Rna聚合酶ii第五亞基調節蛋白在制備進行肝細胞癌預后或輔助性tace預后的試劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白(RMP)在制備進行肝細胞癌預后或輔助性TACE預后的試劑中的應用。首次揭示了肝細胞癌中RMP高表達預示肝癌切除手術后預后較不理想；同時，其高表達預示術后輔助性TACE具有有效性。因此，本發明建立了一種基于RMP的肝細胞癌的術后預后方法。
【專利說明】RNA聚合酶I I第五亞基調節蛋白在制備進行肝細胞癌預后或輔助性TACE預后的試劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于醫學生物工程【技術領域】；具體的說，本發明涉及RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白(RMP)用于評估原發性肝細胞癌術后預后不良及輔助性TACE療效的標記應用。
【背景技術】
[0002]原發性肝癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，中國是原發性肝癌的高發地區，每年約有全球一半的新發病例發生在中國。肝細胞癌(HepatoCellular Carcinoma, HCC)是原發性肝癌中常見的病理類型，所占比例約為70-85%。目前手術切除是原發性肝癌治療的首選治療方式。但是原發性肝癌手術切除后的高復發率仍然是導致肝癌患者預后不佳的主要因素。肝癌術后輔助性經導管動脈化療栓塞(Adjuvant transcatheterarterial chemoembolization, Adjuvant TACE)是臨床上常用的預防肝癌手術切除術后的復發的方法之一。但因為其可能影響術后殘余肝臟的功能，所以其療效尚存爭議。目前臨床上認為存在肝癌復發高危因素的患者(例如，腫瘤直徑大于5厘米，有門靜脈癌栓形成等)應該接受輔助性TACE，并且可以獲益。但是這種分類方法存在一定弊端，有一些患者可能存在肝癌術后復發的危險因素，但是尚未達到應用輔助性TACE的標準，就可能造成遺漏。因此需要更加細致的分子分型，來建立多種指標聯合預測的體系，來彌補單一指標的不足(Wang Z, Li Z, Ji Y.Postoperative transcatheter arterialchemoembolization should be recommended in the hepatocellular carcinomatreatment guidelines of the American Association for the Study of LiverDiseases.Hepatology2011;54:1489-149)。
[0003]RMP (RPB5-mediating protein)是 RNA 聚合酶 II (RNA polymerase 11, RNAP II)第5亞基的調節蛋白，又名C19orf2或URI。最早由Cheong等采用Far-Western印跡方法，以32P標記的重組人RPB5探針從肝癌細胞株cDNA文庫中篩查得到。已有研究表明，RMP是一個重要的轉錄調節因子，參與多種基因的轉錄調節，并且在卵巢癌(Theurillat JP,MetzlerSC, et al.URI is an oncogene amplified in ovarian cancer cells and is requiredfor their survival.Cancer Cell2011 ;19:317_332)等癌組織中呈現明顯的高表達。
[0004]然而，本領域目前不清楚RMP與肝癌術后輔助性TACE的相關性。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白在制備肝細胞癌預后評估或輔助性TACE預后評估的試劑中的應用。
[0006]在本發明的第一方面，提供RNA聚合酶11第五亞基調節蛋白的用途，用于制備進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效(預后)評估的診斷試劑。
[0007]在本發明的另一方面，提供一種用于進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的試劑盒，所述試劑盒中包括:特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑。
[0008]在一個優選例中，所述的試劑盒中，所述的特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白的抗體。
[0009]在另一優選例中，所述的試劑盒中，所述的抗體是多克隆抗體。
[0010]在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括:攜帶有可檢測信號分子的檢測抗體(二抗)。
[0011]在另一優選例中，所述的可檢測信號分子選自(但不限于):生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0012]在另一優選例中，所述的試劑盒中還包括:免疫組化試劑。
[0013]在另一優選例中，所述的免疫組化試劑包括:顯色試劑，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修復液，封閉液，PBS,中性樹脂。
[0014]在本發明的另一方面，提供特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑的用途，用于制備進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的試劑盒。
[0015]在一個優選例中，所述的特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白的抗體。
[0016]在本發明的另一方面，提供一種進行肝細胞癌術后預后評估的方法，所述方法包括:
[0017](I)應用所述的試劑盒檢測受試者離體肝癌組織中測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平；
[0018](2)分析蛋白表達水平；
[0019]若測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平高表達，則該受試者預后不理想。
[0020]在本發明的另一方面，提供一種進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的方法，所述方法包括:
[0021](I)應用所述的試劑盒檢測受試者離體肝癌組織中測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平；
[0022](2)分析蛋白表達水平；
[0023]若測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平高表達，則該受試者適合進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞。
[0024]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1、肝癌臨床樣本中RMP免疫組化結果對比圖。
[0026]圖1A是利用免疫組化方法，檢測在肝癌臨床樣本(278例)中癌旁組織，癌組織及門靜脈癌栓(20例)中RMP的表達情況。
[0027]圖1B是各組樣本中免疫組化評分情況。[0028]圖2、RMP與肝癌術后生存期的關系。圖為根據免疫組化評分結果，肝癌組織中高低表達RMP患者的手術切除后生存曲線。
[0029]圖3、RMP可以判斷肝癌術后輔助性TACE的療效。
[0030]其中圖3A在RMP高表達的患者中肝癌術后輔助性TACE的療效；圖3B是在RMP低表達的患者中肝癌術后輔助性TACE的療效。
【具體實施方式】
