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一種檢測(cè)生物柴油中甘油酯和游離脂肪酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種測(cè)定生物柴油中甘油酯和游離脂肪酸含量的方法，所述方法為：將生物柴油樣品稀釋，以鋁箔片基層析硅膠板作薄層色譜分離，以體積比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑，用碘蒸汽顯色，分離后，將顯色的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游離脂肪酸的斑點(diǎn)裁下，裁下的斑點(diǎn)與三甲基氫氧化硫的甲醇溶液裝入樣品杯，裝入裂解器中，將裂解器置于GC進(jìn)樣口處，當(dāng)裂解器溫度達(dá)到300～450℃時(shí)進(jìn)樣，氣相色譜檢測(cè)，獲得待測(cè)樣品的氣相色譜圖，與甘油一酯、二酯、三酯和游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照計(jì)算得到待測(cè)樣品中甘油酯和游離脂肪酸的含量。本方法操作簡(jiǎn)單，定量準(zhǔn)確，信息全面，對(duì)生物柴油的質(zhì)量控制具有十分深遠(yuǎn)的意義。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)生物柴油中甘油醒和游離脂肋酸含量的方法 (-)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)生物柴油中甘油醋和游離脂肪酸含量的方法，通過(guò)薄層色譜 結(jié)合熱輔助水解甲基化氣相色譜的方法快速準(zhǔn)確地測(cè)定生物柴油中殘留的甘油醋和游離 脂肪酸的含量。 (二）技術(shù)背景
[0002] 生物柴油是目前新興起來(lái)的一種無(wú)毒，可再生和降解的綠色能源，主要是利用未 加工過(guò)的或者使用過(guò)的植物油W及動(dòng)物脂肪通過(guò)不同的化學(xué)反應(yīng)制備而來(lái)，現(xiàn)已成為一 種優(yōu)質(zhì)的石油柴油替代品。然而由于反應(yīng)不完全，常常殘留少量的甘油一醋、甘油二醋、 甘油H醋W及游離脂肪酸等副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響生物柴油的品質(zhì)，從而影響發(fā)動(dòng)機(jī)的性能。 歐盟標(biāo)準(zhǔn)巧N 14214:2008)規(guī)定生物柴油中的甘油一醋、甘油二醋、甘油H醋和游離脂肪 酸的含量分別不高于0.8%，0.2%，0.2%(m/m)和0.5mgK0H/g，根據(jù)生物柴油的密度 (0. 86-0. 90g/mL，取 0. 87g/mL)轉(zhuǎn)換成質(zhì)量體積濃度，約為 7010g/mL，1740g/mL，1740g/mL 和 2194g/mL。
[0003] 目前最常用于檢測(cè)生物柴油中殘留甘油醋和脂肪酸的技術(shù)有化C-FID，HPLC-ELSD 和高溫GC等。上述方法往往存在定量不準(zhǔn)確，信息不全面、靈敏度不高或者儀器損傷大等 缺點(diǎn)，從而限制了其廣泛應(yīng)用。 (H)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種新穎的薄層色譜結(jié)合熱輔助水解甲基化的方法同時(shí)檢 測(cè)生物柴油中的殘留甘油醋和游離脂肪酸的含量，并對(duì)多個(gè)生物柴油樣品的甘油醋和游離 脂肪酸進(jìn)行定性定量分析，評(píng)價(jià)其質(zhì)量控制情況。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 一種檢測(cè)生物柴油中甘油醋和游離脂肪酸含量的方法，所述甘油醋包括甘油一 醋、甘油二醋和甘油H醋，所述方法包括W下步驟：
[0007] (1)制作甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)曲線：W硬脂酸甘油一醋作為甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)品，硬脂酸 甘油一醋用己酸己醋溶解，配成不同濃度的硬脂酸甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取1 y L點(diǎn)樣，在 鉛鉛片基層析娃膠板上進(jìn)行薄層色譜分離，W體積比90:10:2的正己焼、己酸己醋、甲酸混 合溶劑為展開(kāi)劑，當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到鉛鉛片基層析娃膠板的另一端后，將鉛鉛片基層析娃 膠板拿出，待溶劑揮干后，用楓蒸汽顯色，顯色后，將顯色的甘油一醋斑點(diǎn)裁下，裁下的斑點(diǎn) 裝入樣品杯，并加入3 y L的0. 