快速鑒別烏天麻的方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及中藥材鑒別與品質評價【技術領域】，具體來說是一種快速鑒別烏天麻的方法及其應用，鑒別步驟包括(1)烏天麻樣品處理；(2)烏天麻標準待測溶液的制備；(3)烏天麻生化指紋圖譜的測定；(4)其它品種天麻生化指紋圖譜的測定和(5)生化指紋圖譜對比步驟；本發明操作非常簡單，可從眾多天麻品種中快速鑒別出烏天麻，相比較其他鑒別方法具有更高的靈敏性，解決了其他鑒別方法不能鑒別單一品種的技術缺陷，而且本發明方法所用試劑非常少，且試劑無毒。
【專利說明】快速鑒別烏天麻的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥材鑒別與品質評價【技術領域】，具體來說是一種快速鑒別烏天麻的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]天麻是古今醫家常用的名貴中藥，其入藥已有2000多年歷史，在東漢時期的“神農本草經”一書中就被列為上品。現在我國公布的34種名貴藥材中，天麻已被列入《瀕危動植物種國際貿易公約CITES》附錄藥用植物。從目前研究的情況來看，天麻中的主要成分天麻素，具有鎮靜、安神、促進受損腦組織恢復、緩解神經性頭痛等作用，對于治療高血壓病、腦血栓、腦動脈硬化引起的頭暈、頭脹、頭痛、目眩、肢體麻木以及心腦血管疾病引起的偏癱等療效明顯。
[0003]天麻Gastrodia elsta B1.屬于蘭科(Orchidaceae)天麻屬，多年生共生草本植物，別名赤箭、離母、離草、定風草、鬼督郵等。分布于熱帶、亞熱帶、溫帶及寒溫帶的山地。東起新西蘭、新喀里多尼亞島、西至馬達加斯加。南由澳大利亞、新西蘭北抵中國的東北、前蘇聯遠東地區。全世界約有20多種，我國已報道發現6個種，即天麻、原天麻、細天麻、南天麻、疣天麻和北插天天麻。其中，物種還包括6個變型和2個雜交種:烏天麻、綠天麻、黃天麻、黃天麻、毛天麻、卵果天麻、烏紅雜交天麻和紅烏交雜天麻。根據中華人民共和國國家標準GB19776-2005的要求，烏天麻只有簡單的感官指標(包括形狀、顏色、氣味等)、理化指標(包括天麻素含量、水分、灰分、酸不溶性灰分等)和衛生指標(包括農藥殘留、重金屬和二氧化硫、亞硝酸鹽含量等)，用這些指標我們根本無法判斷出天麻之間的差異。
[0004]CN200710035693.8 一種天麻藥材的鑒別方法，主要用于辨別天麻和天麻偽品，存在繁瑣、耗時、費用高，應用的有機試劑多；CN201010106834.2天麻生化指紋圖譜分類與品質鑒定技術及其應用都是利用高效液相法建立天麻的化學或生化指紋圖譜，設備要求高，鑒定技術流程和圖譜結果分析復雜，給實踐生產應用中帶來不便，此外還存在有害試劑多的缺點。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是針對上述技術存在的問題，提供一種快速鑒別烏天麻的方法及其應用，該方法不但操作簡單，而且可快速從各種品種的天麻樣品中鑒別出烏天麻。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0007](I)烏天麻樣品處理
[0008]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0009]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0010](2)烏天麻標準待測溶液的制備
[0011]在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到烏天麻標準待測過濾液；
[0012](3)烏天麻生化指紋圖譜的測定
[0013]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，測定條件為:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫，75 μ m未涂層彈性石英毛細管柱，得到烏天麻生化指紋圖譜，并將測定的烏天麻生化指紋圖譜中出現的面積大的4個峰順序編號；
[0014](4)其它品種天麻生化指紋圖譜的測定
[0015]按⑴~(3)步驟的方法,測定紅天麻、綠天麻、黃天麻和烏紅天麻生化指紋圖譜，并將測定的每個天麻品種的生化指紋圖譜中出現的面積大的4個峰順序編號； [0016](5)生化指紋圖譜對比
[0017]將每個天麻品種第4號峰面積與第I號峰面積進行相除得到面積比值，當比值為0.90 <比值≤I時，所測樣品即為烏天麻，當比值為0.1≤比值≤0.9時，則為其他品種天麻;
[0018]在進行不同天麻品種生化指紋圖譜測定時，每個天麻品種都會出現4個面積相對較大的峰，將每個天麻品種的第4號峰與第I號峰的面積，測算后利用第4號峰的面積比第I號峰的面積，當比值為0.90 <比值≤I時，所測樣品即為烏天麻，當比值為0.1 (比值^ 0.9時，則為其他品種天麻。
[0019]本發明的另一目的是提供一種用于快速鑒別烏天麻的緩沖液，它是由磷酸二氫鈉38.0g、磷酸氫二鈉5.04g和蒸懼水1000mL配置而成。
[0020]電泳時,將緩沖液稀釋5倍體積,利用0.45um濾膜過濾后使用。
[0021]與現有天麻的鑒別方法相比，本發明的有益技術效果是:本發明操作非常簡單，可從眾多天麻品種中快速鑒別出烏天麻，相比較其他鑒別方法具有更高的靈敏性，解決了其他鑒別方法不能鑒別單一品種的技術缺陷，而且本發明方法所用試劑非常少，且試劑無毒。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，下面將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動性的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
[0023]圖1是本發明實施實例I中烏天麻生化指紋圖譜；
[0024]圖2是本發明實施實例2中綠天麻生化指紋圖譜；
[0025]圖3是本發明實施實例3中紅天麻生化指紋圖譜；
[0026]圖4是本發明實施實例4中黃天麻生化指紋圖譜；
[0027]圖5是本發明實施實例5中烏紅天麻生化指紋圖譜。
【具體實施方式】
[0028]下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0029]實施實例I
[0030]一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0031](I)烏天麻樣品處理
[0032]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0033]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0034](2)烏天麻標準待測溶液的制備
