国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

納米等離子體激元共振器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供納米等離子體激元共振器(NPR)，其包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤,具有結(jié)合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。NPR以高度重現(xiàn)性的方式將拉曼信號(hào)增強(qiáng)至6.1×1010倍，使得能夠在6pM(0.2ng/ml)的靈敏度下以3個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)范圍實(shí)時(shí)地進(jìn)行蛋白酶和酶活性如前列腺特異性抗原(paPSA)的快速檢測(cè)。對(duì)來(lái)自paPSA-陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞外液(ECF)的實(shí)驗(yàn)證明了在復(fù)雜的生物流體背景中的特異性檢測(cè)。這種方法提供了以非常小的樣品量檢測(cè)蛋白酶活性的快速、靈敏、精確且單步的手段。
【專利說(shuō)明】納米等離子體激元共振器
[0001] 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2008年11月3日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880123805. 8、發(fā)明名稱 為"具有超高靈敏度的使用納米等離子體激元共振器的實(shí)時(shí)單步生物測(cè)定"的發(fā)明專利申 請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003] 本申請(qǐng)要求2007年11月2日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 60/984, 859的優(yōu)先權(quán)， 其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
[0004] 政府支持的聲明
[0005] 本工作得到以下支持：NSF Nano-scale Science and Engineering Center(DMI-0327077)、NSFSST/Collaborative Research Program(DMI-0427679)、和 NASA Institute for Cell Mimetic Space Exploration(CMISE),以 Award No. NCC2-1364 ； NHLBI/NIH HL078534 和 NCI/NIH R1CA95393-01;DARPA 和 UCSF Prostate Cancer SPORE award(NIH Grant P50CA89520和P01CA072006)，以Contract no. DE-AC02-05CH11231，由美 國(guó)會(huì)泛源部授予，在University of California/Lawrence Berkeley National Laboratory〇
[0006] 參考序列表
[0007] 紙張形式序列表的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考，如附在說(shuō)明書后一樣。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0008] 本發(fā)明涉及使用單獨(dú)的納米等離子體激元共振器（nanoplasmonic resonator)和 納米等離子體激元共振器陣列檢測(cè)酶活性的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)的領(lǐng)域。本發(fā)明具 體涉及蛋白酶活性，例如用于前列腺癌診斷應(yīng)用的前列腺特異性抗原（PSA)和蛋白水解活 性PSA的檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0009] 最早在1928年開發(fā)的拉曼光譜已經(jīng)廣泛地用于表征分子性質(zhì)（Kazuo Nakamoto John R. Ferraro, Chris ff. Brown, Introductory Raman Spectroscopy,第二版（Elsevier Science，2003)。表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)通過(guò)靠近表面的增強(qiáng)電磁場(chǎng)顯著提高拉 曼信號(hào)（C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang 等，Anal Chem76 (1)，78 (2004) ;Α· E. Grow, L. L. Wood, J.L.Claycomb 等，J Microbiol Methods53 (2) ,221 (2003) ;K.Nithipatikom，M. J. McCoy, S.R.Hawi 等，Anal Biochem322 (2) ,198(2003) J.B. Jackson 和 N.J.Halas，P Natl Acad Sci USA101 (52) ,17930 (2004))。在粗糙金屬表面或分散的金屬納米顆粒聚集 體上進(jìn)行的SERS測(cè)量顯示對(duì)于下至單個(gè)分子水平的檢測(cè)的高達(dá)10 14的最高拉曼增強(qiáng)因子 (Katrin Kneipp, Harald Kneipp, Irving Itzkan 等，Current Science (Bangalore) 77 (7) ，915(1999) ;S. Nie 和 S. R. Emory, Science275(5303), 1102(1997))，但是這些測(cè)量經(jīng)常遭 受差的重現(xiàn)性（M.Moskovits, Reviews of Modern Physics57 (3) ,783 (1985))。