一種檢測hev抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測HEV抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法，本發明采用雙標記時間分辨熒光免疫分析技術，解決了以往的HEV?IgG抗體和IgM抗體需單個檢測或聯合檢測時不能區分IgG抗體和IgM抗體的難點；實現了微量化檢測HEV?IgG抗體和IgM抗體；采用對患者血清中的HEV?IgG抗體和IgM抗體的聯合檢測,還可以提高HEV的臨床檢出率,有助于疾病的診斷與預防；所述試劑盒的抗原包含了多個主要抗原表位，能在最大程度上降低漏檢情況的發生。本發明的試劑盒具有檢測結果準確性、靈敏度高、特異性強、穩定性好、檢測方法簡便、高效等特點。
【專利說明】一種檢測HEV抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測戊型肝炎病毒抗體的方法及試劑盒，具體涉及一種基于雙標 記時間分辨熒光免疫法檢測戊型肝炎病毒抗體的方法及試劑盒和該試劑盒的制備方法。
【背景技術】
[0002] 戊型病毒性肝炎是由戊型肝炎病毒（HEV)引起的，以肝實質細胞炎性壞死為主的 腸道傳播性疾病。患者主要為成年人，病死率較高，尤其孕期最后3個月的妊娠婦女患病 后，病死率可達10%?39%。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陸發現，中亞、東南亞、非 洲、印度次大陸均有較大流行的報道。多數爆發流行為水源性的。食源性的報道亦見諸文 獻。我國人群戊型肝炎的感染率約18%。急性散發性肝炎中戊肝約占10%，是我國乙類法 定傳染病之一。
[0003] HEV最初曾被劃分為杯狀病毒科，2005年國際病毒學分類委員會（ICTV)將其單獨 門類為戊型肝炎病毒屬（hepevirus)，將與人類疾病相關的HEV分為4個基因型（HEV-1? 4)。但僅有1個血清型。HEV-1是發展中國家戊型肝炎暴發流行及散發流行的主要病 因，HEV-2僅在南美洲和非洲少數國家中有報道，而發達國家的本土戊型肝炎病例主要由 HEV-3或HEV-4導致。迄今在我國戊型肝炎患者中僅發現HEV-1和HEV-4。
[0004] 戊型肝炎潛伏期2?9周，平均約40d。根據流行病學史、臨床癥狀和體征及實驗 室檢查結果，并結合患者具體情況及動態變化進行綜合分析，做出診斷。
[0005] HEV急性感染的診斷指標包括：抗-HEV IgM陽性；抗-HEV IgG陽轉或含量有4倍 及以上升高；血清和（或）糞便HEV RNA陽性。一般情況下這3項指標的任何一項陽性都 可作為HEV急性感染的臨床診斷依據，如同時有2項指標陽性則可確診。（1)抗-HEV IgM 陽性戊型肝炎臨床癥狀出現時絕大部分已可檢出IgM抗體，并且在3個月內快速消退，但少 數患者在6個月后仍可檢出較低水平的IgM抗體。因此，當抗-HEV IgM水平較低時（檢 測值低于試劑盒臨界值的2倍），還應結合抗-HEV IgG水平及其動態變化、HEV RNA檢測 結果、患者自身所處的免疫功能狀態等進行綜合判斷。（2)抗-HEV IgG陽轉或含量有4倍 及以上升高，這一指標需定量檢測雙份血清，不利于早期診斷。由于HEV感染的潛伏期相 對較長，在患者就診時IgG抗體常已陽轉并達到較高水平，限制了這一指標的診斷實用性。 (3)血清和（或）糞便HEV RNA陽性HEV RNA的檢出是HEV現癥感染的直接證據。但考慮 到目前HEV RNA的檢測主要采用RT-PCR的方法，易因操作不當或環境條件不佳而造成假陽 性。因此在HEV RNA陽性時，還需結合血清抗-HEV IgM、抗-HEV IgG水平或動態變化等進 行綜合判斷。在戊型肝炎臨床癥狀開始的1?2周內，70%?80%患者的糞便、血清中可檢 出HEV RNA，隨后陽性率顯著下降。由于HEV感染的潛伏期相對較長，20%?30%的患者在 發病時體內HEV已基本被清除，因此HEV RNA陰性并不能排除HEV急性感染。在一般臨床 實踐和研究中，抗-HEV IgG的檢測結果因試劑和方法的不同會有較大差異，而且單份血清 IgG檢測陽性難以區分急性感染和既往感染，因此除非能比較雙份血清的動態變化，一般不 宜作為HEV急性感染的診斷依據。國內外依賴于構象性抗原研制的抗-HEV IgM檢測試劑 已較成熟，抗-HEV IgM已成為臨床上最主要的HEV急性感染診斷指標，IgM抗體陽性且IgG 抗體陽性一般即可診斷；若IgM抗體陰性而患者處于發病早期則需進行動態觀察；在個別 情況下IgM抗體陽性但IgG抗體陰性，也需進行動態觀察。采用對患者血清中的HEV抗體 (IgG+IgM)的聯合檢測，還可以提高HEV的臨床檢出率，有助于疾病的診斷與預防。
