一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特點是：制作方法包括將組織細胞標本經沉淀、離心處理后，提取組織細胞標本并加入一種環保型生物合成劑，經超聲波組織處理儀或醫用微波爐對組織細胞標本同步進行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。本發明的優點是快速，無污染，操作簡便，染色過程可與日常工作一并進行，也可進行分子病理檢測，且結果穩定。提高了病理診斷的陽性檢出率及準確率。
【專利說明】一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于臨床病理診斷、科研領域中對細胞學檢測方法，具體說一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法。
【背景技術】
[0002]通過胸、腹水及淋巴液檢測腫瘤細胞是臨床病理診斷常用的檢測方法之一，目前采用較多的方法有涂片法、TCT、LCT等，其制作的細胞涂片分布均勻，形態清晰，陽性診斷率較高，但由于負載的腫瘤細胞少，可出現細胞成團、重疊、擠壓等現象，同時也不能滿足后期的免疫組化的鑒別診斷。經細胞蠟塊制作的切片細胞數量多，可連續切片，并可滿足免疫組化、分子病理檢測，滿足了臨床病理的需求。但常規制作時間需要3?5天，加上免疫組化時間往往需要5?7天才能拿到診斷報告。且在制作過程中因甲醛、二甲苯的揮發對人體產生一定的毒害。因此，目前的制作方法亟待改進。
[0003]如何提供一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，具有制作時間短，操作簡便，步驟少，結果穩定，陽性檢出率及準確率高，并減少污染環境。這是本發明面臨的技術問題。
【發明內容】
[0004]本發明為解決現有技術存在的上述問題，提供一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，具有制作時間短，操作簡便，步驟少，不易出差錯，結果穩定，陽性檢出率及準確率高，并減少環境污染。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案實現的:一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括將組織細胞標本經沉淀、離心處理后，提取組織細胞標本并加入一種環保型生物合成劑，經超聲波組織處理儀或醫用微波爐對組織細胞標本同步進行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
[0006]對上述技術方案的一種改進:所述的組織細胞標本為胸腔積液或腹腔積液，所述提取組織細胞標本的具體步驟如下:
(1)沉淀組織細胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液100?500ml放入干凈的器皿中，靜止1-2小時，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的組織細胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集組織細胞:棄去上清液，將底層的沉淀50?IOOml置于多個容積為5ml的試管中離心，離心轉速為2000?2500轉/分，離心時間為5-10分鐘，將上清液棄去，最后將所述多個試管內的組織細胞集中至一個試管中，直到獲得較多的組織細胞數量；
(3)凝固組織細胞:在最后沉淀組織細胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的組織細胞打散，再離心1-3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團的組織細胞放入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0007]對上述技術方案的進一步改進:對于離心后組織細胞數量少的標本:
(I)所述采集組織細胞步驟中，所述多個試管內的組織細胞集中至一個試管的形狀為錐形的試管，使用錐形試管再次離心1-3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與組織細胞混合，使較少的組織細胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細胞中加入無水酒精，1-3分鐘后取出半凝固狀的組織細胞放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將組織細胞包裹在內，起支撐固定作用。
[0008]對上述技術方案的另一種改進:所述的組織細胞標本為尿液、淋巴液或細胞懸液，具體步驟如下:
(1)離心采集組織細胞:先將大量的尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種，用大型離心機分多次離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個試管內離心，棄去上清液；淋巴液和細胞懸液因標本總量較少，但細胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加入熔點為45°C -52°C的5%瓊脂或5%蛋白，室溫下快速凝聚成團狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的組織細胞取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
[0009]對上述技術方案的進一步改進:所述的固定步驟之前增加預固定步驟，預固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫用微波爐中15分鐘；
所述固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細胞標本繼續放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環保型生物合成劑，溫度45°C，時間12分鐘，共3次；
浸蠟時間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行，以達到石蠟浸入組織細胞的目的；
所述二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團的組織細胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細胞蠟塊；如經過初次包埋的組織細胞，可將組織細胞標本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，已得到組織細胞數量的最大面積；
所述組織細胞切片步驟:將上述經石蠟包埋的組織細胞蠟塊在組織切片機上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(I)先將環保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘； (11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環保型中性快干膠封片；
對部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細胞懸液制成的蠟塊，根據診斷需求進行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復，按第一抗體選擇不同的修復液及修復方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風機吹干，經環保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0010]對上述技術方案的進一步改進:所述環保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫療設備有限公司生產。