2mol/L H甲基氨氧化硫的甲醇溶液，將上述樣品杯固定于 進(jìn)樣桿后，裝入裂解器中，將裂解器置于氣相色譜儀進(jìn)樣口處，當(dāng)裂解器溫度達(dá)到300? 45CTC時(shí)進(jìn)樣，氣相色譜檢測(cè)，獲得硬脂酸甘油一醋在線甲基化反應(yīng)所得的硬脂酸甲醋的氣 相色譜圖；W氣相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，硬脂酸甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)， 繪制硬脂酸甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即為甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0008] 似W硬脂酸甘油二醋作為甘油二醋的標(biāo)準(zhǔn)品，硬脂酸甘油H醋作為甘油H醋的 標(biāo)準(zhǔn)品，油酸作為游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述步驟（I)操作，分別獲得甘油二醋、甘油 H醋和游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0009] (3)待測(cè)生物柴油樣品用己酸己醋稀釋2?6倍，取1 y L點(diǎn)樣，在鉛鉛片基層析 娃膠板上進(jìn)行薄層色譜分離，W體積比90:10:2的正己焼、己酸己醋、甲酸混合溶劑為展開(kāi) 齊U，當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到鉛鉛片基層析娃膠板的另一端后，將鉛鉛片基層析娃膠板拿出，待溶 劑揮干后，用楓蒸汽顯色，對(duì)比步驟（1)、（2)中各標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)顯色位置，將顯色的甘油一 醋、甘油二醋、甘油H醋和游離脂肪酸的斑點(diǎn)分別裁下，裁下的斑點(diǎn)各自裝入樣品杯，并加 入3 y L的0. 2mol/L H甲基氨氧化硫的甲醇溶液，將各樣品杯分別固定于進(jìn)樣桿后，裝入裂 解器中，將裂解器置于氣相色譜儀進(jìn)樣口處，按照步驟（1)的條件進(jìn)樣并進(jìn)行氣相色譜檢 巧||，分別獲得甘油一醋、甘油二醋、甘油H醋和游離脂肪酸在線甲基化反應(yīng)所得的脂肪酸甲 醋混合物的氣相色譜圖；將待測(cè)樣品的甘油一醋的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲醋峰的總峰 面積與甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待測(cè)樣品中甘油一醋的含量；將待測(cè)樣品的甘油 二醋的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲醋峰的總峰面積與甘油二醋標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待 測(cè)樣品中甘油二醋的含量；將待測(cè)樣品的甘油H醋的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲醋峰的總 峰面積與甘油H醋標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待測(cè)樣品中甘油H醋的含量；將待測(cè)樣品的游 離脂肪酸的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲醋峰的總峰面積與游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算 獲得待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量。
[0010] 本發(fā)明方法中，將樣品杯固定于進(jìn)樣桿后，裝入裂解器中，將裂解器置于氣相色譜 儀進(jìn)樣口處，當(dāng)裂解器溫度達(dá)到300?45CTC時(shí)進(jìn)樣，此時(shí)樣品杯掉入爐也，斑點(diǎn)上的物質(zhì) 瞬間熱脫附，并與H甲基氨氧化硫發(fā)生在線甲基化作用生成相應(yīng)的脂肪酸甲醋產(chǎn)物，經(jīng)載 氣帶入氣相色譜進(jìn)樣口，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。因此得到的氣相色譜圖實(shí)際均為脂肪酸甲醋 的色譜圖。
