三疣梭子蟹血細胞的酶聯免疫檢測試劑盒及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種三疣梭子蟹血細胞的酶聯免疫檢測試劑盒及其制備方法。所述檢測試劑盒包括酶標板、封閉液、洗滌液、酶標記抗體、pNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆抗體。其中所述的抗三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體是由雜交瘤細胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆隆抗體，所述單抗能與三疣梭子蟹血細胞特異性結合。本發明的優點是將抗原、抗體的特異性反應與酶底物的高效催化作用相結合起來，其敏感度高，特異性強，精確度高，能夠用于少量樣品、多個樣品的平行檢測，重復性穩定性都大大提高。能夠將三疣梭子蟹血細胞的變化直觀的表現出來，起到監測三疣梭子蟹健康狀況的作用。
【專利說明】三疣梭子蟹血細胞的酶聯免疫檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種應用單克隆抗體定量檢測三撫梭子蟹iPortunustrituberculatus)血細胞的酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒及其制備方法,屬于甲殼類分子免疫學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]蟹等甲殼動物缺乏脊椎動物那樣完整的特異性免疫防御系統，不具有免疫球蛋白，其免疫防御反應機制主要依賴于血細胞(透明細胞和顆粒細胞)及血淋巴中體液因子，血細胞通過吞噬、包囊、凝集、胞吐、結節形成、傷口修復、細胞凝塊等完成細胞免疫過程，大量研究證明透明細胞和顆粒細胞在機體免疫系統中都發揮重要作用，但功能不同，其中透明細胞主要參與血淋巴的凝集反應，顆粒細胞含有酚氧化酶和水解酶，主要參與對外來異物的吞噬和包囊。當機體受到重金屬、低溫、高溫、饑餓及病原侵害等脅迫時，血細胞會發生顯著變化。因此，血細胞是反應蟹類免疫防御功能和健康狀況的重要指標之一。
[0003]但目前有關三疣梭子蟹血細胞酶的功能、血細胞結構、血細胞參與免疫防疫反應的機理在國內外研究較少，主要是由于沒有合適的分子標記物研究其發生及反應機理，而單克隆抗體由于具有高靈敏度、高特異性、重復性強等特點常被應用于免疫細胞的定位和病原的定量研究中。目前已有中國對蝦血細胞，扇貝血細胞單克隆抗體的研究報道，主要應用于研究識別、鑒定、檢測血細胞變化等方面。因此，三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體的制備為進一步研究三疣梭子蟹血細胞類型、不同血細胞之間的關系以及蟹類血細胞在三疣梭子蟹非特異性免疫系統中的作用提供了有力工具。此外，研究表明，蟹類受外來病原和環境刺激時，其血細胞總數會發生顯著變化，以三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體為基礎建立酶聯免疫檢測技術，可以通過監測水產養殖生產中蟹類血細胞數量的變化，進而評估生產實踐中三疣梭子蟹體質及抗逆狀況。
【發明內容】
[0004]本發明的一個目的是提供一種精確度高、特異性強、重復性強且成本低、效價高的應用抗三疣梭子蟹血細胞單抗來檢測血細胞數量變化的酶聯免疫(ELISA)檢測試劑盒，通過檢測三疣梭子蟹血細胞數量變化，來監測三疣梭子蟹健康狀況。
[0005]本發明的另一個目的是提供上述三疣梭子蟹血粒細胞ELISA檢測試劑盒的制備方法。
[0006]本發明的ELISA檢測試劑盒包括:酶標板、封閉液、洗滌液、酶標記抗體、pNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆抗體。
[0007]其中所述的抗三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體是由雜交瘤細胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆隆抗體，所述單抗能與三疣梭子蟹血細胞特異性結合。
[0008]所述的封閉液為含2.0% (w/v)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
[0009]所述的洗滌液為含0.1% (v/v)Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
[0010]所述的酶標記抗體為堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG抗體。
[0011]所述的血細胞抗凝劑為含0.02M EDTA的磷酸鹽緩沖液。
[0012]本發明的ELISA檢測試劑盒的制備方法包括以下步驟:
1、制備三疣梭子蟹血細胞標準樣品:從健康的三疣梭子蟹游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，離心后、得到的全血細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，制成單細胞懸液，調整細胞懸液濃度為106cells/mL,經超聲破碎后，即為血細胞標準樣,作為抗原使用；
2、制備單抗:以血細胞標準樣品為抗原免疫小鼠，Balb/c免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合、克隆，制備三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體；用間接免疫熒光法選取I株免疫熒光反應結果為強陽性，且能與顆粒細胞特異性結合的單克隆抗體作為抗三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體；
3、優化抗原與抗體的最佳使用比例:分別用PBS將上述血細胞標準樣品與上述血細胞單克隆抗體稀釋不同的濃度梯度，通過ELISA棋盤滴定法獲取抗原抗體的最適反應比例，從而確定抗原抗體的最佳使用比例；
4、建立檢測結果的評估標準:上述的血細胞標準樣用考馬斯亮藍測定其蛋白濃度，用PBS稀釋血細胞標準樣為不同的濃度梯度，及不經稀釋的血細胞單克隆抗體3F4作為第一抗體，用ELISA法測定各個稀釋度的OD值，來確定試劑盒的最低檢測限度。
[0013]本發明的優點是將抗原、抗體的特異性反應與酶底物的高效催化作用相結合起來，其敏感度高，特異性強，精確度高，能夠用于少量樣品、多個樣品的平行檢測，重復性穩定性都大大提高。能夠將三疣梭子蟹血細胞的變化直觀的表現出來，起到監測三疣梭子蟹健康狀況的作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0014]圖1為本發明的單抗3F4與三疣梭子蟹血細胞反應的間接免疫熒光檢測結果。