[0031]本發明人經過廣泛而深入的研究，首次發現肝細胞癌中RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白(RMP)高表達預示肝癌切除手術后預后較不理想；同時，其高表達預示術后輔助性TACE具有有效性。在此基礎上，本發明建立了一種基于RMP的肝細胞癌的術后預后方法。
[0032]本發明的首要目的在于提供一種RMP可以用于評估原發性肝細胞癌術后預后不良及輔助性TACE療效的標記，以解決目前對肝細胞癌的生物學診斷和術后輔助性TACE療效缺少合適的生物學標記的問題。
[0033]作為本發明的優選方式，建立一種檢測試劑盒，所述的試劑盒中含有特異性檢測RMP表達水平的試劑。
[0034]作為本發明的優選方式，所述的特異性檢測RMP表達水平的試劑是抗RMP的抗體。
[0035]制備抗體的技術是本領域中眾所周知的。本發明的抗體可以是對RMP具有特異性的單克隆抗體。單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人,Nature256;495, 1975;Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:511, 1976;Kohler 等人,Eur.J.1mmunol.6:292, 1976;Hammerling 等 人，In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas, Elsevier, N.Y.，1981)。所述單克隆抗體可以利用RMP蛋白或蛋白片段或功能區，通過免疫技術獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。
[0036]本發明的抗體也可以是對RMP蛋白具有特異性的多克隆抗體。所述的多克隆抗體可通過常規的方法來制備,例如,可通過將所述的RMP蛋白導入動物中來獲得,例如,將RMP蛋白與弗氏佐劑按照適當比例(如1:1)混合后免疫動物。免疫方法可使用動物皮下注射。所述動物可選自兔、羊、牛等。也可以是商品化的抗體，例如所述的多克隆抗體是Proteintech 的產品。
[0037]在獲得了特異性檢測RMP蛋白表達水平的試劑后，可以方便地制備出用于特異性檢測RMP蛋白的檢測試劑盒。所述試劑盒中除了含有所述抗體以外，還可以包含:攜帶有可檢測信號分子的檢測抗體(用于與抗RMP抗體結合)，以及疫組化試劑。所述的免疫組化試劑包括但不限于:顯色試劑，二甲苯，乙醇，H2O2甲醇液，抗原修復液，封閉液，PBS,中性樹月旨等。
[0038]如本文所用，所述的“可檢測信號分子”是指用于確定待檢測樣品中RMP蛋白的存在與否以及存在的量的標志物。在確定了本發明的試劑盒所采用的特異性抗體和檢測抗體后，可以采用本領域常規用于與檢測抗體結合來進行檢測的各種可檢測信號分子。例如，可檢測信號分子可以選自:辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶或葡萄糖淀粉酶。
[0039]當采用如上所示的一些酶作為可檢測信號分子時，還需要采用一些與相應的酶結合的底物，從而可通過顯色等方式來報導可檢測信號分子的存在情況或者存在量。所述的底物例如:用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(oro)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP);等等。本領域人員可根據所采用的可檢測信號分子的種類和特性，選擇適宜的底物。
[0040]基于本發明的新發現，可以利用多種免疫學相關方法來檢測樣品中RMP蛋白的表達量，這些方法均被包含在本發明中。在一個實施例中，所述方法包括步驟:通過免疫組化檢測切除的肝細胞癌患者術后石蠟包埋的肝癌及癌旁正常肝組織中RMP表達水平并對染色結果評分，根據其免疫組化評分結果，判斷該患者預后及肝切除術后輔助性TACE的療效，指導肝癌患者術后的個體化治療。
[0041]綜上，根據RMP的表達水平，對肝癌患者預后進行評估。本發明首次提出利用RMP的表達水平進行檢測并預測肝細胞癌手術后復發轉移等事件，并判斷預后，對于肝細胞癌病人術后監控和序貫治療也具有重要的指導意義。
[0042]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0043]實施例1、RMP在肝癌組織樣品中的表達
[0044]在東方肝膽外科醫院選取278例肝細胞癌手術切除樣本和20例門靜脈癌栓樣本。278例樣本的特征參數如表I所示。
[0045]表1、試驗組患者的特征參數
[0046]
【權利要求】
1.RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白的用途，用于制備進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的診斷試劑。
2.一種用于進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括:特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白的抗體。
4.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的抗體是多克隆抗體。
5.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括:攜帶有可檢測信號分子的檢測抗體。
6.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還包括:免疫組化試劑。
7.特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑的用途，用于制備進行肝細胞癌術后預后評估或進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的試劑盒。
8.如權利要求7所述的用途，其特征在于，所述的特異性檢測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平的試劑是抗RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白的抗體。
9.一種進行肝細胞癌術后預后評估的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)應用權利要求2-6任一所述的試劑盒檢測受試者離體肝癌組織中測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平； (2)分析蛋白表達水平； 若測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平高表達，則該受試者預后不理想。
10.一種進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞療效評估的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)應用權利要求2-6任一所述的試劑盒檢測受試者離體肝癌組織中測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平； (2)分析蛋白表達水平； 若測RNA聚合酶II第五亞基調節蛋白表達水平高表達，則該受試者適合進行術后輔助性經導管動脈化療栓塞。
【文檔編號】G01N33/68GK103852585SQ201410125868
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2014年3月31日 優先權日:2014年3月31日
【發明者】王紅陽, 董立巍, 張建, 談冶雄 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