為了改善 重現(xiàn)性，已經(jīng)開發(fā)了其它方法以高達(dá)108的重現(xiàn)性增強(qiáng)因子在大面積上制造由同質(zhì)特征組 成的SERS基底，所述方法包括金屬膠體納米顆粒的自組裝（R. G. Freeman，K. C. Grabar，Κ. J. Allison 等，Science267 (5204)，1629 (1995))、納米球平版印刷術(shù)（lithography) (NSL)和納米球上的金屬膜（MFON) (C. L. Haynes 和 R. P. Van Duyne, Journal of Physical Chemistry B107 (30)，7426 (2003))、拋光的金基底的電化學(xué)糙化（J. M Sylvia, ΙΑ. Janni, J. D. Klein 等， Analytical Chemistry72 (23) ， 5834 (2000)) 和 使用電 子束平 版印刷術(shù)的周期結(jié)構(gòu)化的金屬基底（M. Kahl, E. Voges, S. Kostrewa等，Sensors and Actuators B-Chemical51 (1-3)，285 (1998))。雖然這些努力導(dǎo)致 SERS 分析成功用 于許多有前途的應(yīng)用中，但是缺少在特定位置制造 SERS熱點(diǎn)的能力限制了對(duì)于非常 小的樣品量的應(yīng)用，所述有前途的應(yīng)用包括基因和蛋白質(zhì)鑒別（Y. C. Cao, R. C. Jin，J. M.Nam 等，J Am Chem Socl25(48)，14676(2003) ;Y.W.C.Cao，R.C.Jin 和 C.A.Mirkin，S cience297 (5586) ,1536 (2002) ;T.Vo_Dinh，F(xiàn).Yan 和 M.B.Wabuyele，Journal of Raman Spectroscopy36 (6-7)，640 (2005))、生物戰(zhàn)劑檢測(cè)（D. A. Stuart, K. B. Biggs 和 R. P. Van Duyne, Analystl31 (4) ,568 (2006))和實(shí)時(shí)葡萄糖監(jiān)測(cè)（O.Lyandres，N.C. Shah, C. R. Yonzon 等，Analytical Chemistry77 (19)，6134 (2005))。
[0010] 為了克服這種限制，我們最近開發(fā)了可調(diào)的納米等離子體激元共振器（NPR)，其由 夾在引入本文作為參考的 Durant S.Su K, Steel M.J·，Xiong Y. Sun C, Zhang X，Journal of Physical Chemistry B110(9), 3964(2006)中所述的金屬納米盤之間的薄5;[02層組成。 可通過(guò)改變介電層厚度和NRP的縱橫比精確地調(diào)控共振頻率。在對(duì)于單獨(dú)的SERS基底或 納米顆粒所得的最大值之中，個(gè)別NPR可增加拉曼強(qiáng)度至6. 1 X 101°倍。使用已經(jīng)確立的 (well established)納米平版印刷術(shù)方法制造，基于NPR的方法使得能夠在所需位置以小 得多的尺度可重現(xiàn)地制造 SERS熱點(diǎn)，容許多重的（多路的，multiplexed)高通過(guò)量檢測(cè)和 芯片上的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。
[0011] 前列腺癌生物標(biāo)記物前列腺特異性抗原（PSA)，一種激肽釋放酶（hK)家族絲氨 酸蛋白酶（S. R. Denmeade 和 J. T. Isaacs, BJU Int93Suppll, 10 (2004) ;J. A. Clements, N. M.Willemsen,S.A.Myers 等，Crit Rev Clin Lab Sci41(3), 265(2004))用作本申請(qǐng)中 的模型蛋白酶。通常使用的前列腺特異性抗原（PSA)血液測(cè)試已經(jīng)被廣泛地用于前列 腺癌（最主要的男性癌癥）的早期診斷和處理（H.Gronberg，Lancet361(9360)，859(200 3) ;S.R.Denmeade 和 J.T.Isaacs，Nat Rev Cancer2(5)，389(2002))。然而，血清 PSA 濃 度更經(jīng)常地反映良性前列腺增生（BPH)的存在，而不是癌癥（A.Caplan和A.Kratz，Am J Clin Patholll7Suppl，S104 (2002) ;Ε·Ι· Canto, S.F. Shariat 和 K.M.Slawin，Cu;rr Urol Rep5(3)，203(2004))。特異性的缺乏導(dǎo)致高的假陽(yáng)性率并且經(jīng)常導(dǎo)致昂貴的 用于診斷的前列腺針吸活組織檢查和活組織檢查后的并發(fā)癥（complication))以及 相當(dāng)大的焦慮（M.B.Gretzer 和 A.W. Partin, Urol Clin North Am30 (4) ,677 (2003); A.Haese，M.Graefen，H.Huland 等，Curr Urol Rep5(3)，231(2004))。最近的研究已經(jīng) 鑒定了 一類高度特異性的肽，其可在異種移植模型（S. R. Denmeade, C. M. Jakobsen, S. Janssen等，J Natl Cancer Inst95 (13) ,990 (2003))和人類樣品（P.Wu，U.H.Stenman，M. Pakkala 等，Prostate58 (4) ,345 (2004) ;P.Wu，L.Zhu，U.H.Stenman 等，Clin Chem50(l)，125(2004))中被paPSA同種型（isoform)切割，因此，來(lái)自體內(nèi)樣品的paPSA 蛋白酶活性的測(cè)量是可能的，并且作為前列腺癌的更特異性的篩選劑（掩蔽劑，screening agent)和在復(fù)發(fā)性疾病的檢測(cè)中是潛在有價(jià)值的。然而，基于免疫肽分析（IMPA)的報(bào)道 結(jié)果顯示出低的熒光信噪比，妨礙在臨床上重要的60?300pM范圍內(nèi)較低的濃度下的可 靠測(cè)量（P. Wu, U. H. Stenman, M. Pakkala 等，Prostate58 (4)，345 (2004) ;P. Wu, L. Zhu，U. H. Stenman等，Clin Chem50(l)，125(2004))。此外，通常從細(xì)針吸活組織檢查或循環(huán)細(xì)胞 捕獲中分離有限數(shù)量的前列腺癌細(xì)胞（〈1000)。不存在對(duì)于臨床分期可以在少量細(xì)胞上進(jìn) 行paPSA蛋白酶活性測(cè)定的商業(yè)化方法。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供容許以非常少的 樣品量進(jìn)行用于前列腺癌檢測(cè)的paPSA的特異性和靈敏的測(cè)量的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供使用由納米等離子體激元共振器（NPR)組成的納米傳感器以至 少皮摩爾靈敏度在體外和原位檢測(cè)和測(cè)量酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物結(jié)合的 (bioconjugated) NPR增強(qiáng)在表面增強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠 以非常小的量靈敏地單步檢測(cè)酶活性。