[0006] 戊型肝炎在全球各地還存在不同程度爆發和散發流行，但隨著流行病學不斷深入 的調查和積極的干預措施，提高人們對戊型肝炎的認識。以及臨床檢測手段的不斷提高，將 更有助于降低戊型肝炎的患病率，提高人們的生活質量。
[0007] 研究表明，提高HEV診斷價值的首要因素是抗原位點的選擇，HEV抗原表位主要分 布在0RF2和0RF3,理想的診斷試劑應包含0RF2及0RF3主要抗原表位，大部分HEV抗體陽 性血清既能和0RF2重組抗原反應，也能和0RF3合成肽反應。有少部分血清僅針對0RF2或 0RF3區抗原呈單陽性反應。其中較大的0RF2區編碼膜結構蛋白，含有較多的抗原表位，而 且相應抗體的半衰期較長，因而用于ELISA診斷的敏感性高。在以往的研究中，對0RF3區 蛋白的研究不如0RF2,但0RF3區蛋白也包含了多個線性抗原表位，在機體免疫反應中起了 重要作用。為提高重組蛋白與合成肽抗原在HEV檢測中的診斷價值，應盡可能多地保留各 種毒株的高效抗原表位，從而減少變異株所致的HEV檢測中漏檢的可能。合成肽抗原是通 過固相合成的方法制備，無需純化，由于沒有宿主菌蛋白混雜，且分子量小，結構簡單，避免 了與其他抗體發生交叉反應的可能，因而特異性高；但由于合成肽一般肽鏈比較短，包含的 抗原位點較少，影響了陽性的檢出率。目前，商品化的試劑盒分別以0RF2部分片段重組蛋 白（如北京萬泰試劑盒）、以0RF2片段為模板序列合成的多肽和0RF3重組蛋白的混合抗原 (如Genelabs試劑盒）和合成肽（如上海科華試劑盒）為抗原。
[0008] 目前抗-HEV常用方法有放射免疫分析法（radioimmunoassay, RIA)、酶 聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA)、化學發光 免疫分析法（chemiluminescent immunoassay, CLIA)、電化學發光免疫分析法 (electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)等。RIA 由于放射性污染，對環境和 操作者影響較大，批內批間變異較大，難于自動化；ELISA采用大分子酶標記，且酶容易 失活，這種依靠比色法或偏振光法的檢測技術所受的干擾因素太多（即使是優秀的"管 式ELISA"，其試管形狀的變化也會影響試驗的結果），其靈敏度、線性和穩定性未能高于 RIA ;CLIA的化學發光通常是瞬間完成，發光峰值很快衰減，溫度和pH值對發光有很大影 響，該類因素影響了該類方法的應用；ECLI仍為非開放系統，試劑依賴進口，試劑昂貴， 維修及檢測成本高，這也限制了其推廣應用。由于時間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoroisnmunoassay，TRFIA)獨特的技術原理，有區別于傳統的免疫標記技術的特點和優 勢，已被人們廣泛接受，與現在廣泛使用的RIA、ELISA、CLIA和ECLI相比，TRFIA克服了 RIA 放射性污染的不足、酶標記物的不穩定性和定量范圍窄的缺陷、化學發光僅能一次發光、一 般熒光標記受環境干擾的難點和ECLI的非直接標記等缺點，Eu標記TRFIA的靈敏度可達 l(T19m〇l/L，應用范圍廣，致使其試劑盒的生產和檢測儀器的更新換代進展甚速，目前已實 現了分析技術的自動化，TRFIA已成為生物醫學研究和臨床超微量生化檢驗中一項最有發 展前景的分析手段。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在于克服現有技術存在的不足之處而提供了一種基于雙標記時間 分辨熒光免疫法檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，以及所述試劑盒的制備方法，本發明還 提供了一種采用所述試劑盒檢測HEV抗體的方法。
[0010] 為實現上述目的，所采取的技術方案：一種檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，所述 試劑盒包括：包被有HEV抗原的固相載體，與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體，校 準品，樣本稀釋液，實驗緩沖液，濃縮洗液以及增強液。