[0035]在步驟I中稱取的樣品中加lmL，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到烏天麻標準待測過濾液；
[0036](3)烏天麻生化指紋圖譜的測定
[0037]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，CL1020毛細管電泳儀(北京彩陸)；紫外檢測器，未涂層彈性石英毛細管柱75 μ m IDX37/45cm(分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳條件:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫；磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉38.0g,與磷酸氫二鈉
5.04g，加水使成IOOOmL,稀釋5倍，0.45 μ m濾膜過濾后使用)，實驗前依次用0.1mol.L-1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗10,10，20min，樣品分析間隔依次用0.1mol.I71氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗3，2，3min，實驗結束后用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水沖洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的濾膜過濾，超聲脫氣3min，得到烏天麻生化指紋圖譜，圖譜中出現四個面積較大的峰(如圖1所示)，將測定的烏天麻圖譜中出現的面積較大的4個峰順序編號為1、2、3、4，并用第4號峰面積比第I號峰面積；結果見附圖1，經測算后第4號峰與第I號峰的面積比值為0.98。
[0038]實施實例2
[0039]一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0040](I)綠天麻樣品處理
[0041]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0042]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0043](2)綠天麻標準待測溶液的制備
[0044]在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到綠天麻標準待測過濾液；
[0045](3)綠天麻生化指紋圖譜的測定
[0046]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，CL1020毛細管電泳儀(北京彩陸)；紫外檢測器，未涂層彈性石英毛細管柱75 μ m IDX37/45cm(分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳條件:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫；磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉38.0g,與磷酸氫二鈉
5.04g，加水使成IOOOmL,稀釋5倍，0.45 μ m濾膜過濾后使用)，實驗前依次用0.1mol.L-1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗10,10，20min，樣品分析間隔依次用0.1mol.I71氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗3，2，3min，實驗結束后用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水沖洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的濾膜過濾，超聲脫氣3min，得到綠天麻生化指紋圖譜，圖譜中出現四個面積較大的峰(如圖2所示)，將測定的綠天麻圖譜中出現的面積較大的4個峰順序編號為1、2、3、4，并用第4號峰面積比第I號峰面積；結果見附圖2，經測算后第4號峰與第I號峰的面積比值為0.37。
[0047]實施實例3
[0048]一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0049](I)紅天麻樣品處理
[0050]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0051]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0052](2)紅天麻標準待測溶液的制備
[0053]在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到紅天麻標準待測過濾液；
[0054](3)紅天麻生化指紋圖譜的測定
[0055]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，CL1020毛細管電泳儀(北京彩陸)；紫外檢測器，未涂層彈性石英毛細管柱75 μ m IDX37/45cm(分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳條件:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫；磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉38.0g,與磷酸氫二鈉5.04g，加水使成IOOOmL,稀釋5倍，0.45 μ m濾膜過濾后使用)，實驗前依次用0.1mol.L-1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗10、10、20min，樣品分析間隔依次用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗3、2、3min，實驗結束后用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水沖洗IOmin,所用溶液使用前均用0.45 μ m的濾膜濾過；超聲脫氣3min,得到紅天麻生化指紋圖譜，圖譜中出現四個面積較大的峰(如圖3所示)，將測定的紅天麻圖譜中出現的面積較大的4個峰順序編號為1、2、3、4，并用第4號峰面積比第I號峰面積；結果見附圖2，經測算后第4號峰與第I號峰的面積比值為0.52。