[0011] 本發(fā)明中所述在線甲基化主要有兩大作用，一是實(shí)現(xiàn)在線樣品提取，在高溫作用 下，吸附于娃膠上的待測(cè)物瞬間熱脫附；二是脫附后的樣品與H甲基氨氧化硫衍生化試劑 在高溫條件下發(fā)生甲基化反應(yīng)生成相應(yīng)的甲醋類產(chǎn)物，便于直接帶入氣相色譜分析。該技 術(shù)無(wú)需復(fù)雜前處理，與繁瑣的傳統(tǒng)離線提取及衍生化方法相比大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。
[0012] 另外，為了檢測(cè)的簡(jiǎn)單化，W硬脂酸甘油一醋作為甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)品、硬脂酸甘油 二醋作為甘油二醋的標(biāo)準(zhǔn)品，硬脂酸甘油H醋作為甘油H醋的標(biāo)準(zhǔn)品，油酸作為游離脂肪 酸的標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)際生物柴油樣品中甘油一醋為混合物，包括蹤擱酸甘油一醋、硬脂酸甘油一 醋、油酸甘油一醋、亞油酸甘油一醋、亞麻酸甘油一醋中的一種或兩種W上，經(jīng)薄層色譜分 離、在線甲基化氣相色譜檢測(cè)后，氣相色譜圖中有多個(gè)脂肪酸甲醋的峰，包括蹤擱酸甲醋、 硬脂酸甲醋、油酸甲醋、亞油酸甲醋、亞麻酸甲醋等。為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，將所有脂肪酸甲醋峰均 作為硬脂酸甲醋，取所有脂肪酸甲醋峰的總峰面積與硬脂酸甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì) 算甘油一醋混合物的總含量。該樣的簡(jiǎn)化主要基于各脂肪酸在氣相色譜分析中的矯正因子 是相似的原則，該處硬脂酸一醋也可看作內(nèi)標(biāo)物。甘油二醋、甘油H醋做同樣簡(jiǎn)化處理。游 離脂肪酸也為化合物，包括蹤擱酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或兩種W上，本 發(fā)明W油酸作為游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)為所有游離脂肪酸的總含量。
[0013] 本發(fā)明運(yùn)用薄層色譜技術(shù)對(duì)生物柴油中的脂肪酸甲醋、游離脂肪酸、甘油一醋、甘 油二醋、甘油H醋進(jìn)行分離和定性，顯色后將相應(yīng)的斑點(diǎn)剪下，在裂解器中進(jìn)行熱脫附同時(shí) 在有機(jī)堿的作用下衍生為相應(yīng)的脂肪酸甲醋，直接帶入氣相色譜檢測(cè)，獲得相應(yīng)的氣相色 譜圖。根據(jù)色譜軟件獲得相應(yīng)的脂肪酸甲醋峰的總面積，并且運(yùn)用歸一化法確定其中各類 脂肪酸類型的相對(duì)含量。再分別對(duì)甘油一醋，二醋、H醋和游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行同樣的 薄層色譜-熱輔助水解甲基化氣相色譜分析，W各自峰面積為縱坐標(biāo)，W各自標(biāo)準(zhǔn)品濃度 為橫坐標(biāo)分別制作各甘油醋標(biāo)準(zhǔn)曲線和游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的氣相色譜譜圖及 甘油醋標(biāo)準(zhǔn)曲線和/或游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣品中甘油醋和/或游離脂肪酸的含 量。
[0014] 本發(fā)明薄層色譜中使用的鉛鉛片基層析娃膠板，采用鉛鉛片基是為了便于分離后 裁下斑點(diǎn)，進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。
[0015] 本發(fā)明步驟（3)中，待測(cè)生物柴油樣品用己酸己醋稀釋2?6倍，根據(jù)實(shí)際樣品情 況適當(dāng)選擇W滿足標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍；所述點(diǎn)樣一般用平頭點(diǎn)樣針，采用20 y L液相注 射器，點(diǎn)樣量為IuL。
[0016] 進(jìn)一步，本發(fā)明步驟（1)、（2)、（3)中，氣相色譜條件為；色譜柱為強(qiáng)極性柱，柱箱： 初溫50。W 5?IOC /min (優(yōu)選IOC )速率升到230。保持5?15mim(優(yōu)選IOmin); 進(jìn)樣口溫度為23(TC?30(TC (優(yōu)選25(TC )，檢測(cè)器溫度為23(TC?30(TC (優(yōu)選25(TC )， 分流比30:1 ;載氣為氮?dú)猓魉?. OmL/min ;
[0017] 裂解器條件為：裂解爐溫度：300?45(TC (優(yōu)選35(TC );裂解器與氣相色譜儀接 口溫度 30(TC ;