[0013] 在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺(tái)的 納米傳感器。所述平臺(tái)包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米 等離子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器（NPR)具有與其結(jié)合的生 物分子（biomolecule)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述NPR包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤， 具有結(jié)合或束縛（tether)到所述NPR表面的被標(biāo)記的生物分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述標(biāo)記物是拉曼活性標(biāo)記物。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述肽包 括可被特異性修飾或者通過(guò)酶切割的特異性序列。因此，這種肽結(jié)合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關(guān)于酶例如蛋白酶、激酶和肽酶的存在、濃度和活 性的信息。在一個(gè)實(shí)施方式中，篩選將測(cè)量在生物樣品中癌生物標(biāo)記例如前列腺特異性抗 原（PSA)的活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述肽應(yīng)為被待檢測(cè)的相應(yīng)酶特異性識(shí)別、修飾和/ 或發(fā)揮作用的底物。
[0015] 在另一實(shí)施方式中，實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)還提供關(guān)于酶活性的關(guān)鍵（臨界，critical)信 息，而不是僅測(cè)量蛋白質(zhì)的存在?？墒褂貌煌睦鼧?biāo)記物分子，使得可通過(guò)多重肽結(jié)合的 NPR進(jìn)行兩種或更多種類型酶的檢測(cè)。而且，在基底上的肽結(jié)合的NPR的陣列描述用于進(jìn)一 步放大或擴(kuò)展檢測(cè)。
[0016] 在另一實(shí)施方式中，彼此正交或者具有特異性的較小重疊的不同生物分子底物可 用于檢測(cè)相應(yīng)的酶。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物分子庫(kù)可與NPR結(jié)合并且以無(wú)規(guī)陣列或有序 的微陣列形式空間分離。生物分子-納米等離子體激元共振器的多重陣列可用于同時(shí)檢測(cè) 多種酶。
[0017] NPR也可通過(guò)激光或磁場(chǎng)操作以在空間上以高精確度尋址（address)，使得其可 多重化為高密度陣列（具有亞微升容量）。以微陣列或納米陣列形式的用于多種蛋白酶的 另外的空間多重化是預(yù)期的。另外，磁場(chǎng)或激光操縱性容許在所需的位置處生物傳感，這對(duì) 于在細(xì)胞內(nèi)得到原位測(cè)量是有用的。
[0018] 在另一實(shí)施方式中，本文中所述的納米傳感器可集成到微流體系統(tǒng)或其他芯片系 統(tǒng)中。在一個(gè)實(shí)施方式中，基于納米傳感器的測(cè)定可以液相進(jìn)行，其中樣品與NPR納米傳感 器或NPR陣列接觸，和可進(jìn)行SERS測(cè)量。
[0019] 更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及如下方面。
[0020] 1.納米等離子體激元共振器（NPR)，包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤，具有結(jié) 合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。
[0021] 2.根據(jù)1的共振器，其中所述標(biāo)記物是用于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)檢測(cè)的拉曼 活性標(biāo)記物。
[0022] 3.根據(jù)1的共振器，其中所述標(biāo)記物是熒光或其它能檢測(cè)的標(biāo)記物。
[0023] 4.根據(jù)1的共振器，其中所述納米盤包括金屬薄層、半導(dǎo)體材料、金屬多層、金屬 氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料。
[0024] 5.根據(jù)4的共振器，其中所述納米盤由金屬組成。
[0025] 6.根據(jù)1的共振器，其中所述屏蔽層包括具有恒定拉曼光譜的材料。
[0026] 7.根據(jù)6的共振器，其中所述屏蔽層選自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
[0027] 8.根據(jù)1的共振器，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
[0028] 9.根據(jù)1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
[0029] 10.納米等離子體激元共振SERS檢測(cè)平臺(tái)，包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表 面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米等離子體激元共振器（NPR)的圖案化基底，其中所述納米等離 子體激元共振器具有與其結(jié)合的生物分子。
[0030] 11.根據(jù)10的平臺(tái)，其中其上圖案化所述納米等離子體激元共振器的基底可由石 英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜的任意其它材料組成。
[0031] 12.根據(jù)10的平臺(tái)，其中所述納米等離子體激元共振器包括具有交替屏蔽層的金 屬納米盤，具有結(jié)合或束縛到所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子， 其中所述標(biāo)記物是用于SERS檢測(cè)的拉曼活性標(biāo)記物。
