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專利名稱：一種檢測ⅱ型志賀毒素的elisa試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種ELISA試劑盒，具體而言涉及檢測II型志賀毒素(StxII)的ELISA試劑盒，還涉及該ELISA試劑盒中單克隆抗體S2D8和S2C6的制備和試劑盒的使用方法。
背景技術：
腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)感染是一種重要的人畜共患病，在世界各地包括發達及發展中國家都有流行，其感染具有暴發性、強烈的致病性與致死性等特點，已成為全球性的公共衛生問題，對人類健康構成巨大威脅。EHEC感染可使人患腹灣(Diarrhea)、出血性結腸炎(Hemorrhagic Colitis, HC),還可引發溶血性尿毒綜合征(Hemolytic Uremic Syndrome, HUS)、血栓性血小板減少性紫癒(ThromboricThromobocytopenic Porpura, TTP)等嚴重并發癥,特別是HUS可對患者腎臟造成不可恢復性的功能損傷，病死率較高。我國江蘇、安徽及河南三省交界部分地區于1999-2000年多次暴發了 EHEC0157:H7感染性腹瀉病并發急性腎衰，先后共有230例患者發展成HUS，死亡205人，恢復者也造成了腎臟、神經系統功能損傷等后遺癥。另外我國西部、中原、東北、華北也多次散在發生過EHEC疫情，且每年均有流行的報道。美國2006年夏季也發生了由于食用污染的菠菜而導致EHEC 0157:H7感染事件，先后波及26個州，共有183人發病，29人引發HUS，3人死亡，引起世界廣泛關注。目前對EHEC感染臨床上缺乏有效的治療和預防措施，臨床研究表明:抗生素可 促使EHEC釋放致死性志賀毒素，從而使患者并發HUS的危險性增加。研究表明，EHEC感染的主要致病機理可分為兩個方面，一是由菌體基因組毒力島LEE(Locus of Enterocyte Effacement)編碼的多種致病因子所介導的粘附抹平機制(Attaching and Effacing, A/E),通過A/E機制,細菌可破壞腸上皮細胞,粘附并定植于腸道；二是分泌志賀毒素(Shiga toxin, Stx), Stx可以穿越破損的腸上皮細胞進入血液循環，與其受體-丙糖酰基鞘氨醇Gb3或丁糖酰基鞘氨醇Gb4結合，造成腸道、中樞神經系統等器官的損傷，特別是Gb3受體含量較高的腎臟，受損后易引發HUS，危及生命；該毒素分為StxI和StxII兩個亞型，臨床引起HUS的大多為StxII。臨床對EHEC引起的前期腹瀉和其他病原體所引起的腹瀉在癥狀上不易區分，抗生素的武斷使用一方面殺死大量的菌體，患者腹瀉癥狀減輕，造成表觀“康復”的假象，這就使得通過分離病原體進行診斷大多以結果陰性告終，貽誤了治療的最佳時機，另一方面，由于Stx是由整合到EHEC基因組中λ噬菌體基因編碼，抗生素的使用容易使殘存的細菌進入SOS應激狀態，噬菌體從靜止的溶源狀態進入裂解狀態，在腸道內產生大量的Stx毒素，并進入血液循環，使患者發生HUS。因此，如能在患者的血清、或腹瀉的血便中檢出毒素，則能及時采取免疫干預措施。所以對于EHEC感染的診斷，與其說是對病原體的分離，不如說對毒素的檢出。與發達國家不同，我國疫情主要集中在衛生保健條件較差的農村地區，患者主要是農民，就醫觀念薄弱，大多具有群發性特點，等到衛生機構介入時，疫情已比較嚴重；目前，與人居住環境關系密切的家畜、家禽帶菌情況較為普遍，并且菌群的毒力基因改變明顯，從Stx1、StxII并存為主逐步演變為StxII為主，提示EHEC疫情不可能短期內消失。并且我國農村基層醫療衛生機構不同程度存在抗生素濫用的現象，也迫切需要一種以毒素分子為靶向的快速、易操作的診斷方法，作為傳統依靠病原體分離進行確診的補充。

發明內容
為解決上述問題，本發明制備了多株針對StxII的單克隆抗體，并從中篩選出非競爭性的兩株單抗，分別為S2D8和S2C6，制備雙抗體夾心法ELISA試劑盒，用于EHEC感染的毒素診斷。本發明還公開了上述ELISA試劑盒的使用方法，所述試劑盒能夠準確檢測出樣品中StxII的含量。本發明公開了上述抗StxII的單克隆抗體S2D8，所述單克隆抗體包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區序列分別如序列表中SEQ ID NO:U SEQ ID NO:2所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。