[0011] 優選地，所述包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV 重組抗原。
[0012] 優選地，所述包被有HEV抗原的載體是采用以下步驟制備而得的：
[0013] 將HEV抗原用包被緩沖液稀釋，在固相載體上進行包被，將固相載體洗滌1次，然 后再用封閉液進行封閉，將固相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存備用。
[0014] 優選地，所述與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體為Eu3+標記的鼠抗人IgG 抗體和Sm3+標記的鼠抗人μ鏈抗體的組合。當所述與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢 測抗體為Eu 3+標記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標記的鼠抗人μ鏈抗體的組合時，所述Eu3+標 記的鼠抗人IgG抗體和所述Sm 3+標記的鼠抗人μ鏈抗體在本發明所述試劑盒中是分開儲 存的，在使用時再聯合加入。
[0015] 優選地，所述Eu3+標記的鼠抗人IgG抗體是參照Eu3+標記試劑盒說明書操作而制 備的，所述Sm 3+標記的鼠抗人μ鏈抗體是參照Sm3+標記試劑盒說明書操作而制備的。
[0016] 本發明還提供了一種采用上述所述試劑盒檢測HEV抗體的方法，所述方法包括以 下步驟：
[0017] (1)用實驗緩沖液配制與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體；
[0018] (2)用純化水將濃縮洗液稀釋成工作洗滌液；
[0019] (3)將待檢樣本用樣本稀釋液稀釋，將校準品或已稀釋待檢樣本加入到包被有 HEV抗原的固相載體中；
[0020] (4)固相載體在室溫下孵育；
[0021] (5)用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體；
[0022] (6)加入步驟（1)中配制的與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體，在室溫下 孵育；
[0023] (7)用步驟⑵中工作洗滌液洗滌抗原固相載體；
[0024] (8)加入增強液，繼續孵育；
[0025] (9)孵育結束后，采用對應的熒光標記窗口檢測程序進行檢測并分析。
[0026] 優選地，所述步驟（1)中與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體為Eu3+標記 的鼠抗人IgG抗體和Sm 3+標記的鼠抗人μ鏈抗體的組合。
[0027] 優選地，所述步驟（3)中包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原 表位的HEV重組抗原。
[0028] 本發明還提供了一種上述所述試劑盒的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0029] (1)制備包被有HEV抗原的固相載體；
[0030] ⑵制備校準品；
[0031] (3)制備與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體；
[0032] (4)制備樣本稀釋液、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液；
[0033] (5)貼標簽；
[0034] (6)組裝為試劑盒。
[0035] 本發明的有益效果在于：目前，商品化的試劑盒所采用的診斷抗原多以HEV0RF3 表達蛋白與合成肽的混合抗原，或單以HEV 0RF2部分片段的表達蛋白，由于抗原表位的不 全，在HEV臨床診斷過程中常發生漏檢現象。本發明提供的檢測試劑盒的重組蛋白抗原包 含了 0RF2片段和0RF3全片段，含有多個主要抗原表位，能在最大程度上降低漏檢情況的發 生，克服了以合成多肽作為抗原的檢測試劑的弱點，提高了檢測試劑的敏感性，0RF3C端和 0RF2C端被認為是抗原性較強的區域，對抗原決定簇的研究多數是針對這兩個區域開展的。 