[0032] 13.根據(jù)12的平臺(tái)，其中所述納米盤包括金或銀的薄層。
[0033] 14.根據(jù)12的平臺(tái)，其中所述屏蔽層包括二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、或右旋 糖酐。
[0034] 15.根據(jù)10的平臺(tái)，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
[0035] 16.根據(jù)10的平臺(tái)，其中所述陣列形式的納米等離子體激元共振器是相同或不同 的。
[0036] 17.根據(jù)15的方法，其中生物分子庫(kù)與所述納米等離子體激元共振器結(jié)合并且以 無(wú)規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
[0037] 20.用于使用納米傳感器以至少皮摩爾靈敏度體外檢測(cè)和測(cè)量酶活性的方法，所 述納米傳感器包括納米等離子體激元共振器（NPR)，其中所述NPR增強(qiáng)在表面增強(qiáng)拉曼光 譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測(cè)酶活性。
[0038] 21.用于酶活性的實(shí)時(shí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)的方法，包括：
[0039] (a)提供在基底上圖案化的肽結(jié)合的納米等離子體激元共振器陣列，其中各納米 等離子體激元共振器（NPR)包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤并且具有結(jié)合或束縛到所 述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子，其中所述標(biāo)記物是拉曼標(biāo)記物 分子，各自相同或不同，和其中各個(gè)肽包括通過(guò)特異性酶使用特異性反應(yīng)識(shí)別和修飾的序 列；
[0040] (b)提供懷疑含有酶的生物樣品；
[0041] (c)使所述樣品與所述納米等離子體激元共振器陣列接觸；
[0042] ⑷使所述反應(yīng)進(jìn)行；
[0043] (e)通過(guò)SERS檢測(cè)測(cè)量所述酶的檢測(cè)。
[0044] 22.根據(jù)21的方法，其中生物分子庫(kù)可與所述納米等離子體激元共振器結(jié)合并且 以無(wú)規(guī)陣列或有序的微陣列形式空間分離。
[0045] 23.根據(jù)22的方法，其中所述生物分子-納米等離子體激元共振器的陣列可用于 同時(shí)檢測(cè)多種酶的活性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0046] 圖1 :使用肽結(jié)合的NPR SERS納米傳感器檢測(cè)PSA蛋白酶活性的工作原理的示意 性圖解。（a)NPR通過(guò)耦合的等離子體激元共振呈現(xiàn)出可調(diào)的等離子體激元共振和高度增強(qiáng) 的局部電磁場(chǎng)。短軸150nm和長(zhǎng)軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和Si0 2層的 多重疊層制成。（b)由拉曼染料R19、PSA特異性肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID N0:1)和半胱 氨酸組成的生物標(biāo)記的分子結(jié)構(gòu)。所述肽可通過(guò)PSA酶在HSSKLQ和LAAAC之間切割。（c) 用肽序列HSSKLQLAAAC(SEQ ID NO: 1)和拉曼染料R19 (星）官能化的NPR的檢測(cè)圖。PSA 酶的存在將切割所述肽序列。切割之后，通過(guò)R19部分的SERS標(biāo)志（signature)的消失監(jiān) 測(cè)R19(星）離開表面的擴(kuò)散。填充分子辛烷硫醇（HS-(CH 2)2-CH3)用于減小NPR表面上的 報(bào)告肽的填充密度，由此容許PSA酶達(dá)到所述報(bào)告肽。（d)使用標(biāo)準(zhǔn)電子束平版印刷術(shù)和薄 膜沉積方法制造的NPR陣列的光學(xué)顯微圖像。制造的NPR陣列由間隔500nm的30 X 30NPR 組成?？稍谙嗤幕咨媳憷刂圃於鄠€(gè)NPR陣列和對(duì)準(zhǔn)標(biāo)記。（e)通過(guò)掃描電子顯微鏡 測(cè)量的NPR陣列的放大圖像。使用精確平版印刷術(shù)方法，可以受控的方式制備NPR。（f)使 用原子力顯微鏡（AFM)在較高的放大率下測(cè)量的NPR圖像。（g)在425?650nm的波長(zhǎng)范 圍內(nèi)所測(cè)量的NPR陣列的消光光譜。已調(diào)節(jié)NPR的共振峰以緊密匹配激光激發(fā)和拉曼發(fā)射 頻率，并由此使拉曼信號(hào)的總體增強(qiáng)最大化。（h)在不同的NPR陣列上測(cè)量的結(jié)合在NPR表 面上的對(duì)巰基苯胺（PMA)分子的高度重現(xiàn)性拉曼光譜。積分時(shí)間為30秒。
[0047] 圖2 :PSA蛋白酶活性的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)測(cè)量。（a)對(duì)于在30分鐘內(nèi)所取的6nMPSA培養(yǎng) 的SERS光譜，積分時(shí)間為30秒。（b)對(duì)于在30分鐘內(nèi)所取的陰性對(duì)照6nM粒酶B的SERS 光譜。（c)添加 PSA蛋白酶之前和之后在131601^145601^1526(^1和1597CHT1處的拉曼 峰強(qiáng)度的相對(duì)變化的時(shí)間分辨的測(cè)量。負(fù)時(shí)間表示添加蛋白酶之前的時(shí)間。
[0048] 圖3 :通過(guò)改變活性PSA濃度的PSA活性的時(shí)間分辨的測(cè)量。（a)對(duì)于1316(^1峰 在6pM?6nM的活性PSA濃度下的歸一化的SERS強(qiáng)度變化?？汕宄販y(cè)量SERS強(qiáng)度的降 低，而在不含活性PSA蛋白酶的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中不能觀察到顯著的改變。（b) 30分鐘時(shí)獲得的 歸一化SERS強(qiáng)度變化與濃度的關(guān)系。（c)從未處理的細(xì)胞外流體（ECF)中獲得的蛋白酶 活性測(cè)量結(jié)果：在將LNCaP細(xì)胞（陽(yáng)性對(duì)照）ECF暴露于NPR納米傳感器開始時(shí)（t = 0分 鐘）和30分鐘之后所得的拉曼光譜。（d)在1316CHT1峰處的歸一化的SERS強(qiáng)度變化，表 示從LNCaP和K562細(xì)胞系中提取的流體中PSA蛋白水解活性。