本發明所述的單克隆抗體S2D8的輕鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述單克隆抗體S2D8的重鏈蛋白質分子可變區的互補決定區⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 所示。本發明公開了上述抗StxII的單克隆抗體S2C6，所述單克隆抗體S2C6包括輕鏈和重鏈，其氨基酸可變區序列分別如序列表中SEQ ID N0:1U SEQ ID N0:12所示，其編碼基因分別如序列表中SEQ ID NO:13, SEQ ID N0:14所示。本發明所述的單克隆抗體S2C6的輕鏈蛋白質分子可變區的互補決定區CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列，分別如序列表中 SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17所示。所述單克隆抗體S2C6的重鏈蛋白質分子可變區的互補決定區⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ I D NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20所示。本發明還公開了上述單克隆抗體S2D8和S2C6的制備及釣取其基因的方法，主要包括如下步驟:1.抗StxII單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建首先，原核表達StxII蛋白A亞單位，免疫Balb/c小鼠，首次免疫，StxII蛋白與等體積的福氏完全佐劑混合，腹腔注射；第3周后用等量StxII蛋白與不完全佐劑混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐劑。取免疫后小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞混合，用PEG融合上述細胞，用HAT選擇培養基重懸，置于37°C，5% CO2培養箱中培養。用間接ELISA法篩選陽性細胞克隆再反復亞克隆，直到所有雜交瘤細胞培養上清檢測為100%陽性。2.雜交瘤細胞輕、重鏈基因的釣取提取分泌單克隆抗體S2D8和S2C6細胞的RNA，經RT-PCR，用特異性引物釣取抗體的輕重鏈基因。常規法連接入載體，轉化感受態細菌，培養后挑取單個菌落，提取質粒PCR鑒定后進行DNA測序。3.單克隆抗體S2D8和S2C6可變區氨基酸序列和互補決定區氨基酸序列的分析用www.expasy.0rg在線軟件將單克隆抗體S2D8和S2C6的輕、重鏈可變區核苷酸序列翻譯為其編碼的氨基酸序列，單克隆抗體S2D8的輕、重鏈可變區氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；單克隆抗體S2C6的輕、重鏈可變區氨基酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO:12 所示；根據Kabat數據庫確定單克隆抗體S2D8輕鏈可變區序列中的互補決定區⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；重鏈可變區序列中的互補決定區⑶R1XDR2和⑶R3的氨基酸序列分別如序列表中SEQID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO:10 所示；根據Kabat數據庫確定單克隆抗體S2C6輕鏈可變區序列中的互補決定區⑶R1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；重鏈可變區序列中的互補決定區CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分別如序列表中 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19 和 SEQID NO:20 所示。基于本發明上述單克隆抗體S2D8和S2C6輕、重鏈可變區基因，可構建和表達多種小分子基因工程抗體，如單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、Fab抗體、抗體融合蛋白等；基于上述基因所編碼的多肽或蛋白質，可以交聯上多種生物活性分子，制備用于StxII表達水平檢測、診斷和治療StxII所導致疾病的診斷或治療藥物。本發明通過雜交瘤技術共獲得5株針對StxII A亞單位的單克隆抗體:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，應用雙抗體夾心ELISA法，讓上述5株抗體彼此配對，選出最佳組合以利于StxII毒素檢出，從表I結果可以看出，只有S2D8/S2C6組合，并且只有當S2D8作為包被抗體，而S2C6作為檢測抗體時，其檢測毒素的OD值最高，達到1.764，而其它組合的OD值均較低。由于上述獲得的5株單抗的表位均位于毒素的A亞單位，當兩個抗體同時與該抗原結合時，存在著空間位阻。而只有當S2D8作為捕獲毒素的抗體、且S2C6作為檢測抗體時，由于其彼此之間的阻礙最小，因此顯示的OD值也最高，檢測StxII效果最好。