[0018] 進(jìn)一步，優(yōu)選氣相色譜條件為；色譜柱為強(qiáng)極性柱，柱箱：初溫5(TC，W 1(TC /min 速率升到23(TC，保持IOmin ;進(jìn)樣口溫度為25(TC，檢測(cè)器溫度為25(TC，分流比30:1 ;載氣 為氮?dú)猓魉?. 0血/min ;
[0019] 裂解器條件優(yōu)選為；裂解爐溫度：35(TC ;裂解器與氣相色譜儀接口溫度30(TC。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在；本發(fā)明應(yīng)用薄層色譜-熱輔助 水解甲基化氣相色譜法，可W同時(shí)測(cè)定食品中殘留甘油醋和游離脂肪酸含量，準(zhǔn)確，方便， 沒(méi)有繁瑣的前處理過(guò)程，不僅能測(cè)定生物柴油中各甘油醋和游離脂肪酸的含量，同時(shí)可W 有效地檢測(cè)各甘油醋和游離脂肪酸中的脂肪酸組成。
[0021] 本發(fā)明充分結(jié)合薄層色譜和熱輔助水解甲基化氣相色譜兩種方法，生物柴油經(jīng)鉛 鉛片基層析娃膠板分離后，將相應(yīng)的甘油醋和游離脂肪酸的斑點(diǎn)剪下，分別與衍生化試劑 一起置于裂解器中進(jìn)行熱脫附同時(shí)衍生為相應(yīng)的脂肪酸甲醋，供氣相色譜分析。該技術(shù)具 有操作簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)對(duì)生物柴油中的甘油醋和游離脂肪酸進(jìn) 行檢測(cè)，并且得到相應(yīng)的脂肪酸組分分布情況。 (四）

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為實(shí)施例1中各標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)生物柴油樣品1中的薄層色譜分離圖。
[0023] 圖2為實(shí)施例1中待測(cè)生物柴油樣品1中甘油一醋、甘油二醋、甘油H醋和游離脂 肪酸的氣相色譜圖。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0025] 硬脂酸甘油一醋、硬脂酸甘油二醋、硬脂酸甘油H醋、硬脂酸甲醋、油酸標(biāo)準(zhǔn)品和 H甲基氨氧化硫（TM甜，0. 2mol/L甲醇溶液）均購(gòu)自于百靈威公司；正己焼、己酸己醋、甲酸 為分析純均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司。
[0026] GF254鉛鉛片基層析娃膠板購(gòu)自默克公司（德國(guó)）。液相進(jìn)樣針購(gòu)自上海高錯(cuò)工 貿(mào)有限公司。
[0027] 5個(gè)生物柴油樣品均由浙江工業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院提供。樣品1、3、4、5分別由菜 巧油、蹤擱油、地溝油和大豆油制備而成，樣品2原料信息不詳。
[0028] 美國(guó)Hiermo Finnigan Trace DSQ的氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-M巧；美國(guó)Varian CP-3800氣相色譜儀，配氨火焰檢測(cè)器（FID);日本化ontier PY-2020iD雙擊式縱型微型爐 裂解器。
[0029] 實(shí)施例1 ;薄層色譜結(jié)合熱輔助水解甲基化氣相色譜法對(duì)待測(cè)生物柴油（樣品1) 中各脂肪酸和甘油醋的檢測(cè)
[0030] (1)薄層色譜的分離過(guò)程：先將IOOy L的待測(cè)生物柴油樣品（樣品1)溶于500 y L 的己酸己醋中，稀釋6倍。混合均勻后，用液相平頭針抽取1 y L，點(diǎn)在IOcm的鉛鉛片基層析 娃膠板的一端，在展開(kāi)劑正己焼/己酸己醋/甲酸巧0/10/2)中展開(kāi)。當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到 薄層板的另一端后，將薄層板拿出，待溶劑揮干后，用楓蒸汽顯色。此時(shí)，薄層上的待測(cè)分析 物呈褐色或黃色斑點(diǎn)，薄層色譜圖見(jiàn)圖1最右側(cè)，圖1左側(cè)為脂肪酸甲醋、甘油一醋、二醋、 H醋和游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品的薄層色譜圖，即硬脂酸甲醋、硬脂酸甘油一醋、硬脂酸甘油二 醋、硬脂酸甘油H醋、油酸的薄層色譜圖，分離展開(kāi)條件同樣品1。根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)顯 色位置，判定樣品1的薄層色譜圖中分離的各斑點(diǎn)分別為甘油一醋、二醋、H醋和游離脂肪 酸。