[0049] 圖4 :使用拉曼檢測(cè)和光譜學(xué)的PSA檢測(cè)圖。
[0050] 圖5A :SERS顯微光譜學(xué)系統(tǒng)以及納米等離子體激元共振器目測(cè)和實(shí)時(shí)酶反應(yīng)檢 測(cè)。圖5B:光譜測(cè)量設(shè)備的示意圖。
[0051] 圖6(a)具有各個(gè)金屬層的單獨(dú)納米盤的模擬散射光譜。所述納米盤是圓形的，直 徑為90nm，而金屬層和Si0 2層的總厚度均保持為30nm。入射光的偏振在Y-軸方向偏振。 (b)共振頻率下單獨(dú)Au層納米盤（Si02/Au/Si0 2)的局部電場(chǎng)分布的Y-Z面橫截面。（c)共 振頻率下6Au層納米盤（Si02/Au) 6/Si02的局部電場(chǎng)分布的Y-Z面橫截面。

【具體實(shí)施方式】
[0052] 本發(fā)明證明使用由納米等離子體激元共振器（NPR)組成的納米傳感器以至少皮 摩爾靈敏度在體外檢測(cè)和測(cè)量酶活性。在一個(gè)實(shí)施方式中，生物結(jié)合的NPR增強(qiáng)表面增 強(qiáng)拉曼光譜學(xué)（SERS)中的拉曼光譜強(qiáng)度并且使得能夠以非常小的量靈敏地單步檢測(cè)酶活 性。
[0053] 小量性質(zhì)的主要優(yōu)點(diǎn)和應(yīng)用之一是其在單細(xì)胞水平上檢測(cè)癌細(xì)胞的蛋白酶例如 前列腺特異性抗原（PSA)的活性中是有用的。小量的要求和靈敏度水平使得可能在捕獲的 循環(huán)前列腺癌細(xì)胞中檢測(cè)PSA活性用于指示各種疾病狀態(tài)例如轉(zhuǎn)移，這是使用常規(guī)技術(shù)不 可行的。在精液中，PSA濃度為10?150 μ M，大約三分之二的PSA是酶活性的。使用NPR PSA探針實(shí)現(xiàn)的靈敏度水平（納摩爾范圍）足以進(jìn)行基于精液的測(cè)定，因此本文所述的納米 等離子體激元共振SERS平臺(tái)意圖具有臨床應(yīng)用。
[0054] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包括納米等離子體激元共振SERS平臺(tái)的納米 傳感器。所述平臺(tái)包括特征在于單獨(dú)的或陣列形式的表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)納米等離 子體激元共振器的基底，其中所述納米等離子體激元共振器（NPR)具有與其結(jié)合的生物分 子。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述NPR包括至少兩個(gè)具有交替薄屏蔽層的納米盤，和結(jié)合或束縛 到所述NPR的表面的被標(biāo)記的生物分子。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物是拉曼活性標(biāo) 記物。
[0055] 現(xiàn)有技術(shù)中已知潛在用于拉曼光譜學(xué)的各種檢測(cè)裝置并且可使用任意已知的拉 曼檢測(cè)裝置。拉曼檢測(cè)裝置的非限制性實(shí)例公開在美國(guó)專利No. 6, 002, 471中。在該實(shí)例 中，通過(guò)532nm (納米）波長(zhǎng)的Nd: YAG激光或者365nm波長(zhǎng)的Ti :藍(lán)寶石激光產(chǎn)生激發(fā)束。 可使用脈沖激光束或連續(xù)激光束。激發(fā)束通過(guò)共焦光學(xué)器件和顯微鏡物鏡，并且可聚焦在 含有連接的生物分子目標(biāo)物的基底上。可通過(guò)顯微鏡物鏡和共焦光學(xué)器件收集拉曼發(fā)射光 目標(biāo)，其耦合至用于光譜分離的單色器。所述共焦光學(xué)器件可包括用于減少背景信號(hào)的反 射鏡、二向色性濾光器、屏障濾光片、共焦針孔、和透鏡的組合。標(biāo)準(zhǔn)全場(chǎng)光學(xué)器件也可用作 共焦光學(xué)器件。
[0056] 可通過(guò)拉曼檢測(cè)器檢測(cè)拉曼發(fā)射信號(hào)。所述檢測(cè)器可包括與用于計(jì)算和數(shù)字化信 號(hào)的計(jì)算機(jī)接口的雪崩光電二極管。在待分析目標(biāo)陣列時(shí)，可設(shè)計(jì)光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)以檢測(cè)拉 曼信號(hào)和將拉曼信號(hào)定位到芯片或格子上的特定位置。例如，發(fā)射光可引導(dǎo)到CCD(電荷耦 合器件）照相機(jī)或在檢測(cè)區(qū)域內(nèi)能夠同時(shí)測(cè)量來(lái)自20個(gè)多重像素或像素組的光發(fā)射的其 它檢測(cè)器。
[0057] 各種激發(fā)源包括，但不限于，337nm的氮激光器（Laser Science Inc.)和325nm的 氦-鎘激光器（Liconox)(美國(guó)專利No. 6, 174, 677)。激發(fā)束可使用帶通濾光器30(Corion) 光譜純化并且可使用6 X物鏡（Newport，Model L6X)聚焦在基底140上。物鏡可用于激發(fā) 指示器和收集拉曼信號(hào)兩者，通過(guò)使用全息分束器（Kaiser Optical Systems, Inc.，Model HB647-26NI8)產(chǎn)生用于激發(fā)束和發(fā)射的拉曼信號(hào)的直角幾何形狀。全息陷波濾波器 (Kaiser Optical Systems, Inc.)可用于減小瑞利散射福射。供選擇的拉曼檢測(cè)器包括， 但不限于，配置有紅色增強(qiáng)強(qiáng)化電荷耦合器件（RE-ICXD)檢測(cè)系統(tǒng)的ISA HR-320攝譜儀 (Princeton Instruments)?？墒褂闷渌愋偷臋z測(cè)器，例如電荷注射器件、光電二極管陣 列或光電晶體管陣列。
[0058] 現(xiàn)在參考圖1A，NPR的納米級(jí)尺寸和高的局部電磁場(chǎng)增強(qiáng)使得能夠在其表面上高 靈敏度地光學(xué)檢測(cè)生物分子反應(yīng)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述納米等離子體激元共振器是 包括通過(guò)屏蔽層分離的至少兩個(gè)垂直堆疊的納米盤的平版印刷限定的金屬電介質(zhì)納米顆 粒。在各種實(shí)施方式中，NPR優(yōu)選通過(guò)電子束平版印刷術(shù)在基底上圖案化。