本發明還對單克隆抗體S2D8和S2C6重、輕鏈同種型(Isotype)進行了鑒定，結果顯示:單克隆抗體S2D8和S2C6的重、輕鏈同種型分別為:重鏈的同種型為G1，而輕鏈的同種型為K。本發明基于單克隆抗體S2D8和S2C6制備了檢測StxII的ELISA試劑盒，所述ELISA試劑盒包括:單克隆抗體S2D8、HRP標記的單克隆抗體S2C6、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品StXII(100ug/ml，0.1ml)、陰性對照樣品BSA、洗液(PBS+0.05%Tween20)。本發明還公開了上述檢測StxII的ELISA試劑盒的使用方法，具體步驟如下:I)用 0.1M 的 NaHC03/Na2C03 緩沖液(ρΗ9.6)稀釋抗體 S2D8 至濃度為 10 μ g/ml，加入至96孔酶標板，100 μ I/孔，4°C包被過夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封閉過夜；2)按合適的稀釋度(1: 2 1: 10)稀釋待測樣品，加入到包被有抗體S2D8的96孔酶標板中，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；同時設置標準品用于標準曲線的制備，用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS倍比稀釋純化的 StxII (1000，500，250，125,62.5,31.3，15.6,7.8,3.9,2.0, 1.0)ng/ml,每孔加入100μ 1，同時設空白對照，每個稀釋度設復孔；3)用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標抗體S2C6，于相應孔中加入100 μ I酶標抗體，于37°C水浴孵育I小時，用PBST洗滌5次后；
4)每孔中加入100 μ I ΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應，于450nm處測定OD值；5)結果判定:當待測樣品的OD值大于空白孔OD值的2倍的視為陽性，待測樣品中StxII的具體濃度根據標準品制作的標準曲線確定。本發明還對檢測StxII的ELISA試劑盒的靈敏性進行了檢測，結果顯示本發明的試劑盒能夠靈敏的檢測樣品中StxII的含量，其靈敏度能夠達到4ng/ml。本發明檢測了上述試劑盒對StxII亞型的敏感性，結果顯示本發明所述的試劑盒對StxIIc和StxIIvha亞型也能進行有效的識別。本發明試劑盒的有益效果:1、本發明的ELISA試劑盒，能有效的檢測出樣品中StxII的含量，其靈敏度達到4ng/ml。2、本發明的ELISA試劑盒，不僅能夠識別StxII毒素，還能有效識別StxII毒素的亞型 StxIIc 和 StxIIvha。3、本發明的試劑盒使用方便，質量穩定，準確性高，特別有利于基層醫療衛生機構快速對EHEC的診斷，及時采取措施遏制疫情的蔓延。


圖1從雜交瘤細胞中抽提的總 RNA ；圖2S2D8重鏈和輕鏈基因PCR擴增的電泳圖；圖3S2C6重鏈和輕鏈基因PCR擴增的電泳圖；圖4檢測StxII的ELISA試劑盒的靈敏性檢測結果。
具體實施例方式通過參閱下述實施例可以更容易地了解本發明的內容，這些實施例只是為進一步說明本發明，并不意味著限定本發明的范圍。實施例一抗StxII單克隆抗體雜交瘤細胞株的構建1.材料融合蛋白StxIIA-GST, protein G親和層析柱,胎牛血清:北京元亨圣馬生物技術研究所產品；無血清RPMI 1640 =Gibco公司產品；0ΡΤΙ_ΜΕΜ培養基，福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑，顯色試劑TMB =Sigma公司產品；SP2/0細胞:ATCC引進；Balb/c以及C57BL/6小鼠:軍事醫學科學院實驗動物中心提供；其余試劑均為市購。2.方法和結果(I)融合蛋白StxIIA-GST免疫5周齡雌性Balb/c小鼠，100 μ g/只，首次免疫，100μ g抗原與等體積的福氏完全佐劑混合，腹腔注射；第3周后用等量抗原與不完全佐劑混合后腹腔免疫；第5周第3次免疫，不加佐劑。