本發明采用雙標記時間分辨熒光免疫分析技術，解決了以往的HEV IgG抗體和IgM抗體需 單個檢測或聯合檢測時不能區分IgG抗體和IgM抗體的難點；本發明實現了一個微孔檢測 能分別檢測出HEV IgG抗體和IgM抗體，也實現了試劑盒能同時定量檢測HEV IgG抗體和 IgM抗體；將試劑盒溯源至國家標準血清物質，實現了 HEV IgG抗體和IgM抗體檢測結果的 溯源性；利用了時間分辨熒光免疫分析技術的高靈敏和高特異的獨特技術原理，實現了微 量化檢測HEV IgG抗體和IgM抗體，采用對患者血清中的HEV IgG抗體和IgM抗體的聯合 檢測，還可以提高HEV的臨床檢出率，有助于疾病的診斷與預防。本發明的試劑盒具有檢 測結果準確性高、靈敏度高、特異性強、穩定性好、檢測方法簡便、高效等特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0036] 圖1為采用本發明所述試劑盒檢測本發明所述試劑盒中校準品時校準品中 HEVIgG抗體的標準曲線圖；
[0037] 圖2為采用本發明所述試劑盒檢測本發明所述試劑盒中校準品時校準品中 HEVIgM抗體的標準曲線圖；
[0038] 圖3為采用本發明所述試劑盒檢測企業HEV IgG抗體參考品時的劑量-反應曲線 圖；
[0039] 圖4為采用本發明所述試劑盒檢測企業HEV IgM抗體參考品時的劑量-反應曲線 圖。
【具體實施方式】
[0040] 為更好的說明本發明的目的、技術方案和優點，下面將結合具體實施例對本發明 作進一步說明。實施例中的HEV重組抗原、鼠抗人IgG抗體、鼠抗人μ鏈抗體購于Sigma 公司；固相載體為96孔微孔空白板（8X12孔）購于深圳市金燦華實業有限公司；銪 (Eu3+)與杉（Sm 3+)標記試劑盒購于芬蘭Wallac公司；瓊脂糖凝膠Sepharose CL-6B購于 瑞典Pharmacia公司；HEV IgG抗體標準物質[GBW(E)090091]和HEV IgM抗體標準物質 [GBW(E)090089]為北京康徹思坦生物技術有限公司提供；HEV IgG抗體參考品和HEV IgM 抗體參考品為中國食品藥品檢定研究院提供；參比試劑盒為戊型肝炎病毒IgG抗體診斷試 劑盒（酶聯免疫法）和戊型肝炎病毒IgM抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法），由北京萬泰生 物藥業股份有限公司提供；第三方驗證試劑盒為由意大利Dia. Pro Diagnostic Bioprobes S.r.l.公司提供的戊型肝炎病毒IgG、IgM抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法），以及由北京金 豪制藥股份有限公司提供的戊型肝炎病毒RNA檢測試劑盒（FQ-PCR法）。增強液、濃縮洗 液、實驗緩沖液、FWZ- I型微量振蕩儀、DEM-III型全自動酶標洗板均由廣州市豐華生物工 程有限公司提供。VictorTM2D1420型TRFIA儀購于美國Perkin Elmer公司。其他試劑為 國產分析純。
[0041] 實施例1
[0042] 本發明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的一種實施例，所述試劑盒包括：包 被有HEV重組抗原的固相載體，Eu 3+標記的鼠抗人IgG抗體，Sm3+標記的鼠抗人μ鏈抗體，校 準品、樣本稀釋液、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液；所述HEV重組抗原含有0RF2和0RF3 抗原表位。
[0043] 本發明還提供了上述所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的制備方法，所述方法 包括以下步驟：
[0044] (1)制備包被有抗原的固相載體：將HEV重組抗原用包被緩沖液稀釋0. 1? 10 μ g/mL，在固相載體上進行包被，將固相載體洗滌1次，然后再用封閉液進行封閉，將固 相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存備用。優選地，所述包被緩沖液為50mmol/L、 pH9. 6的碳酸緩沖液，20mmol/L、pH4. 5的磷酸鹽緩沖液，50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl緩沖 液和50mmol/L、pH4. 5的檸檬酸鹽緩沖液中的一種，所述封閉液為含1%重量BSA和5%重 量鹿糖的50mmol/L、ρΗ7· 8的Tris-HCl緩沖液。
