一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬醫(yī)學檢驗領域，本發(fā)明的目的在于提供一種可以準確測定血漿或血清樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，本發(fā)明的方法可用于準確、簡便、快速地評價白血病患者治療藥物門冬酰胺酶的體內藥效。本發(fā)明采用液質聯(lián)用質譜儀來測定血漿或血清樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度，該方法包括：A、空白基質處理；B、待測血漿或血清樣品的前處理；C、待測血漿或血清樣品的分離與分析。
【專利說明】一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬醫(yī)學檢驗領域，具體涉及一種液質聯(lián)用測定體內內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法。
【背景技術】
[0002]門冬酰胺酶(L-asp)治療急性淋巴細胞白血病(ALL)已經有30多年的歷史，各國研究報道ALL誘導方案中添加L-asp能夠提高完全緩解率(CR)和治愈率，特別是急性B淋巴細胞白血病治療中5年無事件生存率可達到76-86%(參考文獻:l.Pui，C.H.，Carroll, W.L.，Meshinchij S.，Mrcecij R.J.Biology, risk stratification, andtherapy of pediatric acute leukemias: An update.Journal of ClinicalOncology, 2011; 29 (5):551-565.2.中國臨床腫瘤學會(CSCO)，中華醫(yī)學會血液學分會(CHS)，中華兒科血液學分會(CCHS).培門冬酶治療急性淋巴細胞白血病和惡性淋巴瘤的專家共識[J].臨床腫瘤學雜志，2013; 18(3):256-263.3.Rowe JM, Buck G，Burnett AK，et al.1nduction therapy for adults with acute lymphoblastic leukemia:resultsof more thanl500patients from the international ALL trial:MRC UKALLXIVECOGE2993 [J].Blood, 2005;106(12):3760-3767.)。
[0003]L-asp獨特作用機制在于水解血液中游離的門冬酰胺為L-門冬氨酸和氨，正常細胞含有門冬酰胺合成酶能合成足量門冬酰胺供自身生長，急性淋巴細胞等腫瘤細胞因缺乏門冬酰胺合成酶導致蛋白質合成障礙而細胞凋亡，從而達到靶向治療(參考文獻 4.Sara E.Shinnick, MSN, RN, et al.Managing Hypersensitivity to Asparaginasein Pediatrics, Adolescents, and Young Adults[J].Journal of Pediatric OncologyNursing, 2013; 30 (2):63 - 77.)。在治療ALL療效確切，現已成為不可以替代的聯(lián)合治療急性淋巴細胞白血病的一線藥物。
[0004]國內外測定內源性氨基酸的主要檢測方法，對氨基酸進行衍生處理后高效液相色譜熒光檢測器測定，操作步驟繁瑣，或者液質聯(lián)用測定，均有一定的弊端。標準曲線的配制時有采用純水溶解系列濃度氨基酸的或將血漿(血清)樣品稀釋幾倍后再溶解系列濃度氨基酸的，后者仍存在一定濃度內源性氨基酸。這些方法均無法得到不含內源性氨基酸的空白血漿，來準確測定體內門冬酰胺和谷氨酰胺濃度，特別是不能準確反映患者體內低濃度門冬酰胺和谷氨酰胺的動態(tài)變化，用于評價門冬酰胺酶在體內藥效。
[0005]目前國內外尚無文獻報道有關如何處理其他內源性氨基酸，得到空白基質用于標準曲線的配制，以達到準確測定血漿(血清)樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種可以準確測定血漿或血清樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，本發(fā)明的方法可用于準確、簡便、快速地評價白血病患者治療藥物門冬酰胺酶的體內藥效。
[0007]本發(fā)明的主要技術方案是:采用液質聯(lián)用質譜儀來測定血漿或血清樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度，為使測定出的數值準確，首先要解決的技術問題是如何得到不含內源性氨基酸的空白血漿或血清一即本發(fā)明的發(fā)明點之一“空白基質處理方法”；其次要解決的技術問題是如果待測的血漿或血清樣品中還含有門冬酰胺酶，則會影響待測的血漿或血清樣品中內源性氨基酸濃度的準確性，因此要盡快使待測的血漿或血清樣品中的門冬酰胺酶滅活一即本發(fā)明的發(fā)明點之一 “待測血漿或血清樣品的前處理方法”。