(2)脾細胞與骨髓瘤細胞的融合:融合前一周，復蘇小鼠骨髓瘤細胞Sp2/0至OPT1-MEM培養基(含10%的胎牛血清)，置于37°C，5% CO2培養箱中培養，融合前3天，將細胞傳代一次。融合當天,收獲骨髓瘤細胞,并計數,把5.0X IO7骨髓瘤細胞用無血清培養基洗滌2次備用。小鼠經第3次免疫后3-5天，摘除眼球放血、處死。無菌操作取出小鼠脾臟，置滅菌平皿中，分離脾細胞，計數，備用。把等同于小鼠1/2脾臟的脾細胞與骨髓瘤細胞混合，1300rpm離心5min，盡可能去除上清液。在1.5分鐘內加入1.5md的50%的PEG，邊加邊搖勻；然后在8.5分鐘內加入20ml的無血清培養基，邊加邊搖勻。 把經PEG融合的細胞IOOOrpm離心5分鐘，除去上清液，加150ml的HAT選擇培養基重懸，將融合細胞接種至無菌96孔板150 μ I/孔，置于37°C，5% CO2培養箱中培養4天，每孔補加100 μ I選擇培養基。(3)雜交瘤細胞的篩選和克隆:融合后10天，從每孔中吸50 μ I上清，加到包被有StxIIA-GST的96孔ELISA板(用I %的BSA封閉)，室溫孵育1.5小時；洗2次。稀釋辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標記的山羊抗小鼠1: 2000，每孔加50 μ I,室溫孵育1.5小時；洗滌4次。每孔加入100 μ IHRP底物(Η202+ΤΜΒ)，室溫孵育0.5小時，每孔加入100μ12Μ H2SO4，測A450nm值。對于陽性克隆，按上述方法檢測其對GST標簽蛋白的反應性，只有與StxIIA-GST融合蛋白結合而與GST不結合的抗體克隆才被保留，繼續下面的實驗。收集陽性孔細胞，重懸于HT選擇培養基中，采用有限稀釋法稀釋細胞，并種植于96孔細胞培養板中，5天后觀察，對確定只有一個細胞克隆生長的孔，作ELISA進行鑒定。對陽性孔細胞進行有限稀釋，經過3-4次單細胞分離培養，直至獲得穩定的雜交瘤細胞克隆。大量培養雜交瘤細胞，收集含有抗體的培養上清,用protein G親和層析柱進行純化，并透析到PBS中，測濃度，_20°C凍存備用。通過上述雜交瘤技術共獲得5株針對StxII A亞單位的單克隆抗體，分別為S2D8，S2C6，4F5，1G7 和 11H5。實施例二應用雙抗體夾心ELISA選擇最佳抗體配對通過雜交瘤技術實施例1共獲得5株針對StxII A亞單位的單克隆抗體:S2D8，S2C6，4F5，1G7和11H5，應用雙抗體夾心ELISA法，讓上述5株抗體彼此配對，選出最佳組合以利于StxII毒素檢出。1.材料NaHC03/Na2C03緩沖液(pH9.6)，Tween-20,牛血清白蛋白，96孔酶標板，活化辣根過氧化物酶:北京泰天和生物科技有限公司；其余試劑均為市購。2.方法結果單抗的包被。用0.1M的NaHC03/Na2C03緩沖液(pH9.6)稀釋抗體濃度至10 μ g/ml,加入至96孔酶標板，100 μ I/孔，4°C包被過夜，用PBST (在PBS中加入0.05 %的Tween-20)洗I次，加入5%的牛奶4°C封閉過夜，用PBST洗I次，-20°C凍存備用。單抗與辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)的偶聯。把單抗透析至PBS中，調節濃度至lmg/ml。應用北京泰天和生物科技有限公司的產品活化辣根過氧化物酶進行偶聯，具體操作參照其公司說明書。在HRP標記抗體中加入50%的甘油，-20°C凍存備用。不同抗體組合檢測StxII步驟如下:用含有1%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)的PBS稀釋純化的StxII至濃度為10 μ g/ml，每孔加入100 μ 1，于37°C水浴孵育I小時，用PBST洗滌5次。用含有I % BSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標抗體，按照5株抗體彼此配對的原則，于相應孔中加入100 μ I酶標抗體，于37°C水浴孵育I小時，用PBST洗滌5次后，每孔中加入100 μ IΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應，于450nm處測定OD
值。具體結果如表1:表I不同抗體組合檢測StxII的效果
權利要求
1.一種抗StxII的單克隆抗體或其片段，包括輕鏈⑶R1-3和重鏈⑶R1-3，其特征在于，所述輕鏈⑶R1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:15所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:16所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:17所示； 所述重鏈⑶R1-3的氨基酸序列為: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:18所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:19所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:20所示。