[0045] (2)制備所述Eu3+標記的鼠抗人IgG抗體：參照Eu3+標記試劑盒說明書操作，將 1. 〇mg的鼠抗人IgG抗體加入Millipore公司的截留分子量為50000的超濾離心管中， 8000r/min離心5?6min，再用標記緩沖液重復洗滌6次，將處理得到的200μ L鼠抗人 IgG抗體加入到1. Omg的預先用標記緩沖液溶解的Eu3+標記試劑充分混勻，2?8°C振蕩 孵育48±2h ;反應液經用50mmol/L pH7. 80Tris-HCl緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)層析，在A280監測收集第一洗脫峰。優選地，所述標記緩沖液為50mmol/L、 pH9. 6的碳酸緩沖液。
[0046] 制備所述Sm3+標記的鼠抗人μ鏈抗體：參照Sm3+標記試劑盒說明書操作，將 1. Omg的鼠抗人μ鏈抗體加入Millipore公司的截留分子量為50000的超濾離心管中， 8000r/min離心5?6min，再用標記緩沖液重復洗滌6次，將處理得到的200 μ 1鼠抗人 μ鏈抗體加入到1. 〇mg的預先用標記緩沖液溶解的Sm3+標記試劑充分混勻，2?8°C振蕩 孵育48±2h。反應液經用50mmol/L pH7.80Tris-HCl緩沖液平衡的S印harose CL-6B柱 (lcmX40cm)層析，在A280監測收集第一洗脫峰。
[0047] 將Eu3+標記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標記的鼠抗人μ鏈抗體，分別用含有2g/ L BSA的50mmol/L、pH7. 8的Tris-HCl緩沖液稀釋成最適工作濃度的1/20倍，分別分裝成 0. 5ml/ 瓶。
[0048] (3)制備校準品：分別以HEV IgG抗體標準物質[GBW(E)090091]和HEV IgM抗體 標準物質[GBW(E)090089]為參比，將HEV IgG抗體和IgM抗體原料用含有10g/L BSA的 50mmol/L，pH7. 8的Tris-HCl緩沖液稀釋成A、B、C、D、E和F6個校準品，其中A校準品含 有0U/ml HEV IgG抗體和0U/ml HEV IgM抗體，B校準品含有0.025U/ml HEV IgG抗體和 0.1U/ml HEV IgM 抗體，C 校準品含有 0.050U/ml HEV IgG 抗體和 0.2U/ml HEV IgM 抗體，D 校準品含有0. lOU/ml HEV IgG抗體和0. 5U/ml HEV IgM抗體，E校準品含有0. 50U/ml HEV IgG 抗體和 2. OU/ml HEV IgM 抗體，F 校準品含有 1. OU/ml HEV IgG 抗體和 4. OU/ml HEV IgM抗體，分裝成0· 5ml/瓶。
[0049] (4)樣本稀釋液：含有BSA、硫柳汞、Tris-HCl緩沖液，分裝成30ml/瓶。
[0050] ⑶實驗緩沖液：含有小牛血清、染料、Tween2〇、EDTA、Procline 3〇0、Tris-HCl緩 沖液，分裝成30ml/瓶。
[0051] (6)濃縮洗液：含有Tween20及染料、Procline300、Tris-HCl緩沖液，分裝成 40ml/ 瓶。
[0052] (7)增強液：含曲拉通、冰乙酸、螯合劑、純化水，分裝成40ml/瓶。
[0053] (8)貼標簽。
[0054] (9)組裝為試劑盒產品。
[0055] 上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出3份經過特異性、靈敏度、精密性及穩定 性檢定合格才能組裝成HEV IgG抗體和IgM抗體雙標記測定試劑盒（時間分辨熒光免疫 法）。組裝完成后還需抽檢合格后才能出廠。
[0056] 實施例2
[0057] 本發明所述試劑盒實驗方法簡單快速，可自動化操作，檢測系統為開放式操作系 統，本發明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的使用方法，具體操作如下：
[0058] (1)試劑準備
[0059] ①抗原固相載體：將試劑及所需數量的抗原固相載體平衡至室溫（20?25°C )。 余下的抗原固相載體及時置入自封袋密閉并于2?8°C保存。
[0060] ②洗滌液：將40ml濃縮洗液和960ml純化水在干凈的容器中混合，作為工作洗滌 液備用。純化水敬請用戶自備。
[0061] ③標記物混合工作液：使用前30min內配制，將Eu3+標鼠抗人IgG抗體、Sm 3+標鼠 抗人μ鏈抗體與實驗緩沖液按體積比為Eu3+標鼠抗人IgG抗體：Sm3+標鼠抗人μ鏈抗體： 實驗緩沖液=1:1:20的比例加進潔凈的同一個一次性容器中并混勻；當次實驗用完。
[0062] (2)試驗操作