[0008]本發(fā)明提供了一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，該方法包括:
[0009]A、空白基質處理
[0010]將健康人體血漿或血清樣品加入門冬酰胺酶混勻，放置至少lOmin，待血漿或血清樣品里中的谷氨酰胺與門冬酰胺全部被消除干凈，加入微量濃H3PO4或HCL調節(jié)pH至3-5，加入胰酶混勻，放置IOmin以上，得空白基質。
[0011]本發(fā)明的空白基質處理方法，使健康人體血漿或血清樣品經過門冬酰胺酶處理后再用鹽酸或磷酸調節(jié)PH后加入胰酶使門冬酰胺酶失活，作為空白基質配制標準曲線，測定門冬酰胺和谷氨酰胺的濃度。
[0012]此空白基質可保存半個月至一個月，重復使用。
[0013]較佳地，所述的步驟A中，血漿或血清樣品我們以15ml為單位作為研究基礎，門冬酰胺酶量以100IU為宜，可大于該單位，濃H3PO4或HCL以100-200 μ I為佳，胰酶量取決于加入門冬酰胺酶的效價，建議10-100IU。
[0014]進一步地，本發(fā)明提供了一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，該方法包括步驟Α、空白基質處理，以及:
[0015]B、待測血漿或血清樣品的前處理
[0016]將待測(患者)血漿或血清樣品，加入微量濃H3PO4或HCL調節(jié)pH至3_5，加入胰酶混勻，放置IOmin以上，-80°C冰箱冷凍保存，或加入有機溶媒蛋白沉淀劑進行蛋白沉淀進行檢測。
[0017]本發(fā)明的待測血漿或血清樣品的前處理方法，使待測樣品中的門冬酰胺酶活性滅失，能準確測定待測樣品中內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺的濃度。
[0018]較佳地，所述的步驟B中，有機溶媒蛋白沉淀劑為80-90%甲醇或80-90%乙腈。
[0019]本發(fā)明的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，該方法在步驟A、空白基質處理，以及步驟B、待測血漿或血清樣品的前處理基礎上，可以采用本【技術領域】公知的高效液相色譜儀或液質聯(lián)用色譜儀來檢測待測血漿或血清樣品中的內源性氨基酸的濃度。
[0020]本發(fā)明所述的高效液相色譜儀或液質聯(lián)用色譜儀，可參考文獻:
[0021]5.Sai P.Bathenaaj Jiangeng Huangaj Adrian A.Epsteinbj et al.Rapid andreliable quantitation of amino acids and myo-1nositol in mouse brain by highperformance liquid chromatography and tandem mass spectrometry[J].Journal ofChromatography B，2012;893-894:15-20.[0022]6.J.J.Pesek, M.T.Matyska, J.A.Loo, et al.Analysis of hydrophilicmetabolites in physiological fluids by HPLC - MS using a silica hydride-basedstationary phase[J].J.Sep.Sc1.2009;(32):2200 - 2208.[0023]7.Katharina Diepoldl, Katrin Bomans, Michael ffiedmann, et al.SimultaneousAssessment of Asp Isomerization and Asn Deamidation in RecombinantAntibodies by LC-MS following Incubation at Elevated Temperatures[J].Plosone, 2012; 7 (I):e30295.等。
[0024]本發(fā)明的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，該方法還包括:
[0025]C、待測血漿或血清樣品的分離與分析
[0026]待測血漿或血清樣品經酸性流動相在水性液相色譜柱分離后，用質譜檢測器檢測內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度。
[0027]較佳地，所述的步驟C中，液相色譜條件:分析柱為Zorbax SB-AqC18Column (250 X 4.6mml.D., 5 μ m)色譜柱;流動相為甲醇-水(含 0.1% 甲酸):20-80 (V/V)；流速為0.5ml/min ;柱溫為20°C ;進樣量為I μ I。