[0031] (2)在線水解甲基化氣相色譜分析過(guò)程：將上述顯色的甘油一醋、甘油二醋、游離 脂肪酸和甘油H醋的斑點(diǎn)分別剪下。分別將待測(cè)斑點(diǎn)和3 y L的TM甜裝入樣品杯，固定于進(jìn) 樣桿后，裝入安裝在GC進(jìn)樣口上方的裂解器，此時(shí)樣品處于室溫。待裂解器溫度達(dá)到35CTC 時(shí)，按下進(jìn)樣按鈕，樣品杯掉入爐也，待測(cè)分析物瞬間熱脫附，同時(shí)在TM甜作用下發(fā)生甲基 化反應(yīng)生成相應(yīng)的脂肪酸甲醋混合物，由載氣帶入GC進(jìn)樣口，進(jìn)行GC分析，分別獲得待測(cè) 樣品甘油一醋、甘油二醋、游離脂肪酸和甘油H醋的氣相色譜圖。見(jiàn)圖2。在譜圖中可W觀 察到每張圖中都有C16:0, C18:0, C18:l，C18:2四種脂肪酸甲醋的峰，未檢測(cè)到C18:3或 C14:0等其他脂肪酸甲醋。分別計(jì)算甘油一醋、甘油二醋、游離脂肪酸和甘油H醋的氣相色 譜譜圖中四個(gè)脂肪酸甲醋峰面積的總和，代入步驟（3)的標(biāo)準(zhǔn)曲線即得該生物柴油中甘油 一醋、甘油二醋、游離脂肪酸和甘油H醋的含量。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作詳見(jiàn)步驟（3)
[0032] 氣相色譜儀為Varian CP-3800氣相色譜儀，色譜柱為強(qiáng)極性柱，DB-23石英毛細(xì) 管柱（30mX0. 25mm i. d. XO. 25ym膜厚，50%氯丙基-50%甲基聚娃氧焼，美國(guó)），柱箱： 初溫5(TC，W 1(TC /min速率升到23CTC，保持IOmin ;進(jìn)樣口溫度為25(TC，檢測(cè)器溫度為 25(TC，分流比30:1 ;載氣為氮?dú)猓魉?.0血/min ;
[0033] 裂解器條件為：裂解爐溫度：35CTC ;裂解器與氣相色譜儀接口溫度30(TC。
[0034] (3)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[00巧]甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；準(zhǔn)確稱取硬脂酸甘油一醋0. Olg置于2mL容量瓶中， 用己酸己醋定容，配成濃度為5000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用己酸己醋稀釋成300、1000、2000、 3000、4000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4°C的冰箱內(nèi)。分別對(duì)濃度為300、1000、2000、3000、4000、 5000mg/L硬脂酸甘油一醋標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上述薄層色譜分離結(jié)合熱輔助水解甲基化氣相色 譜分析，操作同步驟（1)、（2)，獲得硬脂酸甲醋的氣相色譜圖，然后W氣相色譜圖中的峰面 積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制硬脂酸甘油一醋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。
[0036] 甘油二醋標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；準(zhǔn)確稱取硬脂酸甘油二醋0. Olg置于2mL容量瓶中， 用己酸己醋定容，配成濃度為5000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用己酸己醋稀釋成300、1000、2000、 3000、4000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4°C的冰箱內(nèi)。分別對(duì)濃度為300、1000、2000、3000、 4000、5000mg/L硬脂酸甘油二醋標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行所述的薄層色譜分離結(jié)合熱輔助水解甲基化 氣相色譜分析，操作同步驟（1)、（2)，獲得硬脂酸甲醋的的氣相色譜圖，然后W氣相色譜圖 的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制硬脂酸甘油二醋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。