2.如權利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示，所述重鏈可變區的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示。
3.如權利要求1-2任意一項所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于，所述輕鏈可變區的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:13的核甘酸序列所示，所述重鏈可變區的編碼序列如序列表中SEQ ID NO:14的核甘酸序列所示。
4.權利要求1-3中任意一項所述的單克隆抗體或其片段在制備檢測StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha中的應用。
5.權利要求1-3中任意一項所述的單克隆抗體或其片段在制備治療StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha所引起疾病的藥物中的應用。
6.—種檢測StxII的ELISA試劑盒,所述試劑盒包括如權利要求1_3任意一項所述的單克隆抗體或其片段。
7.如權利要求6所述的一種檢測StxII的ELISA試劑盒,其特征在于,所述的試劑盒還包括單克隆抗體S2D8，其中單克隆抗體S2D8的輕、重鏈可變區氨基酸序列如序列表中SEQID NO:1 和 SEQ ID NO:2 所示。
8.如權利要求6或7任意一項所述的一種檢測StxII的ELISA試劑盒，還包括:辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品StxI1、陰性對照樣品BSA、洗液(PBS+0.05% Tween20)。
9.一種檢測StxII或其亞型StxIIc和StxIIvha的方法,包括以下步驟: 1)用0.1M的NaHC03/Na2C03緩沖液(ρΗ9.6)稀釋上述抗體S2D8至濃度為10 μ g/ml,加入至96孔酶標板，100 μ l/孔，4。1:包被過夜，用PBST洗I次，加入5%的牛奶4。°〇封閉過夜； 2)按合適的稀釋度(1: 2 1: 10)稀釋待測樣品，加入到包被有抗體S2D8的96孔酶標板中，37°C孵育I小時，用含0.2%吐溫的PBS緩沖液洗滌5次；同時設置標準品用于標準曲線的制備，用含有1%牛血清白蛋的PBS倍比稀釋純化的StxII，標準品StxII倍比稀釋后的濃為 1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、2.0ng/ml、1.0ng/ml，度每孔加入 100 μ I,同時設空白對照,每個稀釋度設復孔； 3)用含有10ABSA的PBS按照1: 1000稀釋HRP酶標記的上述單克隆抗體S2C6，于相應孔中加入100 μ I酶標抗體，于37°C水浴孵育I小時，用PBST洗滌5次后； 4)每孔中加入100μ l ΤΜΒ+Η202底物，室溫孵育20分鐘，每孔加入100 μ 12Μ的硫酸終止反應，于450nm處測定OD值； 5)結果判定:當待測樣品的OD值大于空白孔OD值的2倍時視為陽性，待測樣品中StxII的具體濃度根據 標準品制作的標準曲線確定。
全文摘要
本發明公開了一種檢測StxII的ELISA試劑盒，本發明還公開了所述ELISA試劑盒中單克隆抗體S2D8和S2C6的序列信息及制備過程。本發明所述的ELISA試劑盒包括單克隆抗體S2D8、HRP標記的單克隆抗體S2C6、辣根過氧化物酶底物緩沖液、蛋白標準品StxII(100ug/ml，0.1ml)、陰性對照樣品BSA、洗液液(PBS+0.05％Tween20)。本發明的試劑盒能夠靈敏的檢測樣品中StxII的含量，其靈敏度能夠達到4ng/ml，本發明所述的試劑盒還對StxII的亞型StxIIc和StxIIvha能進行有效的識別。
文檔編號G01N33/68GK103235140SQ20131013700
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月19日 優先權日2013年4月19日
發明者焦永軍, 曾曉燕, 郭喜玲, 史智揚, 汪華, 周明浩 申請人:江蘇省疾病預防控制中心