[0028]所述的質譜檢測器，采用AB Sciex3200Qtrap，串聯(lián)質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；質譜條件:離子源為電噴霧離子源(ESI源)，噴霧電壓為5.5kV，離子傳輸毛細管溫度為5500C ；Gasl (N2)壓力為55Arb, Gas2 (N2)壓力為50Arb，簾氣(N2)壓力為120Arb ;碰撞氣(Ar)壓力為Medium ；DP電壓為30eV(谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸);CE電壓分別為24eV(谷氨酰胺)、22eV (門冬酰胺)和12eV (環(huán)絲氨酸);CXP電壓分別為3eV (谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸)；EP電壓分別為4eV (谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸)；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應監(jiān)測(MRM);用于定量分析的離子對分別為m/zl47.1 — m/z83.9 (谷氨酰胺)、m/zl33.1 — m/z73.9 (門冬酰胺)和m/zl02.9 — m/z75.1 (環(huán)絲氨酸);掃描時間為 0.2s。
[0029]與其他液相色譜或液質聯(lián)用檢測內源性氨基酸相比，本發(fā)明的方法的有益效果如下:
[0030]血漿或血清樣品經過門冬酰胺酶處理后得到不含內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺的空白血漿或血清樣品，從而能準確反應內源性氨基酸體內消除，也更接近真實的提取回收率和準確度。
[0031]鹽酸或磷酸調節(jié)pH至3-5后再加入胰酶使門冬酰胺酶失活，不影響門冬酰胺和谷氨酰胺加入后的穩(wěn)定性，同時能減少血樣在保存或檢測過程中產生時間斷門冬酰胺酶繼續(xù)消除門冬氨酸和谷氨酰胺濃度產生的誤差，更適合臨床白血病病人服用門冬酰胺酶后療效的監(jiān)測。
[0032]80-90%甲醇或乙腈蛋白沉淀保證了門冬酰胺和谷氨酰胺特別高濃度充分提取。
[0033]本發(fā)明的方法操作簡單、快速、靈敏、重復性好、分析周期短，不影響外源性門冬酰胺和谷氨酰胺加入后的穩(wěn)定性，適合臨床白血病病人服用門冬酰胺酶后療效的監(jiān)測。
[0034]本發(fā)明的方法無需昂貴的設備和試劑，血漿用量少，成本低等，適合常規(guī)治療藥物監(jiān)測。【專利附圖】
【附圖說明】
[0035]圖1是門冬酰胺酶效價與底物消除時間關系；
[0036]圖2是空白血漿的典型色譜圖；
[0037]圖3是經過預處理后得到的不含谷氨酰胺、門冬酰胺的空白血漿基質的典型色譜圖；
[0038]圖4是空白血漿+標準品谷氨酰胺、門冬酰胺和內標環(huán)絲氨酸的典型色譜圖；
[0039]圖5是服用門冬酰胺酶白血病患者的血漿的典型色譜圖；
[0040]其中峰1:環(huán)絲氨酸(內標)；峰2:門冬酰胺；峰3:谷氨酰胺。
【具體實施方式】
[0041]下面結合附圖及實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但本發(fā)明的實施不僅限于此。
[0042]下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043]液質條件:AB Sciex3200Qtrap,串聯(lián)質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；島津液相色譜儀，包括LC-20ADXR泵兩臺、D⑶-20A3在線脫氣儀、SIL-20ACCXR自動進樣器、CT0-20AC
柱溫箱。
[0044]液相色譜條件:分析柱為Zorbax SB-Aq C18Column (250 X 4.6mml.D.，5 μ m)色譜柱；流動相為甲醇-水(含0.1%甲酸):20-80 (V/V);流速為0.5ml/min ;柱溫為20°C ;進樣量為I μ I。`
[0045]質譜條件:離子源為電噴霧離子源(ESI源)，噴霧電壓為5.5kV，離子傳輸毛細管溫度為550°C；Gasl(N2)壓力為55Arb，Gas2 (N2)壓力為50Arb，簾氣(N2)壓力為120Arb ;碰撞氣(Ar)壓力為Medium ；DP電壓為30eV (谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸)；CE電壓分別為24eV (谷氨酰胺)、22eV (門冬酰胺)和12eV (環(huán)絲氨酸)；CXP電壓分別為3eV (谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸)；EP電壓分別為4eV (谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸)；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應監(jiān)測(MRM);用于定量分析的離子對分別為m/zl47.1 — m/z83.9 (谷氨酰胺)、m/zl33.1 — m/z73.9 (門冬酰胺)和 m/zl02.9 — m/z75.1 (環(huán)絲氨酸);掃描時間為0.2s。
