一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條的制作方法
【專利摘要】一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，涉及一種生產食用菌檢測的改進，其特征是：在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體包被在檢測線上，在質控線和檢測線外表包被有NC膜。有益效果是：具有檢測周期短（1小時內出結果）；操作簡便，不需要專業人員及儀器設備檢測；成本低（每個檢樣花費需要幾元至十幾元）；定性檢測結果準確。本方法可解決羊肚菌人工栽培中菌種是否是羊肚菌菌種，以及栽培后培養料中生長的菌絲是否是羊肚菌菌絲的監測，可以減少損失。
【專利說明】
一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條
【技術領域】
[0001]本發明屬于生化【技術領域】，涉及一種生產食用菌檢測的改進。
【背景技術】
[0002]羊肚菌是一種珍稀的食用菌，其以美味著稱。近年來的研究還發現其具有豐富的保健價值。由于人工栽培技術還不成熟，產品基本靠野生資源的采集，價格居高不下。實現羊肚菌的人工栽培具有巨大的商業價值。我們知道，在羊肚菌人工栽培時，如果栽培的菌種不是羊肚菌或是在栽培過程中培養基被雜菌污染，這種情況是栽培不出羊肚菌的。在羊肚菌的人工栽培實踐過程中，從菌種培養到子實體(菇體)的採收大約需要4至6個月時間，一般情況下，只有出菇才能證明接種的菌種是羊肚菌菌種，這也是傳統的形態學檢定方法，這種鑒定方法的好處是直接、客觀；最大的缺陷是周期過長，而且由于羊肚菌栽培、出菇受多種因素影響而不易出菇，這種方法羊對肚菌的人工栽培過程的早期及期中檢測上受到限制。另外一種檢定羊肚菌的方法是在實驗室條件下的提取羊肚菌的DNA，通過核酸序列檢測比對來鑒定，該方法的優勢是精準，缺點是需要專業的檢測實驗室，檢測周期長(數天)，費用昂貴。
[0003]參考文獻:
(1)孟盟，曹池，陳漢忠，等.水牛伊氏錐蟲病免疫膠體金試紙條的研制及初步應用[J].畜牧獸醫學報，2011，42 (7):988-933.(2)王一東，劉建.一株抗羊肚菌單克隆抗體及其制備方法:中國，200910218152.8[P],2010-06-09.(3)馬帥，陳華林，王雅文，等.免疫酶染色法對羊肚菌菌絲特異性靶位的初步定位與分析[J].菌物研究，2014，12 (2):115-118.
【發明內容】
[0004]本發明的目的是:提供一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，它可簡便、快捷、準確地檢測羊肚菌。
[0005]本發明的技術方案是:在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體包被在檢測線上，在質控線和檢測線外表包被有NC膜。
[0006]山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀釋包被質控線。
[0007]將濃度為4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體用PBS緩沖液做1、2、3、4、5和6倍稀釋包被檢測線。
[0008]本發明的制備方法是:
(I)膠體金標記抗羊肚菌抗體(單克隆抗體、多克隆抗體)的制備經硫酸銨沉淀法純化的單克隆抗體(C6A8細胞株)及兔多克隆抗體的蛋白濃度分別為2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。C6A8單抗的效價為1: 1280，兔血清的效價:1:2560。膠體金溶液pH在8.5左右，C6A8單抗加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時，可以將膠體金較好的標記在抗羊肚菌單克隆抗體C6A8上。將膠體金標記的抗羊肚菌抗體或噴涂或浸泡金標墊，將金標墊37°C lh，烘干，備用。