[0011]對上述技術方案的進一步改進:所述環保透明脫蠟液為無錫市江源實業技貿公司生產。
[0012]本發明與現有技術相比的優點和積極效果是:
本發明通過與普通離心涂片法、TCT法進行比較，檢測腫瘤細胞三者間無顯著差異，但本發明獲得的腫瘤細胞比上兩種方法更多，且可行免疫組織化學染色，必要時行分子病理檢測，提高了臨床病理診斷的準確率。與其他細胞蠟塊制備方法比，染色結果無明顯差異，具有環保、時間短(一般僅需2天)，操作更簡便，步驟更少，制作面更廣為優勢，且不易出差錯，經臨床應用結果穩定。縮短了患者就診時間，提高了工作效率。切片染色背景清晰，與常規HE染色無差異，免疫組織化學定位準確，提高了細胞學病理診斷的準確率，特別是科研方面對養殖細胞爬片法無法行免疫組織化學染色提供良好的幫助。應用環保型生物合成劑制作標本減少了有害物質如二甲苯等對工作環境及人體的危害。【具體實施方式】
[0013]下面結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述:
本發明一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法的實施方式，制作方法包括將組織細胞標本經沉淀、離心處理后，提取組織細胞標本并加入一種環保型生物合成劑，經超聲波組織處理儀或醫用微波爐對組織細胞標本同步進行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
[0014]實施例1:本發明一種胸腔積液或腹腔積液細胞標本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(1)沉淀細胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液IOOml放入干凈的器皿中，靜止I小時，使胸腔積液或腹腔積液中的細胞自然沉降到器皿的底部；
(2)采集組織細胞:棄去上清液，將底層的沉淀約50ml置于10個容積為5ml的試管中離心，離心轉速為2000轉/分，離心時間為10分鐘，將上清液棄去，最后將所述10個試管內的組織細胞集中至一個試管中，直到獲得較多的組織細胞數量；
(3)凝固組織細胞:在最后沉淀組織細胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的細胞打散，再離心3分鐘，靜置15分鐘后將半凝固狀成團的細胞組織取出，入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0015]對于離心后組織細胞數量少的標本:
(1)所述采集組織細胞步驟中，所述10個試管離心后，將較少的組織細胞集中至一個形狀為錐形的試管內，使用錐形試管再次離心3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與細胞混合，使較少的細胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細胞中加入無水酒精，3分鐘后取出半凝固狀的細胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將細胞包裹在內，起支撐固定作用。
[0016]在固定步驟之前增加預固定步驟，預固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細胞標本繼續放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環保型生物合成劑，溫度45°C，時間12分鐘，共3次；
浸蠟時間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行，以達到石蠟浸入組織細胞的目的。
[0017]二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團的組織細胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細胞蠟塊；如經過初次包埋的組織，可將組織細胞標本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細胞數量的最大面積；
組織細胞切片步驟:將上述經石蠟包埋的組織細胞蠟塊在組織切片 機上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時間10?15分鐘。
[0018]所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(I)先將環保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預熱； (2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環保型中性快干膠封片。
[0019]對部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細胞懸液制成的蠟塊，根據診斷需求進行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環保透明脫蠟液放入58°c恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復，按第一抗體選擇不同的修復液及修復方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風機吹干，經環保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0020]實施例2:本發明一種胸腔積液或腹腔積液細胞標本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(I)沉淀細胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液500ml放入干凈的器皿中，靜止2小時，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的細胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集組織細胞:棄去上清液，將底層的沉淀IOOml置于10個容積為IOml的試管中離心，離心轉速為2500轉/分，離心時間為5分鐘，將上清液棄去，最后將所述10個試管內的組織細胞集中至一個試管中，直到獲得較多的組織細胞數量；
(3)凝固組織細胞:在最后沉淀組織細胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的細胞打散，再離心3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團的細胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中。
[0021]對于離心后組織細胞數量少的標本:
(1)所述采集組織細胞步驟中，所述10個試管離心后，將較少的組織細胞集中至一個形狀為錐形的試管內，使用錐形試管再次離心3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與細胞混合，使較少的細胞與蛋白相溶；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細胞中加入無水酒精，3分鐘后取出半凝固狀的細胞組織放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將細胞包裹在內，起支撐固定作用。