[0037] 甘油H醋標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；準(zhǔn)確稱取硬脂酸甘油H醋0. Olg置于2mL容量瓶中， 用己酸己醋定容，配成濃度為5000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用己酸己醋稀釋成300、1000、2000、 3000、4000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4°C的冰箱內(nèi)。分別對(duì)濃度為300、1000、2000、3000、4000、 5000mg/L硬脂酸甘油H醋標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行所述的薄層色譜分離結(jié)合熱輔助水解甲基化氣相 色譜分析，操作同步驟（1)、（2)，獲得硬脂酸甲醋的氣相色譜圖，然后W氣相色譜圖的峰面 積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制硬脂酸甘油H醋的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。
[0038] 游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；準(zhǔn)確稱取油酸0. Olg置于2mL容量瓶中，用己酸己 醋定容，配成濃度為5000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用己酸己醋稀釋成300、1000、2000、3000、 4000mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，儲(chǔ)存于4 °C的冰箱內(nèi)。分別對(duì)濃度為300、1000、2000、3000、4000、 5000mg/L油酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行所述的薄層色譜分離結(jié)合熱輔助水解甲基化氣相色譜分析，操 作同步驟（1)、（2)，獲得氣相色譜圖，然后W氣相色譜圖中油酸甲醋的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo) 準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制油酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。見(jiàn)表1。
[0039] 通過(guò)色譜軟件得待測(cè)生物柴油樣品（樣品1)中甘油一醋、甘油二醋、甘油H醋和 游離脂肪酸的峰面積分別為4097,14624, 7691，22615,代入線性方程后求得含量再乘W稀 釋倍數(shù)6,計(jì)算出待測(cè)生物柴油樣品（樣品1)中甘油一醋的含量為10161mg/l，甘油二醋的 含量為12293mg/L，甘油H醋的含量為6774mg/L，游離脂肪酸的含量為28409mg/L。均超出 歐盟標(biāo)準(zhǔn)。
[0040] 考察了本法的線性關(guān)系、檢出限：分別配制濃度為300-5000mg/L的硬脂酸甘油一 醋、二醋、H醋和油酸，其他操作同實(shí)例1，表明在300-5000mg/L的濃度范圍內(nèi)各甘油醋和 游離脂肪酸具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9766-0. 9950之間。按照信噪比（S/N)大 于3來(lái)確定被分析物檢出限，得到的各檢出限在100-200mg/L之間，足W滿足歐盟標(biāo)準(zhǔn)中各 限量要求的檢測(cè)。見(jiàn)表1。
[0041] 表 1
[0042] 線性關(guān)系、檢出限
[0043]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)生物柴油中甘油酯和游離脂肪酸含量的方法，其特征在于所述方法包括以 下步驟： (1) 制作甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)曲線：以硬脂酸甘油一酯作為甘油一酯的標(biāo)準(zhǔn)品，硬脂酸甘油 一酯用乙酸乙酯溶解，配成不同濃度的硬脂酸甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，各取lyL點(diǎn)樣，在鋁箔 片基層析硅膠板上進(jìn)行薄層色譜分離，以體積比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶 劑為展開(kāi)劑，當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到鋁箔片基層析硅膠板的另一端后，將鋁箔片基層析硅膠板 拿出，待溶劑揮干后，用碘蒸汽顯色，顯色后，將顯色的甘油一酯斑點(diǎn)裁下，裁下的斑點(diǎn)裝入 樣品杯，并加入3 μ L的0. 