(2)質控線抗體與檢測線抗體包被濃度
檢測線包被抗體(使用的是純化的兔抗羊肚菌多抗)蛋白濃度為:62.lug/ml,質控線包被抗體(山羊抗鼠IgG (H+L))蛋白濃度為:6.4ug/ml。將上述試劑用噴或涂或點樣的方式包被到硝酸纖維素膜(NC膜)對應位置上，37°C lh，烘干。將包被好的硝酸纖維膜浸泡于1%的牛血清白蛋白(BSA)中封閉，37°C lh，烘干。備用。
(3)試紙條的裝配及試紙條檢驗結果判定。
[0009]如圖1所示，依次將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙貼于塑料襯板上，切成
0.4cm寬的長條；
吸取適量經過研磨處理的待檢樣品，滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向前移行，在移行過程中NC膜上會出現肉眼町見的紅色條帶，于加樣后10 min觀察結果，T線和C線都顯色.結果為陽性；C線顯色，T線不顯色，結果為陰性；若C線不顯色，則試紙條無效。
[0010]本發明的有益效果是:具有檢測周期短(I小時內出結果)；操作簡便，不需要專業人員及儀器設備檢測；成本低(每個檢樣花費需要幾元至十幾元);定性檢測結果準確。本方法可解決羊肚菌人工栽培中菌種是否是羊肚菌菌種，以及栽培后培養料中生長的菌絲是否是羊肚菌菌絲的監測，可以減少損失。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1是本發明結構圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結合附圖對本發明作進一步描述:
實施例1
如圖所示，I是VC底板P、2是樣品墊、3是膠體金墊、4是NC膜、5是吸水濾紙、6是質控線、7是檢測線。
[0013]羊肚囷囷種，編號:51589，購于中國農業微生物囷種保減中心；
鼠源抗羊肚菌單克隆抗體(C6A8雜交瘤細胞株)、/兔源抗羊肚菌多克隆抗體，及由長春理工大學生命科學技術學院生物工程系實驗室制備，抗羊肚菌單抗雜交瘤細胞株現保存于該實驗室；
膠體金溶液，上海金標生物科技有限公司；
金標墊、樣品墊、吸水紙、硝酸纖維(NC)膜，上海金標生物科技有限公司；
牛血清白蛋白(BSA)，sigma公司分裝；
HRP標記山羊抗鼠IgG (H+L)，HRP標記山羊抗兔IgG (H+L)購于北京中杉金橋生物技術有限責任公司； pH試紙，上海華美公司；
實驗所需的主要儀器、設備=Mill1-Q超純水系統制備，磁力攪拌器，恒溫培養箱，冷凍離心機，酶標儀，等。
[0014]I 方法
1.1試劑配制及玻璃器皿的處理
(1)0.1%碳酸鉀溶液:準確稱取0.1 g碳酸鉀+超純水100 ml配制成溶液；
(2)PBS緩沖液(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液):準確稱取氯化鈉8 g，氯化鉀0.2 g，磷酸二氫鉀0.2 g，磷酸氫二鈉2.9 g，加蒸餾水定容至1000 ml;
(3)包被抗原稀釋液；0.01 mol/L PBS pH7.4;
(4)重懸液(含1%BSA的PB液):將0.2 mol/L的磷酸二氫鈉0.53 ml和0.2mol/L的磷酸氫二鈉9.47mL,混合后加入BSA至終濃度為1%。
所用玻璃器皿先用清潔劑清洗干凈，然后用鹽酸洗液浸泡24 h，再用蒸餾水浸泡24h、最后蒸餾水、雙蒸水洗3?4次，烘干后備用[1]。
1.2單克隆抗體的純化及效價和蛋白濃度的測定
用硫酸銨沉淀法[2]分別純化抗羊肚菌的單克隆抗體C6A8、以及多克隆抗體。純化后的抗體分別用ELISA方法測定其效價，將抗體稀釋20、40、80......5120倍分別加入1_9孔，
1Ul孔SP2/0作為陰性對照。考馬斯亮藍法測其蛋白濃度。
1.3膠體金標記最適pH的確定
用0.lmol/L的碳酸鉀和0.lmol/L的鹽酸將膠體金溶液調至不同的梯度，取pH為7、
