn)定，造成指紋圖譜相似度不理想，因此不能建立良好的指紋圖譜來檢測肝炎靈注射液及其原料藥材的質(zhì)量。本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)篩選，確定采用C18柱進(jìn)行分離。共考察了四種不同廠家的6根C18色譜柱的分離效果，除其中②、④的分離效果不理想外，另四根色譜柱均可將樣品達(dá)到基線分離。經(jīng)色譜圖比較，優(yōu)選
米用SUPELCO Discovcry pl 25cmX4.6mm, 5 μ m柱作為本品指紋圖譜的分析柱,各色譜峰分離
良好，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，可以建立穩(wěn)定的指紋圖譜。
[0055]6、指紋圖譜的精密度與穩(wěn)定性考察
[0056]取同一肝炎靈注射液供試品溶液，在24小時內(nèi)進(jìn)樣6次，以第一次分析所得指紋圖譜為對照，其余5次分析所得指紋圖譜的相似度計(jì)算結(jié)果分別為:1.000、1.000,0.999、
1.000、1.000、1.000，采用以上優(yōu)選的色譜條件分析，制備得到的指紋圖譜的精密度與穩(wěn)定性優(yōu)。
[0057]7、重現(xiàn)性考察
[0058]取同一批肝炎靈注射液6支，采用以上優(yōu)選的色譜條件分析，以其中一次分析所得指紋圖譜為對照，則其它5次分析所得指紋圖譜與其相似度分別為:0.992,0.996，0.993，0.997，0.995 ;表明采用本發(fā)明優(yōu)選得到的色譜條件的指紋圖譜分析方法，具有良好的重現(xiàn)性。
[0059]經(jīng)過上述大量實(shí)驗(yàn)篩選，本發(fā)明優(yōu)選得到的最佳色譜條件為:以規(guī)格為5 μ m,SUPELCO Discovcry R 25cmX4.6mm為色譜柱，以體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃為流動相，柱溫30°C，檢測波長為205nm。
[0060]有益效果:本發(fā)明提供的中藥肝炎靈注射液及其原料藥材的指紋圖譜檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0061]1、本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)檢測方法的諸多不足，通過大量實(shí)驗(yàn)篩選出最佳的流動相組成，檢測波長、色譜柱，柱溫等分析條件，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明，本發(fā)明提供的檢測方法，可建立良好的指紋圖譜。采用本發(fā)明提供的中藥肝炎靈注射液指紋圖譜檢測方法，可以同時檢測中藥肝炎靈注射液中的多種活性成分，從而可以全面、客觀、準(zhǔn)確的檢測和評價肝炎靈注射液的質(zhì)量，為保證臨床療效具有重要意義。
[0062]2、本發(fā)明提供的山豆根指紋圖譜檢測方法，能夠準(zhǔn)確測定和評價山豆根藥材的質(zhì)量，為肝炎靈注射液從源頭上保證原料藥材的安全，有效，把好質(zhì)量關(guān)具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】 [0063]圖1為肝炎靈注射液對照指紋圖譜。
[0064]圖2為肝炎靈注射液供試品指紋圖譜。
[0065]圖3為山豆根藥材對照指紋圖譜。
[0066]圖4為山豆根藥材供試品指紋圖譜。【具體實(shí)施方式】
[0067]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán)利要求所限定的范圍。
[0068]實(shí)施例1肝炎靈注射液對照指紋圖譜的建立及應(yīng)用
[0069]1、中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，包括以下步驟:
[0070](I)供試品溶液制備方法:精密量取肝炎靈注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μ m)濾過，即得。
[0071](2)高效液相色譜法測定肝炎靈注射液的對照指紋圖譜:取13批肝炎靈注射液供試品按下列色譜條件測得各批次肝炎靈注射液的指紋圖譜，以這些指紋圖譜為基礎(chǔ)，用相似度軟件計(jì)算獲得共有模式作為肝炎靈注射液對照指紋圖譜。指紋圖譜中共檢測到4個共有指紋峰，具體保留時間(min)分別為I號峰:16.74min、2號峰:28.3min、3號峰:29.9min、4號峰:32.9min。對照指紋圖譜如圖1所示。
[0072]色譜條件為:以規(guī)格為5 μ m, SUPELCO Discovcry 25cmX 4.6mm為色譜柱，以體積
比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃為流動相，柱溫30°C，檢測波長為205nm。
[0073](3)高效液相色譜法測定供試品溶液指紋圖譜:取13批按步驟(1)所得的肝炎靈注射液供試品溶液按步驟(2)相同的色譜條件進(jìn)樣，測得供試品溶液的指紋圖譜，如圖2所
/Jn ο
[0074](4)將步驟(3)得到的供試`品溶液指紋圖譜和步驟(2)得到的對照指紋圖譜用相似度軟件評價。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示:
[0075]表1肝炎靈注射液樣品及相似度評價結(jié)果
[0076]
【權(quán)利要求】
1.中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)供試品溶液制備:將肝炎靈注射液稀釋后，用微孔濾膜濾過，得到供試品溶液； (2)高效液相色譜法測定肝炎靈注射液的對照指紋圖譜:取10批以上肝炎靈注射液供試品在適當(dāng)?shù)纳V條件下進(jìn)樣，測得各批次肝炎靈注射液的指紋圖譜，以這些指紋圖譜為基礎(chǔ)，用相似度軟件計(jì)算獲得共有模式作為肝炎靈注射液對照指紋圖譜； (3)高效液相色譜法測定供試品溶液指紋圖譜:取步驟(1)肝炎靈注射液供試品溶液按步驟(2)相同的色譜條件進(jìn)樣，測得供試品溶液的指紋圖譜； (4)將步驟(3)得到的供試品溶液指紋圖譜和步驟(2)得到的對照指紋圖譜用相似度軟件評價。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(4)中用相似度軟件評價4個共有指紋峰，具體保留時間分別為I號峰:16.74min、2號峰:28.3min、3 號峰:29.9min、4 號峰:32.9min,且相似度大于 0.9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(I)中供試品溶液制備方法為:精密量取肝炎靈注射液I~2ml，置50~100ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m的微孔濾膜濾過，即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(1)中供試品溶液制備方法為:精密量取肝炎靈注射液1ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μ m的微孔濾膜濾過，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(2)中色譜條件為:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相:體積比為4:1的0.2%~01%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃，柱溫為30~40°C，檢測波長為200~220nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的中藥肝炎靈注射液的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(2)中色譜條件為:以規(guī)格為5μηι,SUPELCO Discovcryfi 25cmX4.6mm為色譜柱,流動相:體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃，柱溫30°C，檢測波長為205nm。
7.中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)供試品溶液制備:取山豆根藥材進(jìn)行適當(dāng)處理，得到供試品溶液； (2)高效液相色譜法測定山豆根藥材的對照指紋圖譜:取10批以上山豆根藥材供試品在適當(dāng)?shù)纳V條件下進(jìn)樣，測得各批次山豆根藥材的指紋圖譜，以這些指紋圖譜為基礎(chǔ)，用相似度軟件計(jì)算獲得共有模式作為山豆根藥材對照指紋圖譜； (3)高效液相色譜法測定供試品溶液指紋圖譜:取步驟(1)山豆根藥材供試品溶液按步驟(2)相同的色譜條件進(jìn)樣，測得供試品溶液的指紋圖譜； (4)將步驟(3)得到的供試品溶液指紋圖譜和步驟(2)得到的對照指紋圖譜用相似度軟件評價。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(1)中供試品溶液制備方法為:取山豆根藥材粉末0.5~lg，置圓底燒瓶中，精密加水50~100ml，稱定重量，置電熱套中加熱煮沸I~4小時，放冷，用水補(bǔ)足減失的重量，用濾紙濾過后，再用0.45 μ m微孔濾膜濾過，即得。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(2)中色譜條件為:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，流動相:體積比為4:1的0.2~1%%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃，柱溫30~40°C，檢測波長為200~220nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的中藥肝炎靈注射液原料藥材山豆根的指紋圖譜檢測方法，其特征在于，步驟(2)中色譜條件為:以規(guī)格為5 μ m，SUPELCO Discovery; 25cmX4.6mm為色譜柱，流動相:體積比為4:1的0.2%十二烷基硫酸鈉:四氫呋喃，柱溫30°C，檢測波長為205nmo
【文檔編號】G01N30/02GK103837619SQ201410104187
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月20日
【發(fā)明者】顧治平, 王恒斌, 陳力建 申請人:常熟雷允上制藥有限公司