[0022]在固定步驟之前增加預固定步驟，預固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細胞標本繼續放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環保型生物合成劑，溫度45°C，時間12分鐘，共3次；
浸蠟時間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行，以達到石蠟浸入組織細胞的目的；
二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團的組織細胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細胞蠟塊；如經過初次包埋的組織，可將組織細胞標本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細胞數量的最大面積；
組織細胞切片步驟:將上述經石蠟包埋的組織細胞蠟塊在組織切片機上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(1)先將環保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I分鐘； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環保型中性快干膠封片；
對部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細胞懸液制成的蠟塊，根據診斷需求進行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環保型脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復，按第一抗體選擇不同的修復液及修復方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體；
(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風機吹干，經環保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0023]實施例3:本發明一種尿液、淋巴液或細胞懸液細胞標本石蠟包埋的制作方法，具體步驟如下:
(1)離心采集組織細胞:先將大量的尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種，用50ml離心管多個，在大型離心機上離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個5ml試管內再離心，棄去上清液；淋巴液和細胞懸液因標本總量較少，但細胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液；
(2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加入熔點為45°C -52°C的5%瓊脂，室溫下快速凝聚成團狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的細胞組織取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
[0024]在固定步驟之前增加預固定步驟，預固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫用微波爐中15分鐘；
固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細胞標本繼續放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環保型生物合成劑，溫度45°C，時間12分鐘，共3次；
浸蠟時間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行，以達到石蠟浸入組織細胞的目的；
二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團的組織細胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細胞蠟塊；如經過初次包埋的組織，可將組織細胞標本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，以得到細胞數量的最大面積；組織細胞切片步驟:將上述經石蠟包埋的組織細胞蠟塊在組織切片機上切成3?4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時間10?15分鐘；
所述染色包括HE染色和免疫組織化染色；
所述HE染色步驟如下:
(1)先將環保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液2分鐘；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蘇木素染色5-10分鐘；
(10)自來水沖洗2分鐘；
(11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍；
(12)自來水流水沖洗10分鐘；
(13)1%伊紅染色I分鐘；
(14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次；
(15)環保型中性快干膠封片；
對部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細胞懸液制成的蠟塊，根據診斷需求進行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下:
(1)切片前先將環保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預熱；
(2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘；
(3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘；
(4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘；
(5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液；
(6)95%乙醇沖洗2分鐘；
(7)80%乙醇沖洗2分鐘；
(8)自來水沖洗2分鐘；
(9)蒸餾水I分鐘；
(10)抗原修復，按第一抗體選擇不同的修復液及修復方式；
(11)蒸餾水I分鐘，至少3次；
(12)3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶；
(13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次；
(14)滴加第一抗體； (15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(16)滴加第二抗體；
(17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次；
(18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘，
(19)蘇木素淺染核后，吹風機吹干，經環保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
[0025]上述固定、脫水、透明、浸蠟工藝所用環保型生物合成劑由廣東省佛山市南海鈞鎰醫療設備有限公司生產，其主要成分為生物合成劑及脫水劑，不含甲醛和二甲苯，親水性和親脂性良好，無色無味，使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行。
[0026]上述環保透明脫蠟液為無錫市江源實業技貿公司生產。