8、8.5、9、10的膠體金溶液各10ul，分別加入Iul濃度為1.14 mg/mL的純化好的抗體，混合均勻，室溫下放置15 min,分別加入2ul濃度為10%的NaCl溶液，混合均勻，室溫下放置3h。不適合的pH值組溶液顏色由紅色變為藍色，甚至變黑、無色，觀察顏色變化最小的組為穩定組，該pH值為最適標記酸堿度。
1.4膠體金標記最適蛋白濃度的確定
用0.lmol/L的碳酸鉀和0.lmol/L的鹽酸溶液將膠體金溶液調節到最適pH，在每10ul膠體金溶液中分別加入1.2,0.9,0.6,0.3,0.1,0.05ul單抗，室溫作用5 min，分別加入10%的NaCl溶液5ul，混勻后靜置3h[4]。觀察顏色變化較小的小組，記錄加入單克隆抗體的量，該蛋白兩即為最適標記濃度。
1.5膠體金標記抗體的制備及檢測
取10uL膠體金溶液，勻速攪拌作用下，加入適量0.lmol/L的碳酸鉀，調節膠體金溶液至最適pH,將單抗溶液逐滴加入膠體金溶液中，大約5 min加完,勻
速攪拌30 min ;室溫放置15 min，逐滴加入10% BSA至終濃度為1%，將標記的膠體金溶液以3 000r/min離心20 min,棄去沉淀。12 000 r/min離心60 min,吸棄上清液；用含I %牛血清白蛋白的PB液充分溶解沉淀。4°C保存備用[5]。
為了檢測單克隆抗體是否與膠體金結合上，我們采用直接法，即將有陽性的抗原和山羊抗鼠IgG (二抗)分別包被于硝酸纖維膜上后浸泡于標記抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后去硝酸纖維膜并觀察其顯色結果。
1.6質控線抗體與檢測線抗體包被濃度的確定
將實驗室已有的山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液做1/100、1/200、1/500、1/1000和1/2000稀釋包被質控線。浸泡于標記抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后觀察其顯色情況，選擇適合濃度包被NC膜。
確定二抗包被濃度后，將濃度為4.22 ug/ul的抗羊肚菌兔血清多克隆抗體用PBS緩沖液做1、2、3、4、5和6倍稀釋包被檢測線，組裝試紙條，做陽性和陰性樣品檢測，觀察顯色情況，選擇最佳濃度的抗體包被NC膜。
1.7檢測線與質控線的封閉
用最適檢測線與質控線包被濃度包被于硝酸纖維膜后，將包被好的硝酸纖維膜浸泡于1%的牛血清白蛋白中封閉，放置于37度恒溫箱中，一小時后取出，烘干。
1.8試紙條的裝配
依次將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙貼于塑料襯板上，切成0.4cm
寬的長條；在硝酸纖維素膜的指定位置用一定濃度的山羊抗鼠IgG(質控線)和兔血清多克隆抗體(檢測線)點樣包被。
1.9試紙條檢驗結果判定
吸取適量待檢樣品滴加到試紙條的樣品墊上，可見樣品通過層析作用向前移行，在移行過程中NC膜上會出現肉眼町見的紅色條帶，于加樣后10 min觀察結果，T線和C線都顯色.結果為陽性；C線顯色，T線不顯色，結果為陰性；若C線不顯色，則試紙條無效。
[0015]2實驗結果
2.1純化后單抗和多抗效價及蛋白濃度的測定
純化后的抗羊肚菌單克隆抗體W8C9、C6A8及多克隆抗體兔血清用ELISA間接法測得W8C9的效價為320，C6A8的效價為1280，兔血清的效價為2560。
用考馬斯亮藍法牛血清白蛋白做標準曲線，測得單克隆抗體W8C9、C6A8及多克隆抗體兔血清蛋白濃度分別為:2.28 ug/ul,2.91 ug/ul,4.22 ug/ul。
由于純化后C6A8的效價還是高于W8C9的效價，所以本實驗選用C6A8單克隆抗體標記膠體金。
2.2膠體金的最適標記條件
經觀察比較，膠體金溶液pH=8.0時，其顏色變化最小，所以確定膠體金標記最適pH為