[0063] ①將待測血清樣本用樣本稀釋液按1:10稀釋；吸取100 μ 1的抗_HEV(IgG+IgM) 校準品或已稀釋樣本依次加入到抗原固相載體中。
[0064] ②抗原固相載體在室溫下，用振蕩孵育45min。
[0065] ③第一步孵育結束后，洗滌4次。
[0066] ④向每個反應位中加入100 μ 1已配好的標記物混合工作液。
[0067] ⑤在室溫下，振蕩孵育45min。
[0068] ⑥第二步孵育結束后，洗滌6次。
[0069] ⑦向每個反應位中加入增強液100 μ 1。
[0070] ⑧固相載體于室溫下緩慢振蕩5min后檢測，在30min內完成檢測并進行分析。銪 (Eu 3+)標記熒光檢測采用銪標記窗口檢測程序，釤（Sm3+)標記熒光檢測采用釤標記窗口檢 測程序，并采用配套的分析軟件進行結果分析，采用本發明所述試劑盒檢測本發明所述試 劑盒中校準品時校準品中HEV IgG抗體的標準曲線圖如圖1，采用本發明所述試劑盒檢測 本發明所述試劑盒中校準品時校準品中HEV IgM抗體的標準曲線圖如圖2。
[0071] 實施例3
[0072] 本發明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的分析性能評價：
[0073] (l)HEV IgG抗體的檢測性能
[0074] 陰性參考品符合率：檢測HEV IgG抗體國家陰性參考品30支，陽性反應不多于1 份；
[0075] 陽性參考品符合率：檢測HEV IgG抗體國家陽性參考品10支，陰性反應不多于1 份；
[0076] 最低檢出限：檢測國家最低檢出限參考品6份，陽性反應不少于3份且基質血清 S1為陰性反應；
[0077] 線性：檢測企業參考品，L1?L5共5個樣品測定值統計分析后，實測值與理論值 的線性相關系數r大于0.98,如圖3。
[0078] 準確度：檢測企業參考品，L1?L5共5個樣品的實測值與理論值相對偏倚均在 ±20. 0% 內。
[0079] 重復性：平行測定HEV IgG抗體國家精密度參考品10孔，實測濃度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0080] 穩定性：試劑盒自成品生產之日起于37°C放置6天（有效期為12個月）；成品剩 余效期內，則按37°C放置6天有效期為12個月推算37°C放置的時間進行檢測，結果符合各 項目規定的要求。
[0081] (2)HEV IgM抗體的檢測性能
[0082] 陰性參考品符合率：檢測HEV IgM抗體國家陰性參考品20支，均為陰性反應 (20/20)；
[0083] 陽性參考品符合率：檢測HEV IgM抗體國家陽性參考品12支，均為陽性反應 (12/12)；
[0084] 重復性：平行測定HEV IgM抗體國家精密度參考品10孔，實測濃度值的精密度（CV 值）彡15% ;
[0085] 最低檢出量（稀釋度）：檢測國家靈敏度參考品，最低檢出量（稀釋度1:8 ;
[0086] 線性：檢測企業參考品，L1?L5共5個樣品測定值統計分析后，實測值與理論值 的線性相關系數r大于0.98,如圖4。
[0087] 準確度：檢測企業參考品，L1?L5共5個樣品的實測值與理論值相對偏倚均在 ±20. 0% 內；
[0088] 穩定性：試劑盒自成品生產之日起于37°C放置6天（有效期為12個月）；成品剩 余效期內，則按37°C放置6天有效期為12個月推算37°C放置的時間進行檢測，結果符合各 項目規定的要求。
[0089] 本發明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的干擾試驗評價：
[0090] 本發明實施例1制備的HEV IgG抗體和IgM抗體雙標記測定試劑盒（時間分辨熒 光免疫法）的分析特異性評價如下：
[0091] 血樣本中膽紅素818 μ mol/L、血紅蛋白180g/L、甘油三酯21. 54mmol/L對本試 劑盒的檢測結果無干擾作用。不受血樣本中檸檬酸鈉（l.〇88mol/L)、乙二胺四乙酸二鉀 (0. 2744mol/L)、草酸鉀（0. 5428mol/L)、氟化鈉（0. 4878mol/L)、肝素鈉（150U/L)等抗凝劑 的干擾。檢測甲型肝炎病毒抗體（8U/mL)、乙型肝炎病毒表面抗體（640mIU/mL)、乙型肝炎 病毒e抗體（16NCU/mL)、乙型肝炎病毒核心抗體（8NCU/mL)、丙型肝炎病毒抗體（4NCU/mL)、 梅毒抗體（160mIU/mL)均無交叉反應。