[0027]當然，上述說明并非是對本發明的限制，本發明并不限于上述舉例，本【技術領域】的普通技術人員，在本發明的實質范圍內，作出的變化、改型、添加或替換，都應屬于本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.一種組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，制作方法包括將組織細胞標本經沉淀、離心處理后，提取組織細胞標本并加入一種環保型生物合成劑，經超聲波組織處理儀或醫用微波爐對組織細胞標本同步進行固定、脫水、透明、浸蠟處理，石蠟包埋組織切片、染色及封片。
2.按照權利要求1所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的組織細胞標本為胸腔積液或腹腔積液，所述提取組織細胞標本的具體步驟如下: (1)沉淀組織細胞:將抽取的胸腔積液或腹腔積液100~500ml放入干凈的器皿中，靜止1-2小時，使大量的胸腔積液或腹腔積液中的組織細胞自然沉降到器皿的底部； (2)采集組織細胞:棄去上清液，將底層的沉淀50~100mL置于多個容積為5ml的試管中離心，離心轉速為2000~2500轉/分，離心時間為5-10分鐘，將上清液棄去，最后將所述多個試管內的組織細胞集中至一個試管中，直到獲得較多的組織細胞數量； (3)凝固組織細胞:在最后沉淀組織細胞中加入10%中性緩沖甲醛，并用吸管將沉淀的組織細胞打散，再離心1-3分鐘，至少靜置15分鐘后將半凝固狀成團的組織細胞放入紗布中包好，放入包埋盒中。
3.按照權利要求2所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，對于離心后組織細胞數量少的標本: (1)所述采集組織細胞 步驟中，所述多個試管內的組織細胞集中至一個試管的形狀為錐形的試管，使用錐形試管再次離心1-3分鐘后，棄去上清液，加入少量的蛋白甘油，與組織細胞混合，使較少的組織細胞與蛋白相溶； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向組織細胞中加入無水酒精，1-3分鐘后取出半凝固狀的組織細胞放入紗布中包好，放入包埋盒中；無水酒精與蛋白凝固將組織細胞包裹在內，起支撐固定作用。
4.按照權利要求1所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的組織細胞標本為尿液、淋巴液或細胞懸液，具體步驟如下: (1)離心采集組織細胞:先將大量的尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種，用大型離心機分多次離心，棄去上清液，最后將沉淀物集中到一個試管內離心，棄去上清液；淋巴液和細胞懸液因標本總量較少，但細胞含量大，可直接放入試管中離心后棄去上清液； (2)所述包埋包括初次包埋和二次包埋，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加入熔點為45°C -52°C的5%瓊脂或5%蛋白，室溫下快速凝聚成團狀，放入紗布中包好放入包埋盒中，起支撐作用；或者，所述初次包埋是向所述尿液、淋巴液或細胞懸液中的一種組織細胞內加5%蛋清，用吸管打散后加入10%的中性緩沖甲醛，至少靜置15分鐘后，將已凝固的組織細胞取出放人紗布中包好放入包埋盒中。
5.按照權利要求3或4所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述的固定步驟之前增加預固定步驟，預固定步驟是將所述包埋盒放入裝有10%中性緩沖甲醛的脫水缸中，置入超聲波組織處理儀或醫用微波爐中15分鐘； 所述固定、脫水、透明、浸蠟步驟為:將固定好的組織細胞標本繼續放入超聲波組織處理儀或微波爐中，用環保型生物合成劑，溫度45°C，時間12分鐘，共3次； 浸蠟時間在溫度為62°C條件下10分鐘；使用環保型生物合成劑脫水、透明、浸蠟同時進行，以達到石蠟浸入組織細胞的目的；所述二次包埋步驟:將紗布中的組織取出，放入盛有液狀石蠟的包埋框中，將成團的組織細胞打散后均勻的平鋪在底部，待冷卻后制成組織細胞蠟塊；如經過初次包埋的組織細胞，可將組織細胞標本周圍凝固的瓊脂或蛋清去除，再行石蠟包埋，已得到組織細胞數量的最大面積； 所述組織細胞切片步驟:將上述經石蠟包埋的組織細胞蠟塊在組織切片機上切成3~4微米切片，溫度為65°C條件下，烤片時間10~15分鐘； 所述染色包括HE染色和免疫組織化染色； 所述HE染色步驟如下: (1)先將環保透明脫蠟液放入60°C恒溫干燥箱預熱； (2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘； (3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘； (4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘； (5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液2分鐘； (6)95%乙醇沖洗2分鐘； (7)80%乙醇沖洗2分鐘； (8)自來水沖洗2分鐘； (9)蘇木素染色5-10分鐘； (10)自來水沖洗2分鐘； (11)1%鹽酸酒精分化，0.5%氨水返藍； (12)自來水流水沖洗10分鐘； (13)1%伊紅染色I分鐘； (14)80%酒精、95%酒精、100%酒精梯度脫水，環保透明脫蠟液2分鐘，每步至少2次； (15)環保型中性快干膠封片； 對部分無法診斷的蠟塊，或科研需要的細胞懸液制成的蠟塊，根據診斷需求進行免疫組織化染色，免疫組織化染色步驟如下: (1)切片前先將環保透明脫蠟液放入58°C恒溫干燥箱預熱； (2)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第一次脫蠟2分鐘； (3)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第二次脫蠟2分鐘； (4)將切片浸入環保透明脫蠟液中進行第三次脫蠟2分鐘； (5)無水乙醇洗去環保透明脫蠟液； (6)95%乙醇沖洗2分鐘； (7)80%乙醇沖洗2分鐘； (8)自來水沖洗2分鐘； (9)蒸餾水I分鐘； (10)抗原修復，按第一抗體選擇不同的修復液及修復方式； (11)蒸餾水I分鐘，至少3次； (12)3%過氧化氫滅活內源性過氧化物酶； (13)蒸餾水I分鐘，至少2次，pH7.2的磷酸緩沖液，至少I次； (14)滴加第一抗體；(15)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次； (16)滴加第二抗體； (17)pH7.2的磷酸緩沖液，2分鐘，至少3次； (18)DAB顯色，自來水流水沖洗10分鐘， (19)蘇木素淺染核后，吹風機吹干，經環保透明脫蠟液透明，中性快干膠封片。
6.按照權利要求1-4任一項所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫療設備有限公司生產。
7.按照權利要求5所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環保型生物合成劑的主要成分為生物合成劑及脫水劑，由廣東省佛山市南海鈞鎰醫療設備有限公司生產。
8.按照權利要求5所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環保透明脫蠟液為無錫市江源實業技貿公司生產。
9.按照權利要求7所述的組織細胞標本石蠟包埋的制作方法，其特征在于，所述環保透明脫蠟液為無錫市 江源實業技貿公司生產。
【文檔編號】G01N1/36GK103940658SQ201410141939
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】趙潔, 付海洋 申請人:青島大學醫學院附屬醫院
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