[0056]實施實例4
[0057]一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0058](I)黃天麻樣品處理
[0059]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0060]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0061](2)黃天麻標準待測溶液的制備
[0062]在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到黃天麻標準待測過濾液；
[0063](3)黃天麻生化指紋圖譜的測定
[0064]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，CL1020毛細管電泳儀(北京彩陸)；紫外檢測器，未涂層彈性石英毛細管柱75 μ m IDX37/45cm(分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳條件:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫；磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉38.0g,與磷酸氫二鈉5.04g，加水使成1000mL,稀釋5倍，0.45 μ m濾膜過濾后使用)，實驗前依次用0.1mol.L-1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗10、10、20min，樣品分析間隔依次用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗3、2、3min，實驗結束后用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水沖洗lOmin，所用溶液使用前均用0.45 μ m的濾膜濾過；超聲脫氣3min，得到黃天麻生化指紋圖譜，圖譜中出現四個面積較大的峰(如圖4所示)，將測定的黃天麻圖譜中出現的面積較大的4個峰順序編號為1、2、3、4，并用第4號峰面積比第I號峰面積；結果見附圖2，經測算后第4號峰與第I號峰的面積比值為0.77。
[0065]實施實例5
[0066]一種快速鑒別烏天麻的方法，包括如下步驟:
[0067](I)烏紅天麻樣品處理
[0068]①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ；
[0069]②稱取鮮天麻100g，磨碎成漿后，準確稱取天麻樣品0.15g ；
[0070](2)烏紅天麻標準待測溶液的制備
[0071]在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到烏紅天麻標準待測過濾液；
[0072](3)烏紅天麻生化指紋圖譜的測定
[0073]采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，CL1020毛細管電泳儀(北京彩陸)；紫外檢測器，未涂層彈性石英毛細管柱75 μ m IDX37/45cm(分離長度/總長，河北永年銳灃色譜器件有限公司)；電泳條件:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫；磷酸鹽緩沖液(取磷酸二氫鈉38.0g,與磷酸氫二鈉
5.04g，加水使成1000mL,稀釋5倍，0.45 μ m濾膜過濾后使用)，實驗前依次用0.1mol.L-1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗10、10、20min，樣品分析間隔依次用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水、緩沖液依次沖洗3、2、3min，實驗結束后用0.1mol.L—1氫氧化鈉溶液、水沖洗IOmin,所用溶液使用前均用0.45 μ m的濾膜濾過；超聲脫氣3min,得到烏紅天麻生化指紋圖譜，圖譜中出現四個面積較大的峰(如圖5所示)，將測定的烏紅天麻圖譜中出現的面積較大的4個峰順序編號為1、2、3、4，并用第4號峰面積比第I號峰面積；結果見附圖2，經測算后第4號峰與第I號峰的面積比值為0.15。
[0074]上述實施實例生化指紋圖譜第4號峰面積與第I號峰面積比值如下表
[0075]
【權利要求】
1.一種快速鑒別烏天麻的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)烏天麻樣品處理 ①稱取干天麻100g，研磨成粉過60目篩后，準確稱取天麻樣品0.05g ； ②稱取鮮天麻100g，磨碎成衆后，準確稱取天麻樣品0.15g ； (2)烏天麻標準待測溶液的制備 在步驟I中稱取的樣品中加ImL純凈水，用超聲提取20min后得到提取液，將提取液倒入離心管中后置于高速冷凍離心機中離心，轉速為8800r/min，溫度為4°C，時間5min，取離心后的上清液用0.45 μ m的微孔濾膜過濾，得到烏天麻標準待測過濾液； (3)烏天麻生化指紋圖譜的測定 采用毛細管電泳儀將步驟2中得到的待測過濾液進行毛細管電泳，測定條件為:電壓20KV ;重力進樣IOcm高、40s ;檢測波長230nm ;溫度為室溫，75 μ m未涂層彈性石英毛細管柱，得到烏天麻生化指紋圖譜，并將測定的烏天麻生化指紋圖譜中出現的面積大的4個峰順序編號； (4)其它品種天麻生化指紋圖譜的測定 按(1)~(3)步驟的方法,測定紅天麻、綠天麻、黃天麻和烏紅天麻生化指紋圖譜,并將測定的每個天麻品種的生化指紋圖譜中出現的面積大的4個峰順序編號； (5)生化指紋圖譜對比 將每個天麻品種第4號峰面積與第I號峰面積進行相除得到面積比值，當比值為0.90<比值≤1時，所測樣品即為烏天麻，當比值為0.1≤比值≤0.9時，則為其他品種天麻。
2.一種用于快速鑒別烏天麻的電泳緩沖液，其特征在于，它是由磷酸二氫鈉38.0g、磷酸氫二鈉5.04g和蒸懼水1000mL配置而成。
【文檔編號】G01N27/447GK103954672SQ201410188457
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月6日 優先權日:2014年5月6日
【發明者】祁岑, 羅家剛, 程立君, 王德菊, 黃先敏, 熊汝琴, 楊順強 申請人:昭通學院
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