[0059] 其上NPR圖案化的基底可由石英、聚苯乙烯、硅石、右旋糖酐或具有恒定拉曼光譜 的任意其它材料組成。在一個(gè)實(shí)施方式中，為了防止電子束平版印刷術(shù)期間的帶電效應(yīng)，所 述基底進(jìn)一步涂布有層例如氧化銦錫。所述層可濺射、沉積、涂布或使用任意其它方法添加 到所述基底上以形成薄膜。在另一實(shí)施方式中，然后用聚合物旋涂所述基底以在曝光以產(chǎn) 生圖案之前產(chǎn)生正性光刻膠。在一個(gè)實(shí)施方式中，在曝光之后，使用溶劑混合物顯影圖案， 隨后進(jìn)行多層電子束蒸發(fā)和標(biāo)準(zhǔn)的剝離過(guò)程。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方式中，如實(shí)施例1所述制備NPR。在另一實(shí)施方式中，如以下所述制 備 NPR :Κ· H. Su, Q. H. Wei 和 X. Zhang, ''Tunable and augmented plasmon resonances of Au/Si02/Au nanodisks"，Appl. Phys. Lett. 88, 063118, 2006 ;以及 Kai-Hung Su，St6phane Durant, Jennifer M. Steele, Yi Xiong, Cheng Sun 和 Xiang Zhang, Raman Enhancement Factor of a Single Tunable Nanoplasmonic Resonator, Journal of Physical Chemistry B，110 (9)，3964 (2006)，這兩者的全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
[0061] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述納米等離子體激元共振器由層疊或堆疊有交替屏蔽層 的納米盤組成。例如，可在兩個(gè)金納米盤之間夾入Si0 2屏蔽層制備NPR。在另一實(shí)施方式 中，其間夾有Si02屏蔽層的兩個(gè)金納米盤在一端用另一 Si02屏蔽層覆蓋，從而產(chǎn)生Si02/ Au/Si02/Au納米等離子體激元共振器。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在圖案化基底上蒸發(fā)納米級(jí)層以形成NPR的納米盤層。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，各納米盤在其最寬點(diǎn)處為50?500nm。所述納米盤可由金屬薄層、半導(dǎo)體 材料、金屬多層、金屬氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料組成。在一些實(shí)施方式中，納米月 牙狀物（nanocrescent)包括選自 Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、 V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo 的金屬、及其氧化物、和 /或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或燒結(jié)基質(zhì)。
[0063] 屏蔽層材料可為具有恒定拉曼光譜的任意材料。所述屏蔽層起到NPR的等離子體 激元共振頻率的調(diào)節(jié)參數(shù)的作用。與單層金屬納米盤相比，多層納米盤呈現(xiàn)出若干獨(dú)特的 性質(zhì)，包括顯著增強(qiáng)的等離子體激元共振和可調(diào)的共振波長(zhǎng)，所述共振波長(zhǎng)可通過(guò)簡(jiǎn)單地 改變電介質(zhì)層厚度而修整到所需值同時(shí)保持顆粒直徑恒定。數(shù)值計(jì)算表明將一個(gè)金屬層分 為金屬多層導(dǎo)致較高的散射強(qiáng)度和更多的"熱點(diǎn)"或者強(qiáng)場(chǎng)增強(qiáng)區(qū)域。圖6顯示具有各個(gè) 金屬層的納米盤的顏色模擬散射光譜。
[0064] 因此，在另一實(shí)施方式中，NPR中各納米盤層可具有相同或不同的厚度。通過(guò)選擇 不同的層厚度，可以調(diào)節(jié)等離子體激元共振波長(zhǎng)和表面增強(qiáng)因子以匹配各種應(yīng)用。例如，在 實(shí)施例1中，短軸150nm和長(zhǎng)軸200nm的NPR由厚度分別為25nm和5nm的銀和Si02層的多 重疊層制成。而且，通過(guò)選擇性地屏蔽金屬結(jié)構(gòu)的外表面，可通過(guò)將分子集合體（assembly) 導(dǎo)向呈現(xiàn)出強(qiáng)電磁場(chǎng)的位置來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)效率。因此，在另一實(shí)施方式中，所述外層為包括 具有恒定拉曼光譜的材料的屏蔽層。圖1A顯示優(yōu)選納米等離子體激元共振器（NPR)的示 意圖和透射電子顯微照片。
[0065] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述生物分子是包括可通過(guò)蛋白酶特異性切割的特異性序列 的肽，其與拉曼活性標(biāo)記物連接。
[0066] 現(xiàn)有技術(shù)中已知各種拉曼標(biāo)記（例如，美國(guó)專利No. 5, 306, 403 ;6, 002, 471 ; 6, 174, 677,其引入本文作為參考）并且可使用任意這種已知的拉曼標(biāo)記。所述標(biāo)記典型 地具有特有的（例如，獨(dú)特的）和高度可見/可檢測(cè)的光學(xué)標(biāo)志。合適的拉曼標(biāo)記包括， 但不限于，熒光團(tuán)、生色團(tuán)、量子點(diǎn)、熒光微球、生物素等。在一些實(shí)施方式中，所述拉曼標(biāo) 記包括若丹明、熒光素、或外源化學(xué)分子。在一些實(shí)施方式中，所述拉曼標(biāo)記包括作為拉曼 標(biāo)記物的部分。標(biāo)記物分子的非限制性實(shí)例包括TRIT(四甲基若丹明異硫醇）、NBC(7-硝 基苯-2-氧雜-1，3-二唑）、德克薩斯紅染料、鄰苯二甲酸、對(duì)苯二甲酸、間苯二甲酸、甲 酚固紫、甲酚藍(lán)紫、燦爛甲酚藍(lán)、對(duì)氨基苯甲酸、赤蘚紅、生物素、異羥洋地黃毒苷、5-羧 基-4'，5' -二氯-2'，7'-二甲氧基突光素、5-羧基-2'，4'，5'，7'四氯突光素、5-羧基突 光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-10羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-若丹明、偶氮 甲堿、花青、黃嘌呤、琥珀酰熒光素、氨吖啶、和氰化物（CN)、硫醇（SH)、氯（el)、溴（Br)、甲 基、磷（P)、硫⑶、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有這些部分的化合物。在一些實(shí)施方式中，碳 納米管、量子點(diǎn)（參見，例如 Evident Technologies, Troy N.Y. ;Invitrogen/Molecular Probes, 15等）或者微球（例如突光微球（參見，例如來(lái)自InvitrogenIMolecular Probes 的Transfluosphres*)可用作拉曼標(biāo)記物。