2mol/L三甲基氫氧化硫的甲醇溶液，將上述樣品杯固定于進(jìn)樣桿 后，裝入裂解器中，將裂解器置于氣相色譜儀進(jìn)樣口處，當(dāng)裂解器溫度達(dá)到300?450°C時(shí) 進(jìn)樣，氣相色譜檢測(cè)，獲得硬脂酸甘油一酯在線甲基化反應(yīng)所得的硬脂酸甲酯的氣相色譜 圖；以氣相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，硬脂酸甘油一酯的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制硬 脂酸甘油一酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，即為甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)曲線； (2) 以硬脂酸甘油二酯作為甘油二酯的標(biāo)準(zhǔn)品，硬脂酸甘油三酯作為甘油三酯的標(biāo)準(zhǔn) 品，油酸作為游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)品，按照上述步驟（1)操作，分別獲得甘油二酯、甘油三酯 和游離脂肪酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3) 待測(cè)生物柴油樣品用乙酸乙酯稀釋2?6倍，取1 μ L點(diǎn)樣，在鋁箔片基層析硅膠 板上進(jìn)行薄層色譜分離，以體積比90:10:2的正己烷、乙酸乙酯、甲酸混合溶劑為展開(kāi)劑， 當(dāng)溶劑前沿?cái)U(kuò)展到鋁箔片基層析硅膠板的另一端后，將鋁箔片基層析硅膠板拿出，待溶劑 揮干后，用碘蒸汽顯色，對(duì)比步驟（1)、（2)中各標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)顯色位置，將顯色的甘油一 酯、甘油二酯、甘油三酯和游離脂肪酸的斑點(diǎn)分別裁下，裁下的斑點(diǎn)各自裝入樣品杯，并加 入3 μ L的0. 2mol/L三甲基氫氧化硫的甲醇溶液，將各樣品杯分別固定于進(jìn)樣桿后，裝入裂 解器中，將裂解器置于氣相色譜儀進(jìn)樣口處，按照步驟（1)的條件進(jìn)樣并進(jìn)行氣相色譜檢 測(cè)，分別獲得甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯和游離脂肪酸在線甲基化反應(yīng)所得的脂肪酸甲 酯混合物的氣相色譜圖；將待測(cè)樣品的甘油一酯的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲酯峰的總峰 面積與甘油一酯標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待測(cè)樣品中甘油一酯的含量；將待測(cè)樣品的甘油 二酯的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲酯峰的總峰面積與甘油二酯標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待 測(cè)樣品中甘油二酯的含量；將待測(cè)樣品的甘油三酯的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲酯峰的總 峰面積與甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算獲得待測(cè)樣品中甘油三酯的含量；將待測(cè)樣品的游 離脂肪酸的氣相色譜圖中所有脂肪酸甲酯峰的總峰面積與游離脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照，計(jì)算 獲得待測(cè)樣品中游離脂肪酸的含量。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中，氣相色譜條件為：色譜柱為 強(qiáng)極性柱，柱箱：初溫50°C，以5?10°C /min速率升到230°C，保持5?15mim ;進(jìn)樣口溫 度為230°C?300°C，檢測(cè)器溫度為230°C?300°C，分流比30:1 ;載氣為氮?dú)猓魉?. OmL/ min ;裂解器條件為：裂解爐溫度：300?450°C ;裂解器與氣相色譜儀接口溫度300°C。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟（1)中，氣相色譜條件為：色譜柱為 強(qiáng)極性柱，柱箱：初溫50°C，以10°C /min速率升到230°C，保持lOmin ;進(jìn)樣口溫度為250°C， 檢測(cè)器溫度為250°C，分流比30:1 ;載氣為氮?dú)猓魉?. OmL/min ; 裂解器條件為：裂解爐溫度：350°C ;裂解器與氣相色譜儀接口溫度300°C。
【文檔編號(hào)】G01N30/90GK104237447SQ201410437595
【公開(kāi)日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月29日
【發(fā)明者】王麗麗, 張佩佩, 孫楊, 黃忠平, 黃翌磊, 潘再法 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)