[0046]實施例1:不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液對氨基酸提取率考察
[0047]血清樣品于室溫(20°C )下自然融化后取200 μ L加入800 μ L不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液，渦旋15秒后于IlOOOrpm離心7分鐘。轉移上清液后轉移至自動進樣器小瓶中，自動進樣器內20°C下等待進樣(每個血樣前處理過程均在3h內完成)。
[0048]表1不同比例甲醇-水或不同比例乙腈-水溶液對氨基酸提取率考察
[0049]
不 |sj 比 ^Sample!I Sample 2 I Sample 3Sample 4
frl[介和1 (峰面積) I (峰面積)(洚面積)(峰面積)
Asn Gin I Ass I Gln I Am Gto Asn I Gln溶_II[II
[0050]
【權利要求】
1.一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，該方法包括: A、空白基質處理 將健康人體血漿或血清樣品加入門冬酰胺酶混勻，放置至少lOmin，待血漿或血清樣品里中的谷氨酰胺與門冬酰胺全部被消除干凈，加入微量濃H3PO4或HCL調節(jié)pH至3-5，加入胰酶混勻，放置IOmin以上，得空白基質。
2.根據權利要求1所述的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，該方法還包括: B、待測血漿或血清樣品的前處理 將待測血漿或血清樣品，加入微量濃H3P04或HCL調節(jié)pH至3_5，加入胰酶混勻，放置IOmin以上，再加入有機溶媒蛋白沉淀劑進行蛋白沉淀。
3.根據權利要求1或2所述的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，該方法還包括: C、待測血漿或血清樣品的分離與分析 采用液相色譜和質譜聯(lián)用法來檢測待測血漿或血清樣品中的內源性氨基酸的濃度。
4.根據權利要求1或2所述的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，所述的步驟A中，血漿或血清樣品為15ml，門冬酰胺酶> 100IU，濃H3PO4 或 HCL 為 100-200 μ 1，胰酶為 10-100IU。
5.根據權利要求1或2所述的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，所述的步驟B中，有機溶媒蛋白沉淀劑為80-90%甲醇或80-90%乙月青。
6.根據權利要求1或2所述的一種液質聯(lián)用測定內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度的方法，其特征在于，該方法還包括: C、待測血漿或血清樣品的分離與分析 待測血漿或血清樣品經酸性流動相在水性液相色譜柱分離后，用質譜檢測器檢測內源性氨基酸門冬酰胺和谷氨酰胺濃度； 液相色譜條件:分析柱為Zorbax SB-Aq C18column250 X 4.6mml.D., 5 μ m色譜柱；流動相為甲醇-水含0.1%甲酸:20-80V/V ;流速為0.5ml/min ;柱溫為20°C ;進樣量為I μ I。 所述的質譜檢測器，采用AB Sciex3200Qtrap，串聯(lián)質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司；質譜條件:離子源為電噴霧離子源，噴霧電壓為5.5kV，離子傳輸毛細管溫度為550°C ；Gasl壓力為55Arb，Gas2壓力為50Arb，簾氣壓力為120Arb ;碰撞氣Ar壓力為Medium ；DP電壓為30eV谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸；CE電壓分別為24eV谷氨酰胺、22eV門冬酰胺和12eV環(huán)絲氨酸；CXP電壓分別為3eV谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸；EP電壓分別為4eV谷氨酰胺、門冬酰胺和環(huán)絲氨酸；正離子方式檢測；掃描方式為選擇反應監(jiān)測；用于定量分析的離子對分別為m/zl47.1 — m/z83.9谷氨酰胺、m/zl33.1 — m/z73.9門冬酰胺和m/zl02.9 — m/z75.1環(huán)絲氨酸；掃描時間為0.2s。
【文檔編號】G01N30/02GK103822981SQ201410061791
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年2月24日 優(yōu)先權日:2014年2月24日
【發(fā)明者】王卓, 張文靜, 高申, 萬思慧, 許孟雪, 丁雪鷹, 何金鳳, 丁楠 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
專業(yè)數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