[0067] 在各種實(shí)施方式中，一種或多種拉曼標(biāo)記（拉曼標(biāo)記物）可以與附著到NPR的生 物分子（例如，多肽）連接。這種拉曼標(biāo)記物的存在可以增強(qiáng)通過(guò)切割肽產(chǎn)生的拉曼信號(hào) 的變化。
[0068] 因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，這種拉曼標(biāo)記的生物分子結(jié)合的納米等離子體激元 共振器意圖用作特異性篩選工具以提供關(guān)于生物樣品中酶和其它癌生物標(biāo)記例如前列 腺-特異性抗原（PSA)的存在、濃度和酶活性的信息。在一些實(shí)施方式中，所述生物分子是 肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換地用于指氨基酸殘基的聚合物。所述 術(shù)語(yǔ)應(yīng)用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨 基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。在一些實(shí)施方 式中，多個(gè)肽與納米月牙的表面結(jié)合，各自相同或不同。在各種實(shí)施方式中，約5?500,更 優(yōu)選約10?約400,還更優(yōu)選約20、30或40?約200、250或300,和最優(yōu)選約50?約150 個(gè)底物分子（例如肽）與納米月牙狀物連接。在一個(gè)實(shí)施方式中，約100個(gè)肽以Au與肽上 的硫醇基團(tuán)之間的直接反應(yīng)15結(jié)合至納米月牙狀物。
[0069] 其活性受到監(jiān)測(cè)的酶可以包括，但不限于，酶、蛋白酶、激酶、肽酶或其它生物分 子。在各種實(shí)施方式中，所述生物分子是被待檢測(cè)的相應(yīng)酶特異性識(shí)別和修飾或切割的肽。 在另一實(shí)施方式中，所述生物分子是被待檢測(cè)的激酶特異性識(shí)別和磷酸化的肽。各種類型 的蛋白酶和通過(guò)這些蛋白酶特異性識(shí)別的肽也描述于名為"Detection of Protease and Protease Activity Using a Single Nanoscrescent SERS Probe" 的共審未決國(guó)際申請(qǐng) No. PCT/US2007/010722中。使用納米月牙探針用于蛋白酶或其它生物分子的SERS檢測(cè)的 相關(guān)方法也描述于PCT/US2007/010722中，其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考。
[0070] 在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述生物分子是肽，其中所述肽是長(zhǎng)度約10?12個(gè)氨基酸 殘基的寡肽。然而，所述肽可短至4個(gè)氨基酸殘基，和長(zhǎng)至100個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述肽應(yīng)為被相應(yīng)酶特異性識(shí)別和修飾的序列。所述肽可合成和商業(yè)上得到，或者所述 肽可以根據(jù)實(shí)施例1中所述方法制備。拉曼活性分子例如生物素或若丹明6G(R19)(圖1B) 優(yōu)選通過(guò)短的聚乙二醇或氨基戊酸連接物接枝在所述肽的氨基末端。
[0071] 所述生物分子可直接地或者經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)連接劑"結(jié)合"（即連接）到所述納米 等離子體激元共振器。本文中使用的"連接劑"是指在NPR和生物分子之間形成鍵且包括例 如官能團(tuán)、親和劑、或穩(wěn)定化基團(tuán)的任意化合物。合適的鍵包括離子相互作用，共價(jià)化學(xué)鍵， 物理力例如范德華或疏水相互作用，包封作用，包埋，結(jié)合親和力，吸引或認(rèn)可，和各種類型 的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)連接，所述連接包括，但不限于，肽、醚、酯、丙烯?；╝cryl)、醛、酮、丙 烯酰基（acryloyl)、硫醇、羧基、輕基、巰基和胺連接等。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方式中，數(shù)百種肽通過(guò)NPR的金屬納米盤與所述肽上的硫醇基之間的 直接反應(yīng)與所述NPR結(jié)合。在另一實(shí)施方式中，NPR金屬表面還可使用胺或羧基改性，從而 所述肽可以通過(guò)肽鍵經(jīng)由與異雙官能交聯(lián)劑的反應(yīng)束縛到NPR表面上，其中所述異雙官能 受聯(lián)劑可與胺基和硫醇基兩者反應(yīng)，或者與竣基和硫醇基兩者反應(yīng)。在【具體實(shí)施方式】中， Au/Si02/Au/Si02NPR可以使用胺或羧基官能團(tuán)官能化，和所述肽可經(jīng)由交聯(lián)劑與胺和羧基 官能團(tuán)交聯(lián)。各種交聯(lián)劑可用于硫醇活化的肽和NPR上表面官能團(tuán)例如胺、羧基和羥基的 結(jié)合。
[0073] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，依靠 Au_硫醇反應(yīng)以形成共價(jià)鍵，使用在肽羧基末端 的半胱氨酸基團(tuán)以將所述肽連接到Au表面將底物肽束縛到Au/Si02/Au NPR的表面上。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，類似地將多個(gè)肽結(jié)合到NPR的表面，各自相同或不同。
[0074] 本文中所述的NPR指示物可利用包括用于需要檢測(cè)的任意蛋白酶的一個(gè)或多個(gè) 識(shí)別位點(diǎn)的多肽序列。蛋白酶（蛋白水解活性）不僅對(duì)于維持正常的細(xì)胞功能是需要的， 而且對(duì)于各種人類疾病的發(fā)病也是重要的。寄生蟲感染（例如血吸蟲病和瘧疾）、真菌感染 (例如白念珠菌（C. albicans))和病毒感染（例如HIV、皰疹和肝炎）以及癌癥、炎癥疾病、 呼吸系統(tǒng)疾病、心血管疾病和包括阿爾茨海默病的神經(jīng)變性疾病需要蛋白水解活性用于進(jìn) 展。因此蛋白酶存在、量或活性的檢測(cè)作為用于疾病的存在或可能性的診斷/預(yù)示標(biāo)志是 有用的。另外，蛋白酶活性（或者其抑制）的檢測(cè)在篩選用于治療許多病狀的蛋白酶抑制 劑療法中是有用的。