8.0。實驗結果表明，將抗體加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時效果最佳，所以本實驗選用0.58 ug/ml為最佳抗體標記濃度。
2.3 I父體金標記的結果
包被有陽性抗原的硝酸纖維膜浸泡于標記了抗體的膠體金溶液中后，觀察到包被抗原的地方有明顯的紅色出現，說明單克隆抗體已經于抗體結合上。
2.4最適質控線包被濃度的確定
經過實驗確定質控線山羊抗鼠二抗1/500稀釋時實驗效果最佳。
2.5特異性結果
我們將上述以建立的ELISA夾心法檢測到的十種不同的陽性菌絲抗原樣本包被于硝酸纖維膜(檢測線)，山羊抗鼠IgG (二抗)作為質控線包被，然后浸泡于標有抗體的膠體金溶液中，二十分鐘后觀察，結果如下表:
表2-1膠體金法特異性實驗編號 12 3 4 5 6 7 8 9 10 樣品 4 "22 5—1 4 --4 3~1 3~2 4—3 5*?2 3?.3 5?~5 5-3 結果 + + ++++ + + ++
注:1.樣品為不同種及同種的不同培養(液體)批次的羊肚菌菌絲處理液。
2.樣品的處理方法是，去適量菌絲，加入適量無菌海沙，在研缽中研磨20分鐘，上清液既是。
[0016]可見，用雙抗體ELISA夾心法能檢測出來的羊肚菌菌絲抗原樣本用膠體金法也能檢測其陽性，即膠體金免疫層析法與雙抗體ELISA夾心法檢測結果相符合。
[0017]而采用該法檢測不同濃度的木耳、金針菇、金頂側耳、香菇、平菇、滑子蘑、雙孢菇的食用菌菌絲處理液時，其結果與陰性對照值相同，表明該方法對羊肚菌菌絲抗原的檢測具有良好的特異性。
[0018]3試紙條使用方法
3.1檢樣的處理:取適量(Ig左右)的含有疑似羊肚菌菌絲的菌種或含有疑似羊肚菌菌絲的培養料樣本(可以混有培養基)，加入2g左右的無菌海沙和適量的純凈水(可以用干凈的市售礦泉水)，在研缽內研磨1020分鐘，靜置5分鐘，液體的上部較清澈的部分即可作為檢樣。
3.2檢測:將檢樣滴入試紙條的樣品墊上I至2滴(或是組裝的試紙條的樣品孔中)，室溫下靜置20分鐘，觀察檢測結果。
3.3結果的判斷:
如果檢測線(離加樣點近的)和質控線(離加樣點遠的)都出現紅色條線，判定樣品為陽性，既樣品中含有羊肚菌；
如果只有質控線出現紅色條線，判定樣品為陰性，既樣品中不含有羊肚菌；
如果檢測線與質控線均不出現或是只有檢測線出現紅色條線，判定為試紙條失效。
【權利要求】
1.一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:在塑料襯板上依次貼附有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水紙，將膠體金標記的抗羊肚菌抗體噴涂或浸泡金標墊上，將用PBS緩沖液稀釋的山羊抗鼠IgG包被在質控線上，將用PBS緩沖液稀釋的抗羊肚菌兔多克隆抗體也包被在檢測線上，將包被有質控線和檢測線的NC膜經含有1%的牛血清白蛋白的PBS緩沖液中封閉。
2.如權利要求1所述的一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條,其特征是:膠體金溶液PH在8.08.5，抗羊肚菌單克隆抗體C6A8加入膠體金溶液中使其終濃度為0.58 ug/ml時，將膠體金標記在抗羊肚菌單克隆抗體C6A8上。
3.如權利要求1所述的一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:山羊抗鼠IgG用PBS緩沖液稀釋成蛋白濃度為6.4ug/ml包被質控線。
4.如權利要求1所述的一種檢測羊肚菌菌絲的膠體金免疫試紙條，其特征是:將用PBS緩沖液稀釋成蛋白濃度為62.lug/ml的抗羊肚菌兔多克隆抗體包被檢測線。
【文檔編號】G01N33/558GK104165989SQ201410327203
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】王一東, 張強 申請人:長春理工大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