[0092] 本發明所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒與參比試劑盒的等效性評價：
[0093] 本發明實施例1制備的HEV IgG抗體和IgM抗體雙標記測定試劑盒（時間分辨熒 光免疫法）的等效性評價結果如表1、表2、表3 :
[0094] 表1 1020例正常人血清樣本的臨床比對
[0095]
【權利要求】
1. 一種檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：包被有HEV抗 原的固相載體，與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體，校準品，樣本稀釋液，實驗緩 沖液，濃縮洗液以及增強液。
2. 根據權利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述包被有 抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重組抗原。
3. 根據權利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述包被有 HEV抗原的載體是采用以下步驟制備而得的： 將HEV抗原用包被緩沖液稀釋，在固相載體上進行包被，將固相載體洗滌1次，然后再 用封閉液進行封閉，將固相載體甩干，晾干，真空包裝，2?8°C保存備用。
4. 根據權利要求1所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述與HEV抗 體結合的鑭系元素標記的檢測抗體為Eu3+標記的鼠抗人IgG抗體和Sm 3+標記的鼠抗人μ 鏈抗體的組合。
5. 根據權利要求4所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述Eu3+標 記的鼠抗人IgG抗體是參照Eu 3+標記試劑盒說明書操作而制備的，所述Sm3+標記的鼠抗人 μ鏈抗體是參照Sm3+標記試劑盒說明書操作而制備的。
6. -種采用如權利要求1所述試劑盒檢測戊型肝炎病毒抗體的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 用實驗緩沖液配制與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體； (2) 用純化水將濃縮洗液稀釋成工作洗滌液； (3) 將待檢樣本用樣本稀釋液稀釋，將校準品或已稀釋待檢樣本加入到包被有HEV抗 原的固相載體中； (4) 固相載體在室溫下孵育； (5) 用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體； (6) 加入步驟（1)中配制的與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體，在室溫下孵 育； (7) 用步驟（2)中工作洗滌液洗滌抗原固相載體； (8) 加入增強液，繼續孵育； (9) 孵育結束后，采用對應的熒光標記窗口檢測程序進行檢測并分析。
7. 根據權利要求6所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述步驟（1) 中與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體為Eu 3+標記的鼠抗人IgG抗體和Sm3+標記的 鼠抗人μ鏈抗體的組合。
8. 根據權利要求6所述的檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒，其特征在于，所述步驟（3) 中包被有抗原的固相載體中抗原為含有0RF2和0RF3抗原表位的HEV重組抗原。
9. 一種如權利要求1所述檢測戊型肝炎病毒抗體的試劑盒的制備方法，其特征在于， 所述方法包括以下步驟： (1) 制備包被有HEV抗原的固相載體； (2) 制備校準品； (3) 制備與HEV抗體結合的鑭系元素標記的檢測抗體； (4) 制備樣本稀釋液、實驗緩沖液、濃縮洗液以及增強液； (5) 貼標簽； (6) 組裝為試劑盒。
【文檔編號】G01N33/576GK104090105SQ201410327852
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】譚玉華, 盧德祥, 李奕輝, 范主橋 申請人:廣州市豐華生物工程有限公司
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