[0075] 可根據(jù)本發(fā)明檢測(cè)和/或定量的"蛋白酶"是典型地使位于多肽鏈中一對(duì)氨基 20酸之間的肽鍵水解的酶，也稱作內(nèi)切蛋白酶。典型地參考酶催化中心的親核物質(zhì)來(lái)限 定蛋白酶。最通常的親核物質(zhì)來(lái)自絲氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸的側(cè)鏈，產(chǎn)生蛋白酶家族 例如絲氨酸蛋白酶（Paetzel等（1997)Trends Biochem. Sci.22:28_31)、天冬氨醜蛋白酶 (Spinelli 等（1991)Biochemie73:1391-251396)、和半胱氨酸蛋白酶（Altschuh 等（1994) Prot. Eng. 7:769-75, 1994)。金屬蛋白酶通常在催化位點(diǎn)含有鋅催化金屬離子（Klimpel等 (1994)Mol. Microbiol. 13:1093-1100)。
[0076] "蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)"是通過(guò)肽鍵連接的鄰接氨基酸序列，其含有一對(duì)通過(guò)由特定 蛋白酶水解的肽鍵連接的氨基酸。任選地，蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)可包括在待水解肽鍵任一側(cè) 的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，其也結(jié)合有所述蛋白酶的催化位點(diǎn)（Schecter and Berger, (1967) Biochem. Biophys. Res. Commun. 27:157-62)，或者蛋白質(zhì)底物上的識(shí)別位點(diǎn)和切割位點(diǎn)可 為通過(guò)一個(gè)或多個(gè)（例如2?4個(gè)）氨基酸分離的兩個(gè)不同位點(diǎn)。
[0077] 蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)中的氨基酸的特異性序列典型地取決于蛋白酶的催化機(jī)理，其通 過(guò)蛋白酶活性位點(diǎn)處的官能團(tuán)性質(zhì)所限定。例如，胰蛋白酶水解其羰基官能由賴氨酸或精 氨酸殘基貢獻(xiàn)的肽鍵，而不管多肽鏈的長(zhǎng)度或氨基酸序列。然而，因子X(jué)a識(shí)別特異性序列 Ile-Glu-Gly-Arg并且水解在Arg的C末端側(cè)上的肽鍵。各種優(yōu)選的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括， 但不限于，對(duì)于來(lái)自絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，或者對(duì)于金屬蛋白酶 的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，或者對(duì)于來(lái)自半胱氨酸蛋白酶家族、和/或天冬氨酸蛋白酶家族、和/ 或谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的絲氨酸蛋白 酶識(shí)別位點(diǎn)包括，但不限于，對(duì)于類似糜蛋白酶的蛋白酶、和/或類似枯草桿菌蛋白酶的蛋 白酶、和/或α/β水解酶、和/或信號(hào)肽酶的識(shí)別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選的金屬 蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)包括，但不限于，對(duì)于金屬羧基肽酶或金屬內(nèi)肽酶的識(shí)別位點(diǎn)。說(shuō)明性的蛋 白酶和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)如下表1所示。
[0078] 表1.說(shuō)明性的蛋白酶和蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)（*表示水解的肽鍵）
[0079]

【權(quán)利要求】
1. 納米等離子體激元共振器，包括具有交替屏蔽層的金屬納米盤，具有結(jié)合或束縛到 所述納米等離子體激元共振器的表面的被標(biāo)記的生物分子。
2. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述標(biāo)記物是用于表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS)檢測(cè)的拉曼 活性標(biāo)記物。
3. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述標(biāo)記物是熒光或其它能檢測(cè)的標(biāo)記物。
4. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述納米盤包括金屬薄層、半導(dǎo)體材料、金屬多層、金屬 氧化物、合金、聚合物、或碳納米材料。
5. 權(quán)利要求4的共振器，其中所述納米盤由金屬組成。
6. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述屏蔽層包括具有恒定拉曼光譜的材料。
7. 權(quán)利要求6的共振器，其中所述屏蔽層選自二氧化硅、石英、聚苯乙烯、硅石、和右旋 糖酐。
8. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述生物分子是與拉曼活性標(biāo)記物連接的肽，其中所述 肽包括可被酶特異性修飾或者切割的特異性序列。
9. 權(quán)利要求1的共振器，其中所述生物分子是肽R6G-Ava-HSSKLQLAAAC-NH2(SEQ ID N0:1)。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK104155282SQ201410331906
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2008年11月3日 優(yōu)先權(quán)日:2007年11月2日
【發(fā)明者】陳帆青, 喬納森.A.埃爾曼, 張祥, 孫誠(chéng), 蘇凱宏, 韋齊和 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)