[0015]圖2為本發明用于檢測三疣梭子蟹經病原菌感染后血細胞數變化的結果。
[0016]圖1所示:(A)為原視野下血細胞的觀察圖；(B)為激光共聚焦顯微鏡下細胞核呈藍色；(C)血細胞與單抗MAb 3F4反應后出現綠色熒光；(D)為B和C的Merge圖。
【具體實施方式】
[0017]下面結合附圖并通過具體實施例對本發明作進一步說明。
[0018]實施例1:三疣梭子蟹血細胞ELISA檢測試劑盒的制備
1、制備血細胞標準樣:取3-4只正常健康的三疣梭子蟹，無菌注射器從游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，4 °C預冷抗凝劑(29.835g Nacl，18gC6H1206, 38.426gC6H807，
8.823gC6H5Na207, 3.7224g EDTA_2Na,調整 pH=7.3，雙蒸水定容至 1000ml)按體積比 1:2 混勻，4°C，1500rpm,離心6min，沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，調整細胞懸液濃度為106cellS/mL，超聲破碎后，即為血細胞標準樣，作為抗原使用，分裝，-80°C凍存。
[0019]2、制備抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆抗體
(I)Balb/c小鼠的免疫:取上述制備好的血細胞抗原與等體積弗氏完全佐劑混合，完全乳化，取0.1ml腹腔注射4周齡雌性Balb/c小鼠；2周后加強免疫，腹腔注射抗原0.1ml(佐劑改為弗氏不完全佐劑);1周后二次加強免疫，尾靜脈注射抗原0.1ml ;1周后擴增免疫，尾靜脈注射抗原0.1ml ;三天后，Balb/c免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合。
[0020](2)細胞融合并篩選血細胞的陽性雜交瘤細胞:Balb/c免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞用常規方法進行細胞融合，培養；采用間接酶聯免疫吸附法初步篩選陽性雜交瘤細胞株；采用有限稀釋法克隆陽性雜交瘤細胞株3-4次，培養8-10天后，采用間接免疫熒光抗體法再次檢測篩選陽性雜交瘤細胞株3F4 (圖1)。
[0021](3)血細胞單抗的收集與純化:收集細胞培養板中的陽性雜交瘤細胞上清液，2000rpm，離心10min，棄血細胞沉淀，收集上清即為三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體，過親和層析柱，濃縮、透析、凍干，PBS重懸，分裝，-80°C凍存。
[0022]3、確定抗原與抗體的最佳使用比例:血細胞標準樣品用PBS按照2°，2—1到2_6的梯度稀釋、包被4°C過夜；加以PBS配置的2%的牛血清蛋白溶液(封閉液)封閉Ih ;將血細胞單抗(一抗)按照到2_5的梯度稀釋，每孔10ul按棋盤滴定法加入相應的血細胞標準樣中，37°C孵育1.5h ;加10ul酶標記抗體作為AP 二抗，37°C孵育Ih ;加10ul pNPP底物顯色液37°C孵育30min，酶標儀于405nm處讀數。最后為節約成本并結合實際用量確定稀釋度在抗原稀釋4倍，單抗稀釋4倍(即2_22_2)為最佳使用比例。
[0023]表1不同稀釋梯度的抗原和抗體結合的OD4(l5nm，粗體為0D405nm≥0.408
【權利要求】
1.一種三疣梭子蟹血細胞的酶聯免疫檢測試劑盒，包括:酶標板、封閉液、洗滌液、酶標記抗體、PNPP底物顯色液、磷酸鹽緩沖液、血細胞抗凝劑，其特征在于所述試劑盒還包括抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的抗三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體是由雜交瘤細胞株3F4分泌的抗三疣梭子蟹血細胞的單克隆隆抗體。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的封閉液為含2.0%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液。
4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的洗滌液為含0.1%Tween-20的磷酸鹽緩沖液。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的酶標記抗體為堿性磷酸酶標記的羊抗小鼠IgG抗體。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的血細胞抗凝劑為含0.02MEDTA的磷酸鹽緩沖液。
7.—種如權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)制備三疣梭子蟹血細胞標準樣品:從健康的三疣梭子蟹游泳足基部軟膜處抽取血淋巴，離心后、得到的全血細胞沉淀用磷酸鹽緩沖液重懸，制成單細胞懸液，調整細胞懸液濃度為106cellS/mL，經超聲破碎后，即為血細胞標準樣，作為抗原使用； (2)制備單抗:以血細胞標準樣品為抗原免疫小鼠，Balb/c免疫小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞的融合、克隆，制備三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體；用間接免疫熒光法選取I株免疫熒光反應結果為強陽性，且能與顆粒細胞特異性結合的單克隆抗體作為抗三疣梭子蟹血細胞單克隆抗體； (3)優化抗原與抗體的最佳使用比例:分別用PBS將上述血細胞標準樣品與上述血細胞單克隆抗體稀釋不同的濃度梯度，通過ELISA棋盤滴定法獲取抗原抗體的最適反應比例，從而確定抗原抗體的最佳使用比例； (4)建立檢測結果的評估標準:上述的血細胞標準樣用考馬斯亮藍測定其蛋白濃度，用PBS稀釋血細胞標準樣為不同的濃度梯度，及不經稀釋的血細胞單克隆抗體3F4作為第一抗體，用ELISA法測定各個稀釋度的OD值，來確定試劑盒的最低檢測限度。
【文檔編號】G01N33/577GK104198715SQ201410465242
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月12日 優先權日:2014年9月12日
【發明者】王文琪, 馮玲倩, 王穎, 陳飛雄 申請人:青島農業大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
